Les vies dependents i independents del receptor d'hidrocarburs d'aril medien els efectes anti-envelliment de la curcumina Part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

2.2.6. Cultiu de CE humà primari

L'EC primari humà (Lonza, Colònia, Alemanya) es va cultivar en un medi basal endotelial complet (EBM) (Lonza, Colònia, Alemanya) complementat amb 1 ug/mL d'hidrocortisona, 12ug/mL d'extracte de cervell boví, 50ug/ ml gentamicina, factor de creixement epidèrmic humà de 10 ng/mL i sèrum de vedella fetal al 10 per cent (o/v) a 37 graus i 5 per cent de CO, fins al tercer pas. Després del despreniment amb un 0, 05 per cent (o/o) de tripsina/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Alemanya), les cèl·lules es van cultivar en plats de cultiu de 6 cm o plaques de cultiu de 6 pous durant almenys 18 h abans de la transfecció o tractament.

Feu clic aquí per saber-ne més

2.2.7. Transfecció transitòria d'EC

Les cèl·lules es van transfectar tal com es va descriure anteriorment [65]. En resum, EC es va transfectar utilitzant SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons les instruccions del fabricant. La sobreexpressió o la derrota d'AhR es va aconseguir després de 24 o 48 h, respectivament. L'eficiència de transfecció en sobreexpressió va ser d'aproximadament el 40 per cent.

2.2.8. Assaig de ferides per rascades d'EC

Per investigar la capacitat migratòria de l'EC, es van realitzar assajos de ferides de rascada tal com es va descriure anteriorment [66]. En detall, les ferides es van col·locar en una monocapa cel·lular amb un rascador cel·lular al llarg d'una línia de traça. Després de la lesió, es van eliminar les cèl·lules no adherides mitjançant un rentat suau.extracte de salsa de cistancheEl tractament amb curcumina es va realitzar directament després de fixar la ferida. El cur-cumin es va dissoldre en DMSO i es va utilitzar a la concentració final de 7, 5 uM. La migració de la CE es va quantificar tenyint les cèl·lules amb 5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanya) en PBS durant 5 minuts després que les cèl·lules s'haguessin fixat. amb un 4 per cent (v/v) de paraformaldehid durant 15 min a temperatura ambient. Les imatges es van prendre amb un microscopi fluorescent Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanya)) mitjançant una 200-ampliació. Les cèl·lules migrades a la ferida des de la línia de traça es van comptar automàticament mitjançant la funció d'anàlisi de partícules d'Imatge] 1.52a ] 67I després de separar els nuclis superposats.

Cistanche pot anti-envelliment

2.2.9. Immunotinció d'EC

L'EC es va fixar amb un 4 per cent (o / v) de paraformaldehid durant 15 min a temperatura ambient. Després de la permeabilització i el bloqueig en 0, 3 per cent (o/o) Triton-X 100 i 3 per cent (o/u) de sèrum de cabra normal en PBS, les cèl·lules es van incubar amb un anticòs de conill contra AhR (1:100, Abcam, Cambridge, Regne Unit) o ​​Nrf2 (clon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Alemanya) diluït en sèrum de cabra normal a l'1 per cent (o/v) en PBS durant la nit a 4ºC. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS i incubat amb una IgG anti-conill de cabra acoblada a Alexa 594-(1:500, Invitrogen, Darmstadt, Alemanya) durant 1 h a temperatura ambient.tija de cistanchePer a la tinció d'actina, les cèl·lules es van incubar amb Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Alemanya) durant 20 min a temperatura ambient. Els nuclis es van tacar amb 0, 5 ug/mL de DAPI en PBS durant 5 min a temperatura ambient i les cèl·lules es van muntar amb ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Alemanya). Les imatges fluorescents es van prendre amb un microscopi fluorescent Zeiss AxioVision Observer D1, amb un augment de 400 × o 200 ×.

2.2.10. qPCR a les cèl·lules

L'ARN cel·lular total es va aïllar combinant la lisi en TRIzolTM amb el processament aigües avall mitjançant el RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Alemanya)) segons les instruccions del fabricant. La síntesi d'ADNc es va realitzar mitjançant el kit de transcripció inversa QuantiTect9 （Qiagen （Hilden, Alemanya）) amb 1 ug d'ARN segons les instruccions del fabricant. Els nivells de transcripció relatius es van determinar mitjançant PCR mitjançant el 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix i un termociclador Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden, Alemanya)). La transcripció de la proteïna ribosòmica L32 (rpl32) es va utilitzar com a referència i l'expressió relativa es va calcular pel mètode AC [68]. Es van utilitzar els següents parells d'imprimadors que abasten introns: capital (número d'accés del gen NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen número d'accés NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(número d'accés del gen NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTGGGTTC-3';rpl32(número d'accés del gen NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCACGCAC{{ 41}}'.

2.3.Ratolins

2.3.1.Línies de ratolí i cria

Dona de 8-12-setmanes ("jove") i 18-mes d'edat ("vell") amb deficiència de B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; referit fins aquí, els ratolins AHR-KO) es van criar com heterozigotes a la instal·lació d'animals de la UITA. Per al control es van utilitzar els companys de tipus salvatge. Els ratolins es van criar i es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens en un cicle de llum-foscor de 12/12 hores i van rebre menjar estàndard (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Alemanya) ad libitum. 2.3.2.qPCR en ratolins

L'ARN total es va aïllar dels teixits d'òrgans de tres ratolins amb deficiència de WT i tres AHR amb TriZol [. A continuació, es van transcriure inversament 400 ng d'ARN mitjançant la transcriptasa inversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA) i cebadors hexàmers aleatoris. Els nivells d'expressió gènica es van mesurar per duplicat per a cada teixit de ratolí en un Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemanya), en un volum final de 15 μL, que contenia 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Alemanya), 1 uM de cada imprimació. ,1,5 μL d'ADNc i d'aigua lliure de RNasa. Les eficiències de l'encebador es van situar entre el 90 i el 146 per cent. Vegeu la taula S2 per a les seqüències i les eficiències d'imprimació. Els nivells d'expressió es van calibrar a l'expressió de RPS6 com a gen domèstic a la mateixa mostra mitjançant el {{ 14}}Mètode TC [69].

2.4.Anàlisis In Silico

Modelatge d'homologia del CeAhR LBD

El model estructural de C. elegans AhR LBD (residus 267-372) es va generar mitjançant modelització d'homologia. Les estructures de raigs X dels dominis PASB dels membres homòlegs de la família bHLH-PAS que comparteixen la identitat de seqüència més alta (al voltant del 20 per cent) amb el CeAhR PASB es van utilitzar com a plantilles: els cicles de sortida locomotora circadiana kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), el proteïna 3 que conté el domini PAS neuronal (NPAS3, PDB:5SY7), els factors induïbles per la hipòxia 20 (HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) i lo (HIFlo, PDB:4H6J). El model s'ha obtingut amb MODELLER[70-72].Beneficis i efectes secundaris de cistanche tubulosaEl model òptim es va seleccionar entre els 10 generats, basant-se en la millor PUNTUACIÓ DOPE [73]. La qualitat dels models es va avaluar mitjançant PROCHECK [74]. DSSPcont va atribuir estructures secundàries [75]. La cavitat d'unió dins dels LBD modelats es va caracteritzar mitjançant el servidor CASTp[76]. La visualització dels models es va aconseguir mitjançant PYMOL[77].

2.5.Anàlisi estadística

Llevat que s'indiqui el contrari, les anàlisis estadístiques es van realitzar a GraphPad Prism (versió 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EUA). Per als assajos de vida i salut, es va fer una anàlisi estadística mitjançant OASIS[53]. L'anàlisi estadística de les dades de microarrays es va realitzar a R (R Foundation (Viena, Àustria)). Els diagrames de caixa es van crear a GraphPad Prism (versió 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EUA) i mostren la mediana (línia), 25-75è percentil (quadre) i 10-90è percentil (bigotis).

3. Resultats

3.1. La curcumina promou la salut d'una manera dependent i independent de l'AhR

La pèrdua d'ahr-1 afavoreix la salut i la vida útil de C.elegans en condicions basals[14] i afecta negativament els trets relacionats amb l'edat en resposta als moduladors AhR de mamífers, com el benzo[a]pirè (BaP), UVB. llum i microbiota [25]. Els polifenols dietètics, com el cur-cumin, formen un grup important de moduladors AhR de mamífers amb efectes a favor de la longevitat a C. elegans [78,79] i, per tant, hem investigat l'efecte d'allargament de la vida útil de la curcumina per a la seva ahr-1 dependència. La curcumina va allargar de manera reproducible i significativament la vida i la salut de C. elegans d'una manera depenent de l'ahr-1-(figura 1A, B). Anteriorment, hem demostrat que la pèrdua d'ahr-1 també allarga la vida útil en els models de la malaltia de Huntington i la malaltia de Parkinson, amb sobreexpressió muscular de poliglutamina (polyQ40) i -sinucleïna (-syn) propensas a l'agregació, respectivament, al mateix temps augmentant el seu contingut d'agregats proteics [25]. Curiosament, el tractament amb curcumina va augmentar el nombre d'agregats de poliQ40 i -syn en la mateixa mesura que la pèrdua de funció ahr-7 (figura 1C). La curcumina també va promoure la vida útil i la capacitat locomotòria en aquests models de malaltia (figura 1DE), però els efectes de la pèrdua d'ahr-1 i la suplementació de curcumina eren additius al PolyQbackground (figura 1D), revelant funcions de protecció independents de l'AHR-1- de curcumina almenys en aquest fons compromès.

Figura 1. La curcumina promou la salut d'una manera dependent i independent de l'AHR-1-. Corbes de vida útil (A) i salut (B) dels nematodes en pes i ahr-1 tractats amb DMSO o curcumina. Les corbes de supervivència mostren dades agrupades de 290-300 cucs/condició en 5 experiments. Prova estadística: prova de rang de registre, # significació vs. DMSO,*significació vs.wt, valor de Bonferronip<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 Media els efectes anti-envelliment de la curcumina i l'esgotament d'ahr-1

A la recerca de possibles efectors de curcumina depenent de l'ahr-1-avall, vam adoptar enfocaments orientats i imparcials. Vam examinar l'expressió dels gens diana AhR clàssics de mamífers i ens vam centrar en els gens Cyp, ja que la curcumina altera l'expressió de CyplA1 i CyplB1 a les cèl·lules de mamífers [80, 81]. Tanmateix, la quantificació de 47 cyps diferents a C.elegans mitjançant PCR en temps real semicuantitativa (qPCR) va revelar que només el cyp-13B1 estava regulat significativament per l'esgotament d'ahr-1 o per la curcumina. de manera dependent de l'ahr-1-(figura S1A-B), mentre que els altres tres cyps (és a dir, cyp-13A5, cyp-13A8 i cyp-42A1) eren augmentat per la curcumina només en absència d'ahr-1(Figura S1). Aquestes dades, juntament amb altres treballs [25, 82], suggereixen que probablement els cyps no són els principals objectius de CeAhR. Això també està recolzat per la nostra anàlisi transcriptòmica en mutants de tipus salvatge i ahr-1. De fet, d'acord amb el paper de l'AHR-1 en la determinació neuronal [37,38,40,41], els canvis d'expressió gènica entre els mutants de tipus salvatge i ahr-1 van mostrar un enriquiment en els processos relacionats amb el desenvolupament neuronal. i diferenciació i no hi ha canvis importants en els gens de desintoxicació clàssics (figura 2A). Anàlisi de qPCR d'alguns dels gens més regulats a l'alça i a la baixa entre ahr-1(jul45) i de tipus salvatge (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec{-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)majoritàriament van confirmar la seva dependència ahr-1-en condicions basals (figura 2B), però ni UVB [25] ni la curcumina (figura 2C) van afectar significativament l'expressió d'aquests gens. Ens vam preguntar si els canvis d'expressió en aquests gens es conserven evolutivament i vam avaluar la seva expressió en diferents teixits (és a dir, cervell, fetge, intestí i sang) de tipus salvatge i 8- i 18-mes d'edat. AhR KO ratolins. Alguns gens van mostrar una tendència a augmentar l'expressió en ratolins joves (homòlegs d'atf{-2) o vells (homòlegs de lpr{-4/5) d'una manera específica del teixit, però ni un patró evident ni canvis conservats. observat (figura S2). Aquests resultats reflecteixen possibles diferències específiques d'espècie o activitat transcripcional AhR depenent del teixit en mamífers ignorades per l'anàlisi transcriptòmica d'animals sencers a C. elegans. Un examen exhaustiu dels gens més expressats de manera diferencial entre C. elegans de tipus salvatge i ahr-1(jul45) va revelar que l'expressió de molts d'aquests gens es veu afectada en C.elegans durant l'envelliment i pels moduladors AhR de mamífers alimentaris ( per exemple, quercetina i resveratrol)[25], cosa que suggereix un paper de l'AHR-1 en l'expressió gènica modulada per polifenols. D'acord amb aquest escenari, les dades de microarrays van mostrar que la majoria dels gens expressats de manera diferent amb el tractament amb curcumina estaven regulats de manera depenent de l'ahr-1-(figura 2D; taula 1).extracte de cistanche tubulosaDels 47 gens alterats per la curcumina en el tipus salvatge (43 amunt i 4 a la baixa), només 5 també van ser induïts per la curcumina en ahr-1(ju145). Entre els gens regulats per la curcumina de manera dependent de l'AHR-1-es trobaven els enzims de fase Il i, curiosament, alguns d'ells (ugt-9 i ugt{-29) estaven regulats en la mateixa direcció per la curcumina. o per pèrdua d'ahr-1 (taula 1). Així, vam comprovar la seva expressió i la dels ugts addicionals (ugt-45 i ugt{-57) que s'expressaven de manera diferent quan s'aplicava una anàlisi estadística menys restrictiva no corregida per a comparacions múltiples. Dels gens examinats, ugt-45 es va incrementar en ahr-1(ijul45) i pel tractament amb curcumina (figura 3A, B). També vam observar canvis en l'expressió d'alguns gens de desintoxicació entre els de tipus salvatge i Ratolins AhR KO de manera dependent del teixit. L'expressió diferencial d'aquests gens era més alta al cervell, on Ugt2a3 (ugt-9 i ugt-29 a C.elegans) va baixar- i Hpgds (gst-4 a C. elegans) estava regulat a l'alça (figura S3A). No hi va haver cap canvi en l'expressió de cap dels gens provats a les mostres de fetge de ratolins (figura S3B). D'acord amb les dades de C,elegans, l'homòleg murí ugt-45 Ugt3a2 va mostrar una tendència a la sobreexpressió en el intestins de ratolins Ahr KO (figura S3C). En particular, ugt-45 RNAi va prevenir els efectes beneficiosos sobre la vida i la salut promoguts per la curcumina (figura 3C, D) o l'esgotament d'ahr-1 (figura 3E, F), cosa que indica que les dues intervencions poden dependre de la senyalització aigües avall modulada conjuntament per provocar la seva activitat anti-envelliment.

Figura 2. Els gens regulats de manera diferenciada per la curcumina es regulen principalment d'una manera dependent de l'ahr-1-. (A) Enriquiment de l'ontologia gènica (GO) per a processos biològics després de la fusió del terme GO en ahr-1 vs. (B, C) L'expressió dels gens regulats a la baixa i a l'alça més forts entre wt i ahr-1 [25] es va avaluar mitjançant qPCR en wt vs.ahr-1 (B) i DMSO-vs . nematodes tractats amb curcumina (C). Els diagrames de caixa mostren dades de 3 experiments. L'expressió es mostra en relació al pes tractat amb DMSO (línia discontínua). Prova estadística:1-forma ANOVA amb la prova de comparacions múltiples de Tukey,*valor-p<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

La figura 3.ugt-45 és necessària per a l'extensió de la vida útil dels mutants de curcumina i ahr-1. (A, B) L'expressió gènica es va avaluar mitjançant qPCR en pes vs.ahr-1(A) i nematodes en pes tractats amb DMSO vs. curcumina (B). Els diagrames de caixa mostren dades de 3 experiments. L'expressió es mostra en relació al pes tractat amb DMSO (indicat com una línia discontínua). Prova estadística: 2-Way ANOVA amb la prova de comparacions múltiples de Sidak, *valor p<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 i curcumina protegeixen de manera independent contra l'estrès oxidatiu

Les propietats beneficioses dels polifenols sovint s'atribueixen a la seva capacitat de protegir contra les espècies reactives d'oxigen (ROS)|83,84]. Com que AhR està implicat en processos mediats per l'estrès oxidatiu [85-87], ens vam preguntar si la curcumina pot afectar la fisiologia dels animals mitjançant respostes antioxidants regulades per AhR. Vam observar que els mutants ahr-1 produeixen més ROS mitocondrials (mt) i tenen un potencial de membrana mitocondrial reduït (figura 4A, B), dos paràmetres que es correlacionen amb la longevitat [88,89]. Tot i que coherent amb el paradigma de la mitohormesi, ahr-1(jul45) produeix una mica més de mtROS i viu més temps, aquests animals eren més sensibles a l'estrès oxidatiu que el tipus salvatge. Concretament, els efectes perjudicials induïts per la juglona i l'H2O2 sobre els salts, la motilitat i la supervivència dels animals van ser significativament més forts en ahr-1(jul45) en comparació amb el tipus salvatge (figura 4C-F). Aquestes dades suggereixen que l'esgotament de l'AHR-1 té efectes metics motors beneficiosos en condicions basals, mentre que la seva presència és necessària per a la protecció de l'estrès oxidatiu, desacoblant així dos paràmetres relacionats amb l'edat que sovint es correlacionen, és a dir, la vida útil i la resistència a l'estrès. En canvi, la curcumina va millorar significativament la resistència a H, O i juglona tant en mutants de tipus salvatge com en ahr-1 (figura 4E, F), cosa que suggereix que la curcumina provoca una resposta antioxidant independent de ahr-1-. D'acord amb la regulació desacoblada de la vida útil i la resistència a l'estrès oxidatiu, el silenciament d'ugt-45 no va afectar la sensibilitat a l'estrès oxidatiu ni per als mutants ahr-1 ni per als animals tractats amb curcumina (figura 4G).ressenyes de cistanche tubulosaPer tant, la curcumina té efectes a favor de la longevitat mitjançant ahr-1 i ugt-45, però protegeix contra l'estrès oxidatiu mitjançant mecanismes independents de ahr-1-.

3.4. Nrf2/SKN-1 media els efectes independents d'AhR de la curcumina

Per avaluar encara més la diafonia AhR-curcumina en característiques addicionals relacionades amb l'edat, vam mesurar la capacitat migratòria de l'EC primària humana, un segell distintiu de la funcionalitat del vaixell, que disminueix amb l'edat [90] i es redueix per l'activació d'AhR [14]. D'acord amb l'activitat anti-envelliment de la supressió d'ahr-1 i de la curcumina, la sobreexpressió d'AhR es va inhibir significativament, mentre que la curcumina va augmentar, la capacitat migratòria de l'EC humà primària (figura 5A). Cal destacar que la inducció de la capacitat migratòria per part de la curcumina era comparable a les cèl·lules transfectades amb vectors buits o d'expressió AhR (figura 5A). Tanmateix, la migració de cèl·lules tractades amb curcumina es va reduir significativament per la sobreexpressió AhR: la curcumina indueix a les cèl·lules buides transfectades amb vectors fins a 60 cèl·lules migrades per camp d'alta potència, mentre que a les cèl·lules que sobreexpressen AhR només fins a 25 cèl·lules per camp d'alta potència (figura 5A). Aquestes dades suggereixen que l'efecte pro-migratori de la curcumina està modulat per mecanismes independents de AhR, però possiblement també per una reducció de l'activitat AhR. A continuació, vam determinar la distribució intracel·lular d'AhR i l'expressió de cVplal en EC humà tractat amb curcumina, la curcumina no va afectar la translocació nuclear d'AhR (figura 5B) ni l'expressió ciplal (figura 5C). A la recerca de vies modulades per la curcumina de manera independent de AhR, vam tornar als perfils transcriptòmics dels nematodes per trobar factors de transcripció que regulen gens significativament modulats per la pèrdua d'ahr-1 o pel tractament amb curcumina en animals de tipus salvatge (taula 1). ). Aquesta recerca in silico va identificar el factor de transcripció redox SKN-1, l'ortòleg de Nrf2 humà (factor 2 relacionat amb el factor nuclear eritroide 2-), l'activació del qual per la curcumina [91] s'informa sovint com un possible mediador de la seva activitat antioxidant [92,93]. En conseqüència, el prototip de gen dependent de C.elegans Nrf2/SKN-1-, gst-4, està sobreexpressat en el mutant alhr{-1 [25] i induït per la curcumina en tipus salvatge i encara més. en mutants ahr-1 (figura 5D). A més, la curcumina va augmentar l'estabilització i la translocació nuclear de Nrf2 a la CE humana primària (figura 5E) i va induir l'expressió de la superòxid dismutasa de manganès (Sod2), un gen objectiu clàssic de Nrf2, a les cèl·lules transfectades amb un vector buit o en cèl·lules en què AhR és silenciat per shRNA (figura 5F). La manca d'inducció de Sod2 per AhR shRNA a la CE pot ser deguda a una reducció parcial (50 per cent) de l'expressió (figura S3D), que pot no ser suficient per activar l'activació de Nrf2 o del factor de transcripció addicional (TF), que , a C.elegans, podria concórrer a la inducció de la gst-4 [94]sobre l'esgotament complet de AhR. Curiosament, Hpgds, un homòleg de C.elegans gst-4, va augmentar significativament al cervell dels ratolins AhR KO (figura S3A), però no és un objectiu de Nrf2. Una altra evidència de la possible senyalització independent de Nrf2/SKN-1 activada per l'esgotament de l'ahr-1 és que l'activació de la gst{-4 per la curcumina està completament suprimida per l'ARN-7 de la pell a la C.elegans de tipus salvatge, mentre que els mutants ahr-1 encara indueixen gst-4 malgrat l'esgotament-1 de la pell (figura 5G, H). Tanmateix, l'ARNi-1 de la pell va reduir la resistència a l'estrès oxidatiu tant en el tipus salvatge com en l'ahr-1 (ju145) (figura 5I). Inesperadament, el silenciament de la pell -1 no va afectar la resistència a la juglona dels animals tractats amb curcumina (figura 5I). Les nostres dades revelen un escenari complex en què la curcumina promou diferents característiques anti-envelliment que es basen en una senyalització depenent de AhR o independent d'AhR, però depenent de Nrf2/SKN-1-(i addicional).

Figura 4. L'AHR-1 i la curcumina protegeixen de manera independent contra l'estrès oxidatiu. (A) Imatges representatives (esquerra) i quantificació de la intensitat DSRed (dreta) en nematodes en pes o ahr{3}} tenyits amb MitoSOX. Els diagrames de caixa mostren dades agrupades de 129-135 cucs/condicions en 3 experiments. (B) El potencial de la membrana mitocondrial es va avaluar mitjançant la tinció de TRME en nematodes d'edats indicades. Es presenten imatges representatives (esquerra) i la quantificació de la fluorescència TMRE (dreta). Els diagrames de caixa mostren dades agrupades de 3 experiments. (C, D) Activitat de bombament faríngia (C) i motilitat (D) dels mutants wt i ahr-1 després del tractament amb H2O2. Els diagrames de caixa mostren dades agrupades de 39-54(C) o 35-36 cucs/condició (D) en 3-4experiments.*p-valor<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Figura 5. La curcumina activa Nrf2/SKN-1 independentment de l'assaig de ferides de raspadura AhR (A) en EC primari humà tractat amb curcumina (cur) o DMSO transfectat amb un vector buit (EV) o un vector d'expressió per AhR humà. Panell superior: imatges representatives; la línia discontínua representa l'inici de la migració. Barra d'escala: 100 um. Panell inferior: quantificació; Els diagrames de caixa mostren les dades dels 4-6experiments. Prova estadística:1-manera ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. La curcumina i els pro-oxidants mostren efectes oposats sobre l'activitat AHR-1

D'acord amb l'efecte anti-envelliment de la reducció de l'expressió/activitat AhR, les nostres dades suggereixen que la curcumina pot allargar la vida útil de C.elegans suprimint les vies regulades AHR-1-a través de la reducció de l'expressió/activitat de l'AHR-1 o actuant. en vies comunes de senyalització aigües avall. Per tant, vam intentar quantificar l'activitat AHR-1 a C.elegans, però nombrosos intents d'avaluar l'expressió AHR-1 i la localització subcel·lular mitjançant anticossos (contra AhR de mamífers o anticossos personalitzats contra CeAhR) o etiquetats fluorescentment. els periodistes (OP562, UL1709, ZG93) no van donar proves significatives. Tenint en compte que l'AHR-1 s'uneix als XREs in vitro [35], vam pensar que utilitzem l'expressió gènica impulsada per XRE com a lectura de l'activitat AHR-1. Per tant, ens vam dirigir a les cèl·lules Cos7 derivades del mico, que no expressen AhR endògens i, per tant, no mostren activitat AhR endògena [95,96] i es poden aprofitar per controlar la inducció de luciferasa impulsada per XRE com a lectura d'AHR-1 activitat (Larigot et al.; presentat juntament amb aquest estudi). Quan les cèl·lules Cos7 es van co-transfectar amb vectors que expressaven C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha{-1 i un promotor que conté XRE acoblat a luciferasa del gen CYPIA1 humà [64] AHR{ {27}} va mostrar poca activitat en condicions basals (tractades amb vehicles). Cal destacar que el tractament amb curcumina o altres nutracèutics que afavoreixen l'envelliment saludable en C.elegans, com la luteïna [97] i el resveratrol [98,99], va suprimir significativament l'activitat AHR-1 (figura 6A-C). En canvi, BaP i leflunomida, activadors AhR coneguts en mamífers, no van afectar l'activitat AHR-1 (figura 6A, B) a les concentracions que vam utilitzar. En particular, l'activitat AHR-1 es va abolir a les cèl·lules Cos7 transfectades amb un vector que expressava l'al·lel ahr-1(jul45) en lloc de l'al·lel de tipus salvatge (figura 6A-C), cosa que suggereix que jul45 és un veritable al·lel. al·lel de pèrdua de funció i que la intensitat de la luciferasa mesurada es deu a l'AHR funcional-1.

Aleshores vam intentar investigar si la curcumina redueix l'activitat de l'AHR-1 mitjançant la unió directa o la modulació indirecta. Fins ara, no s'ha identificat cap lligand de C.elegans AHR-1, i com que no hi ha informació disponible sobre el seu LBD, hem realitzat una anàlisi in silico per caracteritzar-lo. Les dues isoformes AHR-1, la i 1b, estaven alineades i, tot i que de longitud diferent, la seva seqüència de domini PASB és idèntica. A continuació, aquesta seqüència es va alinear al domini PASB de Drosophila melanogaster i als de dos AhR de vertebrats per als quals es van generar anteriorment models estructurals, és a dir, el ratolí (Mus musculus)[100] i el peix zebra (Danio rerio)[101](Figura). 6D). L'alineació va mostrar diferències clares entre espècies amb la principal peculiaritat dels invertebrats que presenten supressions de seqüències a la regió més variable del domini PAS, corresponent a la regió flexible, inclòs el paquet helicoïdal (hèlix C , D , E) i els bucles curts que connecten aquests elements (figura 6D,E). Aquestes supressions podrien reduir l'espai disponible a la cavitat d'unió d'aquests AhR. A continuació, vam generar un model 3D de l'AHR-1 PASB mitjançant model d'homologia. Aquest model presenta el plec PAS típic, però amb una hèlix Do més curta en comparació amb altres AhR. Tanmateix, la cavitat interna té algunes peculiaritats; conté més residus hidrofòbics i està truncat per la meitat per unes cadenes laterals internes. En particular, H365 i H274 estan enfrontats i podrien formar un enllaç d'hidrogen al mig de la cavitat; a més, les cadenes laterals Y332, L363 i L302 podrien obstruir la cavitat, reduint l'espai intern disponible per als lligands (figura 6E). És probable que aquesta petita i truncada cavitat no permeti la unió de grans lligands (per exemple, TCDDo curcumina). De manera similar al model estructural AHR-1, un model del peix zebra zfAhRla va demostrar que la cavitat LBD està truncada en comparació amb els paràlegs d'unió a TCDD zfAhR1b i zfAhR2 [101]. Els lligands petits i flexibles, com la leflunomida, s'uneixen i activen el zfAhRla, però la concentració de leflunomida que vam provar no va activar AHR -1 al nostre sistema de cèl·lules Cos7 (figura 6B). Aleshores ens vam preguntar si les mutacions en els aminoàcids responsables de la petita cavitat del LBD podrien permetre que els lligands clàssics activin CeAhR. El residu CeAhR L363 (figura 6D) correspon a A375 a mAhRb-I i V375 a Madrid, i aquest residu té un impacte important en la unió del lligand [102]. De la mateixa manera, T386 de zfAhRla (figura 6D), que coincideix amb A375 en mAhRb-1 i A386 en zfAhR1b i zfAhR2, contribueix a la manca d'unió de TCDD de zfAhRla i, quan es muta a l'alanina, també es restableix la sensibilitat de Y29DDH. introduït [101]. L'aminoàcid Y296 ja és una histidina a C.elegans(H274). Així, només vam mutar la leucina a la posició L363 del vector CeAhR a una alanina (L363A) (figura 6D, E indicada per una fletxa). A més, vam mutar la histidina propera a la posició H365 a glutamina (H365Q), que és Q377 en ratolins (figura 6D, E indicada per una fletxa) ja que probablement forma un enllaç d'hidrogen amb H274 i podria contribuir a la petita cavitat d'AHR { {49}} (Figura 6E). A continuació, vam provar si els lligands AhR dels mamífers afecten l'activitat AHR-1 quan L363 i H365 estan mutats. Tanmateix, aquestes alteracions, en lloc de restaurar la resposta als lligands xenobiòtics com en el peix zebra [101], van abolir fins i tot l'activitat basal AHR-1, similar a l'al·lel ju145 (figura 6F). Aquests resultats mostren diferències clares entre els LBD de C.elegans i el peix zebra, però mostren que el LBD és fonamental per a l'activitat basal AHR-1. Juntament amb estudis anteriors [35,38,82], els nostres resultats suggereixen que és poc probable que l'AHR-1 estigui implicada en la resposta clàssica de transactivació induïda per xenobiòtics, que per tant pot no ser rellevant per a la regulació de l'ahr-1- envelliment fisiològic. En canvi, els compostos derivats de les plantes poden exercir efectes conservats almenys en part mitjançant la supressió de les vies modulades AHR-1-. El nostre model 3D suggereix que la curcumina no modula l'activitat AHR-1 unint el seu LBD. Així, la supressió de l'activitat AHR-1 per part de la curcumina podria ser deguda al seu efecte antioxidant. D'acord amb aquesta possibilitat, i amb l'augment de la sensibilitat dels mutants de C.elegans ahr-1 a l'estrès oxidatiu, vam trobar que l'activitat AHR-1 augmenta efectivament amb agents inductors de ROS. És a dir, les cèl·lules Cos7 tractades amb la rotenona pro-oxidant van mostrar una activitat AhR augmentada quan es van transfectar amb C.elegans o AhR murí, però no quan es van transfectar amb l'al·lel jul45 o l'al·lel amb mutacions LBD (figura 6G, H).

En general, mentre que l'activació de CeAhR protegeix contra l'estrès oxidatiu a principis de la vida, la seva expressió disminuïda contraresta l'envelliment i media l'efecte anti-envelliment beneficiós de la curcumina (figura 7). Així, la curcumina pot ajudar a equilibrar l'activació del TF redox d'una manera depenent del context i del temps i afavorir la supressió de AhR directament a través del seu efecte antioxidant i/o mitjançant l'activació de Nrf2/SKN-1 (o un altre TF), que pot ser simultàniament. mediar l'activitat anti-envelliment de la curcumina.

Figura 6. La curcumina i els prooxidants tenen efectes oposats sobre l'activitat AHR-1. (AC) Avaluació de l'activitat AHR-1 després del tractament amb els compostos indicats en cèl·lules Cos7 transfectades amb wt AHR-1(wt) o AHR-1 amb la mutació puntual ju145 (ju145) i AHA-1 així com una luciferasa induïble per XRE. Els diagrames de caixa mostren les dades dels 3-5experiments.* el valor p<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Figura 7. Model proposat de la via de senyalització AHR-1 en la resposta de C.elegan a pro-i antioxidants. En condicions "normals" (tauler mitjà), l'AHR-1 s'activa per ROS intracel·lular. Això condueix a l'eliminació de les chaperones de l'AHR citosòlica-1 i la posterior translocació nuclear de l'AHR-1. Al nucli, l'AHR-1 forma un heterodímer amb el translocador nuclear AHR (AHA{). {7}}) i s'uneix als XRE dels gens objectiu, que al seu torn condueix a la reducció dels nivells intracel·lulars de ROS. En aquestes condicions, la pèrdua de la funció ahr-1 augmenta la vida útil. En presència d'antioxidants (tauler esquerre), les concentracions intracel·lulars de ROS són baixes, provocant que l'AHR-1 resideixi al citoplasma, unit pels seus cofactors. La inhibició de l'activitat basal AHR-1 augmenta la vida útil. En presència de pro-oxidants (tauler dret) l'AHR-1 s'activa per un ROS excessiu, que provoca la seva translocació nuclear, la formació d'heterodímers AHR{-1-AHA-1 i l'inici de transcripció del gen objectiu. En l'ahr-1 KO, la disminució de la desintoxicació de ROS a través dels gens objectiu induïts per AHR-1- condueix a una acumulació de ROS i fa que l'ahr-1 KO sigui susceptible.

4. Discussió

L'AhR es va descobrir originalment en mamífers per la seva activitat de resposta xenobiòtica induïda a la unió de tòxics ambientals o lligands endògens, però també existeixen moduladors que no depenen de la unió de lligands, però són molt menys investigats. C.elegans representa un organisme model únic per investigar les activitats AhR independentment de la seva resposta xenobiòtica clàssica, ja que CeAhR no s'uneix als prototips de lligands AhR [35,39]. Utilitzant aquest model, vam identificar una funció conservada evolutivament per a AhR en el procés d'envelliment [14] i vam demostrar que alguns dels moduladors AhR de mamífers (és a dir, bacteris, Bal i UVB) afecten els paràmetres d'envelliment mitjançant AHR-1 en un manera depenent del context [25]. Aquí, vam seguir les nostres troballes anteriors amb una investigació més mecanicista de les característiques d'envelliment regulades per AhR entre espècies per la curcumina polifenol dietètica. Les nostres anàlisis combinades in vivo, in vitro i in silico van revelar un escenari nou i complex: mentre que la curcumina promou característiques anti-envelliment en nematodes i EC primària humana almenys en part de manera dependent de AhR, els seus efectes antioxidants en ambdues espècies depenen. en mecanismes independents d'AhR però principalment dependents de Nrf2/SKN-1.

Vam demostrar per primera vegada que la curcumina retardava l'envelliment fisiològic de C.elegans d'una manera dependent de l'AHR-1-. A la recerca de possibles efectors de la curcumina depenent de l'ahr-1-avall, vam utilitzar enfocaments orientats i imparcials i vam trobar que la majoria dels gens regulats de manera diferent en el tractament amb curcumina es regulen de manera que depenent de l'AHR-1-. A més, molts d'aquests gens mostraven un patró d'expressió similar en animals esgotats i tractats amb curcumina-1-AHR, cosa que suggereix que la curcumina està afavorint l'extensió de la vida útil mitjançant la supressió de l'activitat AHR-1. Sorprenentment, ni l'anàlisi dirigit ni l'anàlisi transcriptòmica van indicar un paper important per als gens clàssics d'objectius AhR, com ara les tasses, que en canvi es va trobar que s'expressaven en gran mesura a les neurones (Larigot et al.; presentat juntament amb aquest estudi). Curiosament, aquestes troballes poden indicar que la transcriptòmica d'animals sencers pot emmascarar els efectes neuronals específics de l'AhR, en aquest cas específic mitjançant gens cps. Hem trobat que entre els gens expressats de manera diferent, molts pertanyen a enzims de desintoxicació de fase II, com ara l'intestí-45, que es va incrementar tant per l'esgotament d'ahr-1 (i al cervell dels ratolins AhR KO) i tractament amb curcumina per mediar l'extensió de la seva vida útil. En canvi, el tractament amb curcumina i l'esgotament de l'ahr-1 van augmentar l'expressió d'un altre enzim de desintoxicació de fase II, GST-4, mitjançant diferents mecanismes: el primer es basa en, mentre que el segon és principalment independent de, Nrf2/ SKN-1, un TF redox clàssic que indueix GST-4 a l'estrès oxidatiu a C.elegans [103]. A més, mentre que la curcumina indueix respostes dependents de Nrf2/SKN-1-en C.elegans (expressió GST-4) i EC primària humana (expressió Sod2 i capacitat migratòria), també protegeix C.eleans contra l'estrès oxidatiu en d'una manera independent-1-SKN. A C.elegans, la curcumina no pot allargar la vida útil als mutants-1(zu67) [104] de la pell molt malalta, mentre que la GST-4 es pot induir d'una manera independent de SKN-1- mitjançant la senyalització EGF [94] i la diafonia entre la via EGF i l'AhR es va informar en mamífers [105].

Curiosament, i contràriament a la soca de tipus salvatge, vam observar un efecte independent de l'AHR-1-de la curcumina sobre la salut en models de nematodes per a la malaltia de Huntington i la de Parkinson, respectivament. En aquestes soques, el tractament amb curcumina va augmentar el nombre d'agregats de proteïnes en la mateixa mesura que la deficiència d'AHR-1, cosa que indica un efecte protector de l'agregació de proteïnes en si i/o l'activació de la curcumina de les vies que protegeixen contra l'agregació de proteïnes independentment d'a/ h-1 esgotament. La influència de la curcumina en l'agregació de proteïnes és controvertida: es va demostrar que inhibeix la formació de fibril·les, però també s'uneix a espècies prefibril·lars/oligomèriques de proteïnes amiloidogèniques, accelerant així la seva agregació i reduint la neurotoxicitat general [106]. Cal destacar que la cafeïna, que també protegeix contra les característiques de l'envelliment cardiovascular [66,107], també prevé la paràlisi induïda per A sense disminuir els agregats A, però mitjançant l'activació de la via protectora Nrf2/SKN-1-depenent [108]. Serà important avaluar si l'efecte protector induït per la curcumina o l'esgotament total-1 en els models de malaltia de C.elegans està mediat per mecanismes que promouen l'eliminació d'espècies oligomèriques/prefibril·lars en agregats menys tòxics i/o per l'activació d'altres mecanismes, com Nrf2/SKN-1, que poden protegir simultàniament contra la proteotoxicitat. Cal destacar que els enzims de desintoxicació poden contenir tant XRE com ARE (elements sensibles als antioxidants), i s'ha descrit una interacció entre la senyalització regulada Nrf2/ARE i AhR/XRE [109]. Per tant, serà interessant aclarir com la curcumina promou els seus diferents efectes beneficiosos contra l'envelliment mitjançant l'equilibri entre la senyalització regulada per Nrf2 i AhR.

Els nostres enfocaments combinats van demostrar que la curcumina inhibeix l'activitat AHR-1. En mamífers, es va suggerir que l'efecte inhibidor de l'AhR de la curcumina està mediat per la unió directa de LBD [110] o la inhibició de la proteïna cinasa C que fosforila AhR [79]. Un altre estudi va indicar que l'activitat transcripcional de l'AhR depèn de l'estat redox cel·lular i de l'estructura de la cromatina, que estan influenciades per la curcumina[111]. Tot i que l'AHR-1 no s'uneix al TCDD, s'uneix a XRE in vitro[36], però els estudis sistemàtics, que aborden el potencial dels hidrocarburs poliaromàtics o altres lligands AhR de mamífers per modular l'AHR-1, falten principalment a causa de la manca d'eines adequades per avaluar-ho. Els nostres estudis intenten omplir aquest buit i, aprofitant les cèl·lules Cos7 que expressen AHR-1 juntament amb assaigs de luciferasa (Larigot et al.; presentats juntament amb aquest estudi) i el modelatge in silico de C. elegans LBD, van revelar que la curcumina suprimeix l'AHR. -1 activitat, però probablement no mitjançant l'enllaç LBD directa. L'assaig in vitro utilitzat en el nostre estudi va confirmar que CeAhR no s'activa mitjançant la senyalització clàssica de xenobiòtics. Tanmateix, no revelaria activitats a causa de la unió de AhR a seqüències d'ADN que no siguin les XRE "clàssiques" que es troben a CYP1A1, com ara la XRE sensible a polifenol (quercetina) que es troba a PON1 [112,113]. La immunostaining en l'EC primària humana també argumenta en contra de la curcumina que indueix la translocació nuclear AhR, que, juntament amb l'efecte promotor de la capacitat migratòria a les cèl·lules que sobreexpressen AhR, també pot indicar que la curcumina suprimeix l'activitat AhR.

Proposem que l'efecte inhibidor de la curcumina, en lloc de dependre de la unió AhR, implica la seva capacitat antioxidant, que de fet pot estar associada o fins i tot dependre de l'activació de Nrf2/SKN-1. L'AhR de mamífers és activat per ROS mitjançant una modificació oxidativa independent de LBD [85], però les nostres dades mostren que la inducció de l'activitat AHR-1 per part de la rotenona pro-oxidant requereix la LBD. Un mecanisme indirecte d'activació de AhR mediada per ROS és la formació del potent lligand AhR FICZ [114]. No obstant això, FICZ és una gran molècula plana que, segons el nostre model in silico, no encaixaria amb l'AHR-1 LBD. Encara que el mecanisme exacte pel qual l'activitat AHR-1 és promoguda per ROS i inhibida per la curcumina (ja sigui mitjançant l'extinció directa de ROS o indirectament mitjançant l'activació de Nrf2 o altres gens reguladors d'antioxidants) encara està per establir-se, això està fortament recolzat pel nostre resultats: AHR-1 s'activa per la rotenona, i els mutants ahr-1 mostren més mtROS, un potencial de membrana mitocondrial reduït i són més sensibles a H, O i juglona, ​​així com a UVB i BaP [25] , ambdós produeixen ROS[115,116]. En aquest context, és interessant observar que els mutants ahr-1 mostren una alteració lleu de les funcions mitocondrials, que s'assemblen a les de la mitohormesi [117. Això suggereix que tot l'esgotament-1 (i la possible curcumina mitjançant la inhibició de l'AHR-1) pot promoure la salut a través d'un estrès mitocondrial lleu, que se sap que allarga la vida útil de C.elegan mitjançant gens de desintoxicació modulats de manera similar a l'altre{18}}. {20}} mutants [118,119]. A més, si Nrf2/SKN-1 i els mitocondris tenen un paper en la modulació de l'activitat AHR-1 durant el tractament amb curcumina és una possibilitat interessant que encara està per validar.

En general, aprofitant les múltiples característiques que ofereix el nematode C.elegans per a estudis in vivo, suggerim que la funció ancestral de l'AhR podria estar en la regulació dels enzims de fase ll relacionats amb les respostes antioxidants més que no pas xenobiòtiques. Al contrari dels efectes perjudicials induïts per alts nivells de ROS, els efectes beneficiosos promoguts per la deficiència d'AhR poden estar mediats per un estrès mitocondrial lleu i/o una producció lleu de ROS (mitohormesi), que també depenen de Nrf2/SKN -1. També proporcionem proves sòlides de la interacció entre la curcumina i l'AhR. La inhibició de la curcumina de la senyalització AhR es conserva evolutivament i és probable que no estigui mediada per la unió a AhR LBD, sinó per les propietats d'eliminació de ROS de la curcumina o per l'activació de Nrf2/SKN-1. La via de senyalització Nrf2 pot ser activada per la curcumina de diferents maneres [91]. Finalment, les nostres dades van mostrar que la curcumina promou efectes anti-envelliment també de manera independent tant en C.elegans (augment de l'expressió GST-4 i resistència a l'estrès oxidatiu) com de l'EC primari humà (augment de l'expressió de Sod2 i capacitat migratòria). ), que també podria explicar els efectes additius de la curcumina i la pèrdua de la funció AHR-1 sobre la salut dels animals que expressen poliQ.

5. Conclusions

En conclusió, mitjançant una combinació original d'enfocaments in silico, vitro i in vivo, vam demostrar que, mentre que l'activació de CeAhR protegeix contra l'estrès oxidatiu a principis de la vida, la seva expressió disminuïda contraresta l'envelliment i media l'efecte anti-envelliment beneficiós de la curcumina (Figura 7). . Així, la curcumina pot ajudar a equilibrar l'activitat dels diferents factors de transcripció implicats en les respostes de desintoxicació/antioxidants (suprimir AhR i activar Nrf2) en condicions en què aquests s'alteren (augmenta AhR i disminueix Nrf2/SKN-1), com ara l'envelliment o trastorns associats a l'edat. El nostre treball afegeix un nivell més de complexitat a les ja vastes activitats multifuncionals i específiques del context d'AhR, amb importants repercussions en la salut de l'organisme i la vida útil. A més, obre la porta a estudis addicionals, utilitzant el sistema de nematodes per descobrir i investigar les funcions ancestrals de l'AhR, que és menys probable que s'identifiquin en mamífers.

Aquest article està extret de Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants