Golgi Alpha1,2-mannosidasa IA promou la degradació eficient de NKCC2 associada al reticle endoplasmàtic

Resum

Les mutacions del cotransportador de Na-K-2Cl NKCC2 del ronyó situat apicalment causen la síndrome de Bartter de tipus I, un trastorn renal que amenaça la vida. Abans vam demostrar que el transport des de l'ER representa la fase limitant en el viatge de NKCC2 a la superfície cel·lular. No obstant això, se sap molt poc sobre els components de control de qualitat ER específics de NKCC2 i els seus mutants que causen malalties. Aquí, informem de la identificació de Golgi alfa1, 2-mannosidasa IA (ManIA) com a nou soci d'unió de la forma immadura de NKCC2. La interacció de ManIA amb NKCC2 té lloc principalment a la xarxa cis-Golgi. La coexpressió de ManIA va disminuir l'abundància total de proteïnes NKCC2, mentre que la derrota de ManIA va produir l'efecte contrari. És important destacar que la coexpressió de ManIA va tenir un efecte més profund sobre els mutants de plegament NKCC2. L'assaig de persecució de cicloheximida va demostrar que a les cèl·lules que sobreexpressen ManIA, l'estabilitat i la maduració de NKCC2 es veuen molt dificultades. La supressió de la regió citoplasmàtica de ManIA va atenuar la seva interacció amb NKCC2 i va inhibir el seu efecte sobre la maduració del cotransportador. Les reduccions induïdes per ManIA en l'expressió de NKCC2 van ser compensades per l'inhibidor del proteasoma MG132. De la mateixa manera, el tractament amb kifunensina va reduir molt l'efecte ManIA, cosa que suggereix fortament que la retallada de la manosa està implicada en l'ERAD millorat del cotransportador. A més, la privació de ManIA del seu domini catalític va abolir completament el seu efecte sobre NKCC2. En resum, les nostres dades demostren la presència d'una via ERAD mediada per ManIA a les cèl·lules renals que promou la retenció i la degradació de les proteïnes NKCC2 mal plegades. Suggereixen un model pel qual Golgi ManIA contribueix a l'ERAD de NKCC2, promovent la retenció, el reciclatge i l'ERAD de proteïnes malplegades que inicialment escapen de la vigilància del control de qualitat de proteïnes dins de l'ER.

Paraules clau

ronyó; NKCC2; control de qualitat de proteïnes; ERAD; Golgi; alfa1,2-mannosidasa IA; membrana; tràfic; síndrome de Bartter; hipertensió

Feu clic aquí per conèixer els avantatges de Cistanche

Introducció

El balanç de sodi i la seva regulació per part del ronyó, mitjançant la regulació del volum extracel·lular, és un determinant clau del control de la pressió arterial (PA) a llarg termini, com ho il·lustren les síndromes monogèniques rares que afecten la manipulació de la sal renal i que alteren considerablement la PA [1, 2]. De fet, tot i que diversos factors contribueixen a la patogènesi i al manteniment de l'elevació de la pressió arterial, es creu que els mecanismes renals tenen un paper primordial, tal com va plantejar inicialment Guyton [1]. L'extremitat ascendent gruixuda del bucle de Henle (TAL) del ronyó és responsable de reabsorbir el 20-30 per cent de la càrrega filtrada de NaCl [3-5]. A nivell molecular, la reabsorció de TAL Na-Cl està mediada pel cotransportador luminal de Na-K-2Cl NKCC2 [5]. Com a conseqüència, la funció de transport de NKCC2 té un impacte considerable en l'excreció final de sal urinària, influint posteriorment en l'equilibri de sodi sanguini a llarg termini [3,5]. En conseqüència, les variacions heretades del cotransportador i/o dels seus reguladors afecten la PA en humans [3, 6–8]. De fet, la inactivació de NKCC2 causa la síndrome de Bartter tipus I (BS1), una malaltia renal que amenaça la vida amb una PA baixa juntament amb anomalies electròlits [9], mentre que l'activitat millorada del cotransportador s'ha relacionat amb una PA alta [2,10– 13]. A més, en diversos models animals d'hipertensió sensible a la sal [14,15], l'expressió de la proteïna NKCC2 augmenta i contribueix al desenvolupament de la hipertensió. A més del seu paper en l'homeòstasi de la BP, l'activitat de NKCC2 també és essencial per a la regulació de l'equilibri hídric [5,16]. En suport d'aquesta noció, la inactivació de NKCC2 en pacients amb BS1 i BS5 provoca el desenvolupament de poliúria severa [7,8,17]. A més, la capacitat de concentració urinària deteriorada dels ronyons envellits s'atribueix, almenys en part, al nivell reduït de proteïna NKCC2 [18,19]. Val la pena subratllar que en tots els models animals d'hipertensió i envelliment, NKCC2 sembla estar regulat principalment per mecanismes post-traduccionals [5,16,19], subratllant per tant la necessitat d'estudiar els factors que regulen la biogènesi i el tràfic de NKCC2. Malgrat això, el nostre coneixement dels mecanismes moleculars subjacents al tràfic intracel·lular de proteïnes NKCC2 de tipus salvatge i mutades a les cèl·lules de mamífers, en particular la seva regulació per interacció proteïna-proteïna, es va mantenir molt pobre. A més, la gran majoria dels informes anteriors es van centrar principalment en la regulació post-Golgi del cotransportador, en particular per la fosforilació [20–22], i per tant avui se sap molt poc sobre la regulació dels transportadors a l'ER i pre-Golgi. nivell.

Per funcionar correctament, NKCC2 s'ha d'orientar adequadament a la superfície cel·lular apical i expressar-se prou per permetre que les cèl·lules TAL s'adaptin adequadament als reptes fisiològics o patològics [3,23]. Com totes les proteïnes transmembrana, la preparació per al tràfic adequat de NKCC2 a la membrana cel·lular comença quan la proteïna cotransportadora es sintetitza al reticle endoplasmàtic (ER) i continua mentre la proteïna transita per la xarxa de Golgi [24, 25]. De la mateixa manera, de manera similar a pràcticament totes les proteïnes destinades a la membrana plasmàtica, les proteïnes NKCC2 translocades al reticle endoplasmàtic (ER) se sotmeten a un control de qualitat, de manera que només les proteïnes plegades es mouen per la via secretora [26,27]. El control del plegament de proteïnes a l'ER sovint està relacionat amb la N-glicosilació, una modificació postraduccional iniciada per l'enllaç covalent d'un oligosacàrid específic (Glc3Man9GlcNAc2) a una proteïna naixent [28,29]. Un cop transferit aquest oligosacàrid, segueixen diversos passos successius de maduració de proteïnes al llarg de la via secretora [28,30]. Després de l'eliminació de tres residus de glucosa i l'inici de la retallada de la manosa a l'ER, com a part del procés de control de qualitat, les proteïnes plegades correctament es transfereixen a l'aparell de Golgi per a la seva maduració [26, 28]. Els N-glicans alts en manosa són posteriorment retallats per manosidases específiques, com ara Golgi 1,2-mannosidases al cis-Golgi [31,32]. L'addició de GlcNAc, galactosa, àcid siàlic i sucres de fucosa genera N-glicans híbrids i complexos dins dels compartiments medial i trans-Golgi [33,34]. Posteriorment, les proteïnes N-glicosilades madures s'orienten al seu destí final. Quan el procés de plegament falla, els residus de manosa terminals de l'estructura del nucli de glicans es retallen progressivament i les proteïnes defectuoses es traslladen a través de la membrana per a la degradació del proteasoma citosòlic mitjançant mecanismes coneguts com ERAD (degradació associada al reticle endoplasmàtic [26, 35]). Les proteïnes aberrants restants, que poden formar agregats o no poden ser detectades per les chaperones ERAD, es lliuren als lisosomes per a l'eliminació a través de vies denominades col·lectivament com a pàgina ER [36,37]. No obstant això, algunes proteïnes mal plegades encara poden escapar de l'ER i avançar cap al Golgi, on se sotmeten a un control de qualitat de Golgi (GQC) i es dirigeixen al lisosoma o al proteasoma per a la seva degradació [38]. Tant les variants de tipus salvatge com les mutants de proteïnes transmembrana són propenses al control de qualitat i a la degradació de l'ER. La proteïna del canal de clorur CFTR (regulador de conductància transmembrana de la fibrosi quística), caracteritzada com el primer substrat ERAD de mamífer de membrana integral, és el millor exemple [39,40]. En condicions normals, fins a un 70 per cent de CFTR de tipus salvatge és degradat per ERAD [39,40]. Encara més impressionant, la supressió de la fenilalanina 508 (∆F508), la mutació de CFTR responsable de la fibrosi quística, redueix l'eficiència de plegament, donant lloc a que gairebé el 99 per cent de CFTR mutant es degradi abans que pugui arribar a la membrana plasmàtica [39,40]. De manera similar a CFTR i diverses altres proteïnes transmembrana com HERG [41], ROMK [42] i NCC [43], hem demostrat anteriorment que la majoria de les proteïnes NKCC2 recentment sintetitzades estaven atrapades a l'ER i destinades a la degradació, un procés. que implica principalment la via del proteasoma [44–46]. ERAD comença amb la detecció d'una proteïna mal plegada per chaperones moleculars [47]. El tipus de chaperones implicades en aquest procés depèn principalment de la posició de la lesió plegable del substrat que pot ocórrer al lumen ER, membrana ER o citoplasma [27,47]. En conseqüència, s'han proposat tres vies ERAD diferents com ERAD-L (ERAD de substrats amb lesions mal plegades dins del lumen ER), ERAD-M (membrana) i ERAD-C (citoplasma) [27,47,48]. Per exemple, l'ERAD de CFTR naixent implica tant chaperones luminals citoplasmàtiques com ER [49]. De la mateixa manera, NCC, una altra proteïna transmembrana, enganxa diverses chaperones citoplasmàtiques per a la seva ERAD [43,50]. De manera similar al NCC electroneutre específic del ronyó relacionat, NKCC2 posseeix 12 regions transmembrana, dos grans dominis citoplasmàtics i un gran bucle exofacial exposat a ER [5]. Com que NKCC2 conté dominis a l'ER i al citoplasma, és concebible una interacció del cotransportador amb les chaperones moleculars de l'ER a banda i banda o als dos costats de la membrana ER. A més, atès que el domini C-terminal de NKCC2 és la regió citoplasmàtica predominant [5], és probable que sigui el lloc principal d'interacció proteïna-proteïna i, per tant, tingui un paper primordial en la biogènesi i el tràfic del cotransportador. D'acord amb aquesta noció, anteriorment vam identificar diversos socis vinculants del terminal C NKCC2 [46,51–53]. Entre aquests, vam demostrar que l'aldolasa B i SCAMP2 s'uneixen a l'extrem C-terminal de NKCC2 a nivell post-Golgi i regulen la redistribució subcel·lular del cotransportador [51,52]. Més recentment, vam proporcionar proves que STCH, Hsp70 i la proteïna-lectina OS9 interaccionen amb la forma immadura de NKCC2 principalment a l'ER per regular la seva degradació associada a ER [46,53]. En aquest informe, es descriu una nova interacció proteïna-proteïna entre la cua C-terminal de NKCC2 i Golgi 1,2-mannosidasa IA (Golgi ManIA, també anomenada Man{9-mannosidasa), una proteïna omnipresent que pertany a la família de la classe I -1,2 manosidases que inclou la ER -mannosidasa I (MAN1B1) i dues altres de Golgi 1,2-mannosidases, Golgi -mannosidase IB [MAN1A2] i Golgi -mannosidase IC [MAN1C1] [31,54–56]. Curiosament, un nombre creixent d'evidències va indicar que les -1,2-mannosidases no només estan implicades en el plegament i la maduració de proteïnes, sinó que també tenen un paper fonamental en la degradació de proteïnes mal plegades [57–60]. Aquí, mostrem que ManIA interacciona amb la forma immadura de NKCC2 principalment a la xarxa cis-Golgi i promou la seva degradació per la via del proteasoma, revelant per tant un punt de control addicional en la vigilància i eliminació de proteïnes NKCC2 mal plegades. En conseqüència, aquestes troballes poden obrir noves vies en l'estudi del control de qualitat ER i Golgi de les proteïnes NKCC2 per ajudar en el desenvolupament de noves estratègies per prevenir i/o tractar els trastorns renals relacionats amb el tràfic i l'expressió aberrants de NKCC2.

Suplement de Cistanche

Materials i mètodes

1. Assaig de dos híbrids de llevats

El cribratge de dos híbrids de llevat (Y2H) es va realitzar tal com es va descriure anteriorment en detall [51], utilitzant com a esquer la regió proximal del terminal C NKCC2 (ressidus 661-1095). Breument, AH109 que expressava l'esquer es va aparellar amb la soca de llevat Y187 transformada amb una biblioteca d'ADNc de ronyó humà. Per a la selecció de clons positius que codifiquen proteïnes en interacció putatives, primer es van cultivar cèl·lules de llevat aparellades en plaques de selecció de baixa rigorositat (−Leu, −Trp, −His) i després en plaques de selecció d'alta rigorositat (−Leu, −Trp, −His, −). Ade). Les colònies seleccionades també es van provar per a l'activitat de -galactosidasa i l'ADN dels clons positius es va aïllar de cèl·lules de llevat mitjançant el kit d'aïllament de plasmidi de llevat RPM (BIO 101 Systems). Després de rescatar els plasmidis de les preses mitjançant la transformació en bacteris DH5 (Invitrogen) i l'aïllament mitjançant un kit Qiagen, els plasmidis d'ADNc es van seqüenciar i avaluar mitjançant el programa BLAST.

2. Construcció de plasmidis i mutagènesi dirigida al lloc

La generació de WT Myc-NKCC2, Myc-NKCC2 no glicosilat ((N442Q/N452Q) i WT EGFP-NKCC2 es va descriure prèviament [45,46,51]. La seqüència de codificació ManIA del ratolí es va subclonar en el vector d'expressió de mamífer pcDNA3.1/V5 (Invitrogen, París, França) per generar la construcció WT ManIA-V5. El plasmidi que consta de ManIA sense la seva cua C-terminal (ManIA-∆Cter) es va generar mitjançant l'amplificació a partir de la construcció d'expressió WT MANIAV5 utilitzant l'imprimador directe 50 CCGGAGCGATGAAGTTCGTGCTGCTGC 30 i l'imprimació inversa. 50 TTTCTCTTTGCCATCAATTTC 30. La construcció que conté ManIA desproveïda de la seva regió N-terminal (ManIA-∆Nter) també es va generar a partir del plasmidi WT MANIA-V5 mitjançant el mètode de mutagènesi dirigida al lloc QuikChange (Stratagene, Les Ulis, França) utilitzant l'imprimador directe 50 GAGGGCTTAGGAATGATCCATAGG 3 0 i cebador invers 50 ATCCAAGCATGGGTCATCTACTCTTTGATCTTTGCCCTC 30. Totes les mutacions i truncaments es van confirmar mitjançant seqüenciació.

3. Cultiu cel·lular

Les cèl·lules renals d'opossum (cèl·lules OKP) es van mantenir en DMEM (Gibco 42430) complementades amb sèrum boví fetal al 10% (Eurobio, Les Ulis, França), penicil·lina (100 U/mL) i estreptomicina (100 U/mL) a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada que conté un 5% de CO2. Les cèl·lules 293 de ronyó embrionari humà (HEK) es van cultivar en medis DMEM complementades amb un 10% de sèrum fetal boví i un 1% de penicil·lina/estreptomicina. Per a la transfecció d'ADN plasmidi, les cèl·lules es van fer créixer fins al 60-70 per cent de confluència abans de ser transfectades de manera transitòria durant 5 h mitjançant el kit Lipofectamine plus segons les instruccions del fabricant (Invitrogen, París, França). Per als experiments de degradació de proteïnes, les cèl·lules es van tractar amb MG132 (2 µM) o cloroquina (100 µM) 6 hores abans de la lisi cel·lular, tal com es va descriure anteriorment [53, 61]. La Kifunensina (Sigma k1140, Saint-Quentin-Fallavier, França) es va utilitzar a 25 µM 6 h abans de la lisi cel·lular.

4. Preparació de proteïnes, immunoblotting i immunoprecipitació

Després de la transfecció, les cèl·lules es van rentar amb PBS fred abans de ser solubilitzades en un tampó de lisi que contenia 120 mM Tris/Hepes, pH 7,4; NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, KCl 3 mM; 1 per cent (v/v) Triton X-100 i inhibidors de la proteasa (Complete Roche 1697498, Meylan, França). A continuació, es van recollir mostres i es van centrifugar a 16,{{10}} rpm durant 15 min a 4 ◦C. Per a la immunoprecipitació, les cèl·lules es van solubilitzar amb tampó de lisi que contenia NaCl 0,4 M; 1,5 mM de MgCl2; Hepes 10 mM, pH 7,9; 5 per cent (v/v) de glicerol; 0,5 per cent (v/v) Nonidet P-40) i inhibidors de la proteasa (Complete, Roche Diagnostics). La immunoprecipitació es va dur a terme mitjançant anticossos anti-V5 (Invitrogen) o anti-ManIA (Sigma), i purificació d'afinitat mitjançant perles de proteïna G-agarosa (Dynabeads, Invitrogen, París, França). Després de la incubació amb perles de proteïna G-agarosa durant 1 h a temperatura ambient, l'immunocomplex es va rentar en PBS (Invitrogen). A continuació, les mostres de proteïnes es van bullir en un tampó de càrrega, es van executar amb un gradient de gels de poliacrilamida SDS del 7,5 per cent o 10 per cent, o 15 per cent, i es van sondar amb anticossos primaris d'interès i anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant. Les proteïnes es van visualitzar mitjançant la detecció de quimioluminescència millorada (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, França) segons les instruccions del fabricant.

5. Immunocitoquímica

Vint-i-quatre-quaranta-vuit hores després de la transfecció, les cèl·lules confluents es van rentar amb PBS plus plus (pH 8, 1 mM MgCl2 i 0.1 mM CaCl2). A continuació, les cèl·lules es van fixar amb un 2 per cent de paraformaldehid en PBS durant 20 min a temperatura ambient abans d'incubar-les amb NH4Cl 50 mM i es van permeabilitzar amb un 0,1 per cent de Tritó X-100 durant 1 min. Per bloquejar cap unió d'anticossos específica, les cèl·lules es van incubar amb DAKO (diluent d'anticossos amb components reductors de fons) durant 30 min. Les cèl·lules fixes es van incubar durant 1 h a temperatura ambient amb l'anticòs primari d'interès. Els anticossos primaris utilitzats en aquest estudi són els següents: ratolí anti-V5 (Invitrogen, París, França), ratolí anti-Myc (Takara, Clontech, Saint-Germain-en-Laye, França), rata anti-V5 (Abcam, París, França), conill anti-Calnexin (Abcam), conill anti-Giantin (Abcam), conill anti-GM130 (Abcam), conill anti-ManIA (Abcam), Els anticossos secundaris utilitzats són els següents: cabra anti-conill Alexa Fluor 555 (Invitrogen), cabra anti-conill Alexa Fluor 488 (Invitrogen), cabra anti-conill FITC (DakoCytomation, Trappes, França), cabra antiratolí Texas vermell (Invitrogen), cabra anti-rata Alexa Fluor 555 (Invitrogen), cabra antirata Alexa Fluor 488 (Invitrogen), antiratolí conjugat Alexa Texas Red (Jackson ImmunoResearch, Ely, Regne Unit), pollastre antiratolí Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Després d'incubacions amb anticossos primaris i secundaris d'interès, les cèl·lules es van rentar amb PBS i es van muntar amb Vectashield.

Herba Cistanche

6. Assajos de Cicloheximida-Chase

Per controlar l'estabilitat i la maduració de NKCC2, es va afegir cicloheximida a una concentració d'100 µM a les cèl·lules OKP o HEK 14-16 h després de la transfecció amb plasmidis NKCC2. Durant el període de persecució, els lisats cel·lulars es van recollir a les 0, 1, 2 i 4 hores després del tractament amb cicloheximida i es van analitzar mitjançant immunoblot.

7. Derrocament de siRNA

Els siRNAs de ManIA es van comprar a Dharmacon com a grups ON-TARGET i SMART (L-012174-00-0005). Les cèl·lules HEK es van transfectar per primera vegada amb control o ARNsi ManIA específics amb Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) utilitzant les especificacions del fabricant 0 tal com es va realitzar anteriorment [46,53]. Un dia després de la transfecció de siRNA, les cèl·lules es van transfectar amb plasmidis NKCC2. Després de 24-48 h, es van analitzar els lisats cel·lulars per a cada proteïna mitjançant els anticossos indicats.

8. Anàlisis estadístics

Les dades s'expressen com a mitjana ± SE. Les diferències entre les mitjanes es van avaluar mitjançant proves t aparellades o no aparellades o ANOVA segons correspongués. p < 0,05 es va considerar estadísticament significatiu.

Discussió

Aquest estudi es va dur a terme per conèixer els mecanismes moleculars subjacents a la regulació de la degradació associada a ER durant la biogènesi de NKCC2. Utilitzant l'anàlisi de dos híbrids de llevats i assajos de co-immunoprecipitació, vam identificar GolgiMannosidase IA com a nou soci d'unió de NKCC2. L'associació implica només la forma glicosilada immadura i alta de manosa del cotransportador i té lloc principalment a la xarxa cis-Golgi. Hem trobat que la derrota de ManIA augmenta l'abundància de proteïnes NKCC2, mentre que la seva sobreexpressió té l'efecte contrari. La coexpressió de ManIA va alterar la maduració de NKCC2 en promoure la seva retenció, reciclatge a l'ER i degradació a través de la via del proteasoma. És important destacar que els mutants de plegament NKCC2 són més propensos a la via ERAD mediada per ManIA. Aquestes troballes poden ajudar a entendre millor com les anomalies en el tràfic de proteïnes NKCC2 condueixen a la síndrome de Bartter, que és essencial per dilucidar la fisiopatologia de BS1 i per millorar els tractaments disponibles.

Ara està clarament establert que la retallada de la manosa per les2-mannosidases de classe I 1 està implicada en l'etapa de reconeixement de l'ERAD de les glicoproteïnes, ja que aquest procés es veu molt reduït pels seus inhibidors 1-desoximannojirimicina i kifunensina [67, 70–73]. Inicialment, es va pensar, basant-se en estudis realitzats principalment en llevats, que aquests compostos dificulten l'ERAD mitjançant la inhibició de l'ER 1,2-mannosidasa I que principalment escinda la manosa de la branca B mitjana de Man9 per formar Man8, un senyal de glicà. va proposar iniciar ERAD [70,74]. Tanmateix, a les cèl·lules de mamífers, aquesta hipòtesi no és necessàriament sòlida atès que tant la kifunensina com la 1-desoximannojirimicina també inhibeixen les 1,2-mannosidases de Golgi. A més, hi havia proves creixents en cèl·lules de mamífers que demostraven que la retallada addicional de tres a quatre residus de manosa enllaçats 12-per formar Man6GlcNAc2 (M6) o Man5GlcNAc2 (M5), també contribueix a desencadenar la degradació de les glicoproteïnes plegades malament. 32,75–77]. Tanmateix, no estava clar quines 1,2-mannosidases són les responsables d'aquest retall addicional. Un candidat és ER a 1,2-mannosidasa I ja que la seva sobreexpressió condueix a un augment de la retallada de la manosa i una ERAD accelerada [78–80]. Altres possibles candidats podrien ser proteïnes semblants a la manosidasa (EDEM) que milloren la degradació de l'ER perquè es va informar que tant EDEM1 com EDEM3 estimulen la retallada de la manosa i acceleren la glicoproteïna ERAD quan es sobreexpressa a les cèl·lules [81,82]. Un altre possible candidat podria ser Golgi manosidasa IA que retalla Man9 a Man6 i Man5 [31,54]. Es va demostrar que aquest enzim i dues altres 1,2 manosidases de Golgi (IB i IC) milloren la degradació i la retallada de la manosa d'un substrat ERAD-L, NHK 1-antitripsina, quan es sobreexpressen en cèl·lules cultivades [57]. En el present estudi, vam mostrar evidències d'una interacció específica de ManIA amb NKCC2, una proteïna transmembrana renal. És important destacar que vam demostrar que l'associació ManIA in vivo només implica la forma immadura del cotransportador. El més important és que vam proporcionar proves que la unió de ManIA està implicada en la retenció i la degradació associada a ER de NKCC2.

Càpsules de Cistanche

Anteriorment, vam proporcionar proves que l'ERAD i l'exportació des de l'ER constitueixen el regulador important de la maduració de NKCC2 i l'expressió de la superfície cel·lular [8,44–46]. De fet, vam demostrar que la majoria de les proteïnes NKCC2 recentment sintetitzades estan dirigides a la degradació associada a ER que implica les vies del proteasoma i del lisosoma [8,44–46,53]. A més, vam demostrar que STCH i la proteïna lectina OS9 participen en aquests processos interactuant amb la forma immadura de NKCC2 principalment a l'ER [46,53]. De manera similar a OS9 i STCH, la participació de ManIA en l'ERAD del cotransportador es va suggerir per primera vegada en l'estudi actual mitjançant assajos de co-immunoprecipitació que revelen que l'associació de les proteïnes només implica la forma immadura de NKCC2. Cal destacar que la supressió de la cua citoplasmàtica de ManIA va reduir però no va inhibir completament la seva interacció amb NKCC2, obrint per tant la possibilitat d'una interacció del cotransportador amb altres regions de la proteïna ManIA. A més, malgrat la interacció de ManIA només amb la forma central glicosilada i immadura de NKCC2, els nostres estudis d'immunocitoquímica van revelar que ManIA no colocalitza amb NKCC2 a l'ER. En aquest sentit, val la pena assenyalar que es va informar que ManIA es trobava al Golgi o a l'ER [31,83–85]. Un altre estudi independent va informar que la manosidasa IA també pot residir en vesícules de control de qualitat [58]. En conseqüència, com que la distribució cel·lular de ManIA pot dependre del tipus cel·lular, vam realitzar el nostre estudi en dues línies cel·lulars renals diferents, cèl·lules OKP i HEK. Els estudis de localització realitzats en aquestes cèl·lules van demostrar clarament que ManIA s'expressa a l'aparell de Golgi en ambdues línies cel·lulars i van revelar que el lloc d'interacció amb el cotransportador és la xarxa cis-Golgi. Cal destacar que, atès que l'N-glicà de les glicoproteïnes a l'entrada de l'aparell de Golgi és encara de tipus alta manosa, és concebible que la interacció NKCC2 amb ManIA es pugui produir efectivament a la xarxa cis-Golgi. Utilitzant enfocaments de siRNA i sobreexpressió, hem demostrat que ManIA interacciona amb el NKCC2 immadur per promoure la seva degradació associada a ER. És important destacar que l'efecte ManIA sobre la forma madura de NKCC2 es va evitar quan es va suprimir la cua citoplasmàtica de ManIA. Encara més impressionant, l'efecte ManIA sobre les formes immadures i madures de NKCC2 es va eliminar completament quan l'enzim va ser privat del seu domini catalític. A més, la regulació de NKCC2 per ManIA també es va prevenir en presència de l'inhibidor del proteasoma MG132, però no amb la cloroquina, un inhibidor de la funció lisosomal, cosa que indica que ManIA s'adreça a la forma immadura del cotransportador a la via ERAD dependent del proteasoma. Per donar suport encara més al paper de ManIA a l'ERAD de NKCC2, també vam provar l'efecte de l'inhibidor de retallada de manosa kifunensina. Curiosament, el tractament amb kifunensina va inhibir l'efecte ManIA sobre NKCC2, cosa que indica que la retallada de la manosa és un procés important en la degradació de NKCC2 associada a ER mediada per ManIA. Tanmateix, l'efecte ManIA no es va prevenir completament per la kifunensina, la qual cosa implica que, almenys en part, l'acció de ManIA sobre el cotransportador no depèn totalment de N-glicans. En suport d'aquesta noció, les mutacions dels llocs de glicosilació NKCC2 no van inhibir completament l'efecte ManIA sobre el cotransportador, confirmant, per tant, que, almenys en les nostres condicions experimentals, part de l'efecte ManIA pot ser independent de N-Glycan. En suport d'aquesta noció, Ron et al. va proporcionar proves que en condicions d'estrès ER, l'expressió millorada d'EDEM1, una altra proteïna alfa-mannosidasa, passa per alt l'esdeveniment de retallament de la manosa i lliura la glicoproteïna directament a les etapes ERAD tardanes [86]. De fet, van demostrar clarament que, després de la sobreexpressió d'EDEM1, la degradació de la glicoproteïna H2a no va ser bloquejada per la kifunensina [86]. Això té un interès particular perquè el nostre entorn experimental, és a dir, la sobreexpressió heteròloga de proteïnes secretores i de membrana (NKCC2) causa estrès ER [87–89] que pot explicar, almenys en part, la persistència d'un efecte de ManIA, independentment de la retallada de la manosa. , al cotransportador en aquestes condicions. Val la pena assenyalar que l'efecte ManIA restant sobre la proteïna NKCC2 no glicosilada va ser completament bloquejat per MG132, corroborant encara més la noció que ManIA promou l'ERAD de NKCC2 en una via dependent del proteasoma.

L'acumulació de polipèptids malplegats i propensos a l'agregació és perjudicial per a la salut cel·lular [90–92]. Un nombre més gran (més de 70) de malalties humanes resulten de defectes en el plegament de proteïnes secretores i de membrana [91,92]. Per evitar el plegament incorrecte de les proteïnes i mantenir l'homeòstasi de les proteïnes a la via secretora, les cèl·lules eucariotes posseeixen múltiples mecanismes de control de qualitat (QC) [26]. Inclouen el control de qualitat ER (ERQC) a través de la via de degradació associada al reticle endoplasmàtic (ERAD) [36,48] i la pàgina ER [93] Control de qualitat de Golgi (QCG) [38] i control de qualitat de la membrana plasmàtica (PM) [94] ]. Per tant, les proteïnes mal plegades, en particular les proteïnes transmembrana amb topologies complexes com NKCC2, són inspeccionades de manera rigorosa mitjançant successius punts de control de qualitat abans d'arribar a les seves destinacions finals [26, 94]. A més, les vies de control de qualitat poden cooperar per contrarestar de manera eficient el plegament incorrecte d'una sola proteïna. Per exemple, tot i que la majoria de proteïnes transmembrana plegades malament són degradades per ERAD, algunes proteïnes aberrants, en particular en condicions d'estrès ER, poden escapar de la vigilància de l'ER per ser empaquetades en vesícules COPII per al tràfic anterògrad al Golgi [95-97]. L'evidència obtinguda a partir de diversos estudis recolza la idea que l'aparell de Golgi serveix com a punt de control de control de qualitat [26,38] De fet, les proteïnes malplegades o no muntades que evaden l'ERAD i la pàgina ER, surten de l'ER i es converteixen en substrats de GQC que es dirigeixen al vacúol / lisosoma per a la degradació [26, 38]. En aquest sentit, és molt poc probable que la via GQC orientada al lisosoma/vacúol sigui el mecanisme subjacent a la regulació a la baixa de NKCC2 induïda per ManIA, atès que la cloroquina, inhibidora del lisosoma, no va impedir l'efecte ManIA sobre el cotransportador. Una altra possibilitat és que algunes proteïnes mal plegades que entren al Golgi es puguin orientar a la degradació proteasòmica després del lliurament a l'ER. Més precisament, el GQC captura els substrats escapats molt probablement al cis-Golgi i els torna a fer cicles a l'ER per a ERAD pel proteasoma. Això és de gran interès perquè vam demostrar que ManIA col·localiza amb NKCC2 principalment a la xarxa cis-Golgi. A més, a diferència de la cloroquina, l'inhibidor del proteasoma MG132 va abolir l'efecte ManIA sobre NKCC2, cosa que suggereix fortament, per tant, que és molt probable que el GQC dirigit al proteasoma sigui la via principal que governi la regulació de NKCC2 per ManIA. Cal destacar que un estudi molt recent en llevats va proposar que algunes proteïnes mal plegades que entren al Golgi es poden dirigir directament a la degradació proteasòmica sense tornar a l'ER, un mecanisme anomenat EGAD [98]. Tanmateix, tot i que no es pot excloure aquest mecanisme addicional, vam demostrar clarament que després de la coexpressió de ManIA, NKCC2 es manté en gran part a l'ER. Per tant, les nostres dades suggereixen fermament que ManIA promou la retenció, el reciclatge i l'ERAD dependent del proteasoma de proteïnes NKCC2 mal plegades que inicialment escapen del control de qualitat ER.

Cistanche tubulosa

Una exploració exhaustiva dels mecanismes subjacents a la maquinària ERAD ha proporcionat diverses idees noves sobre com ERAD contribueix a la salut humana tant en estats normals com malalts [48,92]. La importància del control de qualitat d'ER, en general, i del fenomen ERAD, en particular, s'ha esmentat en un gran nombre de patologies humanes, anomenades malalties conformacionals [48,92]. Pel que fa a NKCC2, hem documentat anteriorment que la síndrome de Bartter tipus 1 es troba entre les malalties vinculades a la via ERAD [61]. De fet, tot i que diferents vies cel·lulars poden explicar la pèrdua de funció de NKCC2 en la malaltia BS1, les nostres dades van revelar que la degradació de proteïnes associades a ER és el mecanisme més comú que sustenta BS1 [61]. En conseqüència, la identificació de proteïnes que s'uneixen específicament a les formes immadures de WT NKCC2 i els seus mutants plegables és important per desxifrar els mecanismes moleculars subjacents a la regulació del seu ERAD. En el present estudi, vam proporcionar proves que, a més de WT NKCC2, ManIA interacciona amb la forma immadura dels mutants NKCC2 A508T i Y998X. A més, vam demostrar que la coexpressió de ManIA té un efecte més profund sobre el mutant de plegament de NKCC2 A508T en comparació amb WT NKCC2, cosa que suggereix fortament que ManIA pot tenir un paper important en l'ERAD dels mutants de NKCC2 durant BS1. Això té un interès particular perquè anteriorment vam informar que A508T i Y998X es mantenen a l'ER [45,61]. Atès que els nostres experiments d'immunolocalització van revelar que, independentment del sistema d'expressió, ManIA s'expressa a la xarxa cis-Golgi, la interacció de l'enzim amb aquests dos mutants NKCC2 suggereix fortament que, tot i que la majoria d'A508T i Y998X estan en gran part atrapats a l'ER, hi ha una transferència significativa d'aquests dos mutants des de l'ER al cis-Golgi, on poden ser capturats per ManIA per ser retornats a l'ER. En aquest sentit, Hosokawa et al. també va demostrar que, tot i que la majoria de les proteïnes NHK transfectades es mantenen a l'ER, algunes d'elles van evadir el control de qualitat de l'ER i van arribar al cis-Golgi on són retallades per les 1,2-mannosidases de Golgi per ser adreçades a ERAD. 57]. A més, diversos estudis recents van demostrar que ERManI, que inicialment es va predir que funcionaria a l'ER, també es va localitzar al complex de Golgi a les cèl·lules de mamífers, on contribueix a un punt de control de qualitat basat en Golgi que facilita la recuperació dels substrats ERAD capturats. a l'ER [59,60,99]. Cal tenir en compte que, atès que, com NKCC2, ManIA és una proteïna transmembrana, també pot interactuar de manera transitòria amb el cotransportador de l'ER, permetent, per tant, que l'enzim participi en la generació del senyal que s'adreça a les proteïnes NKCC2 mal plegades per a ERAD, ja sigui mentre transiten per l'ER. o de camí cap al Golgi.

En resum, vam trobar que Golgi ManIA interacciona amb la forma immadura de NKCC2 al cis-Golgi per promoure la seva retenció ER i accelerar la seva ERAD per la via del proteasoma. Segons el que sabem, aquest és el primer estudi que descriu el paper significatiu del mecanisme de control de qualitat de Golgi en la biogènesi de NKCC2. A més, aquest també és el primer informe que proporciona evidència que, a més de les proteïnes luminals, ManIA també pot estar implicada en l'ERAD de proteïnes transmembrana. Les nostres dades suggereixen fermament que ManIA maniobra dins d'un punt de control de qualitat localitzat en cis-Golgi per servir com a sistema de seguretat per a la vigilància ERAD a l'ER, proporcionant, per tant, una potent xarxa addicional per a l'eliminació adequada de proteïnes NKCC2 mal plegades no desitjades que protegeixen, per tant, cèl·lules de la proteotoxicitat causada per la formació d'agregats proteics, en particular durant la malaltia de la síndrome de Bartter. Innegablement, ManIA no pot treballar aïlladament per mediar l'ERAD del cotransportador. De manera adequada, es pot postular de manera plausible que ManIA treballa conjuntament, seqüencialment o simultàniament, amb altres proteïnes d'unió a NKCC2 i components ERAD, com OS9 [46] i STCH [53] per mediar el control de qualitat ER del cotransportador. En aquest sentit, proposem un model pel qual, en condicions d'estrès ER: (1) OS9 està implicat en la retenció de proteïnes NKCC2 mal plegades a l'ER i la seva ERAD pel proteasoma. (2) STCH té un paper crucial en l'ERAD de NKCC2 per les vies del proteasoma i del lisosoma. (3) Golgi ManIA contribueix a l'ERAD de NKCC2 capturant proteïnes NKCC2 mal plegades que van escapar del control de qualitat de l'ER i retornar-les a l'ER. Es necessiten més experiments per descobrir el mecanisme precís darrere d'aquest model. La caracterització i identificació exhaustiva de la composició molecular específica dels controls de qualitat ER i Golgi de NKCC2 i els seus mutants causants de malalties poden oferir una base per definir noves estratègies terapèutiques dirigides al transport de cotransportadors des de les xarxes ER i Golgi a la superfície cel·lular.

Referències

1. Guyton, AC Control de la pressió arterial: paper especial dels ronyons i dels fluids corporals. Ciència 1991, 252, 1813–1816. [CrossRef] [PubMed]

2. Lifton, RP; Gharavi, AG; Geller, DS Mecanismes moleculars de la hipertensió humana. Cell 2001, 104, 545–556. [Ref creuat]

3. Castrop, H.; Schiessl, IM Fisiologia i fisiopatologia del cotransportador renal de Na-K-2Cl (NKCC2). Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F991–F1002. [Ref creuat]

4. Greger, R.; Velazquez, H. L'extremitat ascendent gruixuda cortical i el túbul contornejat distal precoç en el mecanisme de concentració urinaria. Ronyó Int. 1987, 31, 590–596. [CrossRef] [PubMed]

5. Gamba, G. Fisiologia molecular i fisiopatologia dels cotransportadors electroneutrals de cations-clorur. Physiol. Rev. 2005, 85, 423–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Ares, GR; Càceres, PS; Ortiz, PA Regulació molecular de NKCC2 a l'extremitat ascendent gruixuda. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2011, 301, F1143–F1159. [CrossRef] [PubMed]

7. Komhoff, M.; Laghmani, K. Fisiopatologia de la síndrome de Bartter prenatal. Curr. Opina. Nefrol. Hipertensos. 2017, 26, 419–425. [CrossRef] [PubMed]

8. Laghmani, K.; Beck, BB; Yang, SS; Seaayfan, E.; Wenzel, A.; Reusch, B.; Vitzthum, H.; Priem, D.; Demaretz, S.; Bergmann, K.; et al. Polihidramnios, síndrome de Bartter prenatal transitòria i mutacions MAGED2. N. Anglès. J. Med. 2016, 374, 1853–1863. [Ref creuat]

9. Simon, DB; Lifton, RP La base molecular de l'alcalosi hipokalèmica hereditària: síndromes de Bartter i Gitelman. Am. J. Physiol. 1996, 271, F961–F966. [Ref creuat]

10. Aviv, A.; Hollenberg, NK; Weder, A. Excreció urinaria de potassi i sensibilitat al sodi en negres. Hipertensió 2004, 43, 707–713. [Ref creuat]

11. Hoorn, EJ; Walsh, SB; McCormick, JA; Furstenberg, A.; Yang, CL; Roeschel, T.; Paliege, A.; Howie, AJ; Conley, J.; Bachmann, S.; et al. L'inhibidor de la calcineurina tacrolimus activa el cotransportador renal de clorur de sodi per provocar hipertensió. Nat. Med. 2011, 17, 1304–1309. [CrossRef] [PubMed]

12. Borschewski, A.; Himmerkus, N.; Boldt, C.; Blankenstein, KI; McCormick, JA; Lazelle, R.; Willnow, TE; Jankowski, V.; Plana, A.; Bleich, M.; et al. La calcineurina i el receptor relacionat amb la classificació amb repeticions de tipus A interaccionen per regular el cotransportador de Na( més )-K( més )-2Cl(-) renal. Melmelada. Soc. Nefrol. 2016, 27, 107–119. [Ref creuat]

13. Trudu, M.; Janas, S.; Lanzani, C.; Debaix, H.; Schaeffer, C.; Ikehata, M.; Citterio, L.; Demaretz, S.; Trevisani, F.; Ristagno, G.; et al. Les variants del gen UMOD no codificants comuns indueixen hipertensió sensible a la sal i dany renal augmentant l'expressió d'uromodulina. Nat. Med. 2013, 19, 1655–1660. [Ref creuat]

14. Álvarez-Guerra, M.; Garay, RP Cotransportador renal de Na-K-Cl NKCC2 en rates Dahl sensibles a la sal. J. Hipertensos. 2002, 20, 721–727. [Ref creuat]

15. Capasso, G.; Rizzo, M.; Evangelista, C.; Ferrari, P.; Geelen, G.; Lang, F.; Bianchi, G. Expressió alterada de la membrana plasmàtica apical renal Na més transportadors en la fase inicial de la hipertensió genètica. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2005, 288, F1173–F1182. [Ref creuat]

16. Fenton, RA; Knepper, MA Els models de ratolí i el mecanisme de concentració urinària en el nou mil·lenni. Physiol. Rev. 2007, 87, 1083–1112. [CrossRef] [PubMed]

17. Komhoff, M.; Laghmani, K. MAGED2: Una nova forma de síndrome de Bartter prenatal. Curr. Opina. Nefrol. Hipertensos. 2018, 27, 323–328. [Ref creuat]

18. Sands, JM Concentració urinària i dilució en el ronyó envellit. Semin. Nefrol. 2009, 29, 579–586. [Ref creuat]

19. Tian, ​​Y.; Riazi, S.; Khan, O.; Klein, JD; Sugimura, Y.; Verbalis, JG; Ecelbarger, subunitat CA Renal ENaC, abundància de cotransportadors de Na-K-2Cl i Na-Cl en rates F344 x Brown Norway envellides i restringides per l'aigua. Ronyó Int. 2006, 69, 304–312. [CrossRef] [PubMed]

20. Schiessl, IM; Castrop, H. Regulació de l'empalmament i la fosforilació de NKCC2. Curr. Opina. Nefrol. Hipertensos. 2015, 24, 457–462. [CrossRef] [PubMed]

21. Davies, M.; Fraser, SA; Galic, S.; Choy, SW; Katerelos, M.; Gleich, K.; Kemp, BE; Muntatge, PF; Potència, DA Mecanismes nous de Na més retenció en l'obesitat: fosforilació de NKCC2 i regulació de SPAK/OSR1 per AMPK. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F96–F106. [Ref creuat]

22. Gamba, G. Regulació de l'activitat de NKCC2 per isoformes truncades SPAK. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 306, F49–F50. [CrossRef] [PubMed]

23. Edwards, A.; Castrop, H.; Laghmani, K.; Vallon, V.; Layton, AT Efectes de la regulació de la isoforme NKCC2 sobre el transport de NaCl en extremitats ascendents gruixudes i màcula densa: un estudi de modelització. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F137–F146. [Ref creuat]

24. Vitale, A.; Denecke, J. The endoplasmic reticlum gateway of the secretory pathway. Planta. Cell 1999, 11, 615–628. [PubMed]

25. Caplan, MJ Polaritat de la membrana en cèl·lules epitelials: classificació de proteïnes i establiment de dominis polaritzats. Am. J. Physiol. 1997, 272, F425–F429. [Ref creuat]

26. Sol, Z.; Brodsky, JL Control de qualitat de proteïnes a la via secretora. J. Cell Biol 2019, 218, 3171–3187. [CrossRef] [PubMed]

27. Ruggiano, A.; Foresti, O.; Carvalho, P. Control de qualitat: degradació associada a ER: control de qualitat de proteïnes i més enllà. J. Cell Biol. 2014, 204, 869–879. [CrossRef] [PubMed]

28. Ruddock, LW; Molinari, M. Processament de N-glicà en el control de qualitat ER. J. Cell Sci. 2006, 119, 4373–4380. [Ref creuat]

29. Molinari, M. L'estructura dels N-glicans dicta l'extensió del plegament de proteïnes o l'inici de l'eliminació. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 313–320. [Ref creuat]

30. Hebert, DN; Garman, SC; Molinari, M. El codi de glicans del reticle endoplasmàtic: carbohidrats lligats a l'asparagina com a maduració de proteïnes i etiquetes de control de qualitat. Tendències Cell Biol. 2005, 15, 364–370. [Ref creuat]

31. Igdoura, SA; Herscovics, A.; Lal, A.; Moremen, KW; Morales, CR; Hermo, L. Les alfa-mannosidases implicades en el processament de N-glicans mostren especificitat cel·lular i subcompartimentació diferent dins de l'aparell de Golgi de les cèl·lules del testicle i l'epidídim. Eur. J. Cell Biol. 1999, 78, 441–452. [Ref creuat]

32. Lederkremer, GZ; Glickman, MH Una finestra d'oportunitat: sincronitzar la degradació de proteïnes mitjançant la retallada de sucres i ubiquitines. Tendències Bioquímica. Ciència. 2005, 30, 297–303. [CrossRef] [PubMed]

33. Stanley, P.; Taniguchi, N.; Aebi, M. N-Glycans. A Essentials of Glycobiology, 3r.; Varki, A., Cummings, RD, Esko, JD, Stanley, P., Hart, GW, Aebi, M., Darvill, AG, et al., Eds.; Cold Spring Harbor: Nova York, NY, EUA, 2015; pàgines 99–111.

34. Barlowe, CK; Miller, EA Biogènesi de proteïnes secretores i trànsit a la via secretora primerenca. Genètica 2013, 193, 383–410. [Ref creuat]

35. Wu, X.; Rapoport, TA Coneixements mecànics sobre la degradació de proteïnes associades a ER. Curr. Opina. Biol cel·lular. 2018, 53, 22–28. [Ref creuat]

36. Sol, Z.; Brodsky, JL La via de degradació d'una proteïna model mal plegada està determinada per la propensió a l'agregació. Mol. Biol Cell. 2018, 29, 1422–1434. [Ref creuat]

37. Fresno, I.; Molinari, M. Eliminació proteasòmica i lisosomal de proteïnes secretores defectuoses: vies de degradació associada a ER (ERAD) i degradació associada a ER a lisosoma (ERLAD). Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2019, 54, 153–163. [CrossRef] [PubMed]

38. Briant, K.; Johnson, N.; Swanton, E. Els sistemes de control de qualitat del domini transmembrana operen al reticle endoplasmàtic i a l'aparell de Golgi. PLoS ONE 2017, 12, e0173924. [CrossRef] [PubMed]

39. Jensen, TJ; Loo, MA; Pind, S.; Williams, DB; Goldberg, AL; Riordan, JR Múltiples sistemes proteolítics, inclòs el proteasoma, contribueixen al processament CFTR. Cell 1995, 83, 129–135. [Ref creuat]

40. Ward, CL; Omura, S.; Kopito, RR Degradació de CFTR per la via ubiquitina-proteasoma. Cell 1995, 83, 121–127. [Ref creuat]

41. Gong, Q.; Keeney, DR; Molinari, M.; Zhou, Z. Degradació dels canals mutants tipus II de la síndrome del QT llarg defectuosos del tràfic per la via ubiquitina-proteasoma. J. Biol. Chem. 2005, 280, 19419–19425. [Ref creuat]

42. O'Donnell, BM; Mackie, TD; Subramanya, AR; Brodsky, JL La degradació del canal renal de potassi associada al reticle endoplasmàtic, ROMK, condueix a la síndrome de Bartter tipus II. J. Biol. Chem. 2017, 292, 12813–12827. [CrossRef] [PubMed]

43. Needham, PG; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, AC; Subramanya, AR; Brodsky, JL El cotransportador de NaCl sensible a la tiazida està dirigit a la degradació associada al reticle endoplasmàtic depenent de la chaperona. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43611–43621. [CrossRef] [PubMed]

44. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zhu, Y.; Laghmani, K. Diversos motius semblants a la dileucina conservats evolutivament a l'extrem carboxil controlen el tràfic anterògrad de NKCC2. J. Biol. Chem. 2012, 287, 42642–42653. [Ref creuat]

45. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Mordasini, D.; Laghmani, K. Un motiu molt conservat a l'extrem COOH dicta la sortida del reticle endoplasmàtic i l'expressió de la superfície cel·lular de NKCC2. J. Biol. Chem. 2009, 284, 21752–21764. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Seaayfan, E.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Zaarour, N.; Laghmani, K. La proteïna OS9 interacciona amb el cotransportador de Na-K-2Cl (NKCC2) i apunta a la seva forma immadura per a la via de degradació associada al reticle endoplasmàtic. J. Biol. Chem. 2016, 291, 4487–4502. [Ref creuat]

47. Brodsky, JL Els papers protectors i destructius que tenen les chaperones moleculars durant l'ERAD (degradació associada al reticle endoplasmàtic). Bioquímica. J. 2007, 404, 353–363. [Ref creuat]

48. Guerriero, CJ; Brodsky, JL El delicat equilibri entre el plegament de proteïnes secretades i la degradació associada al reticle endoplasmàtic en la fisiologia humana. Physiol. Rev. 2012, 92, 537–576. [Ref creuat]

49. Ahner, A.; Gong, X.; Frizzell, RA Degradació del regulador de conductància transmembrana de la fibrosi quística: diàleg entre les vies d'ubiquitilació i SUMOilació. FEBS J. 2013, 280, 4430–4438. [Ref creuat]

50. Donnelly, BF; Needham, PG; Snyder, AC; Roy, A.; Khadem, S.; Brodsky, JL; Els complexos multichaperona Subramanya, AR Hsp70 i Hsp90 regulen seqüencialment la degradació i la biogènesi del cotransportador sensible a la tiazida associada al reticle endoplasmàtic. J. Biol. Chem. 2013, 288, 13124–13135. [Ref creuat]

51. Benziane, B.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zaarour, N.; Cheval, L.; Bourgeois, S.; Klein, C.; Froissart, M.; Blanchard, A.; Paillard, M.; et al. Expressió superficial de NKCC2 a cèl·lules de mamífers: regulació a la baixa mitjançant una nova interacció amb l'aldolasa BJ Biol. Chem. 2007, 282, 33817–33830. [Ref creuat]

52. Zaarour, N.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Azroyan, A.; Cheval, L.; Laghmani, K. La proteïna de membrana transportadora secretora 2 regula la inserció exocítica de NKCC2 a la membrana cel·lular. J. Biol. Chem. 2011, 286, 9489–9502. [Ref creuat]

53. Bakhos-Douaihy, D.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Komhoff, M.; Laghmani, K. Efectes diferencials de STCH i Hsp70 induïble per l'estrès sobre l'estabilitat i la maduració de NKCC2. Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 2207. [CrossRef]

54. Herscovics, A.; Schneikert, J.; Athanassiadis, A.; Moremen, KW Aïllament d'un ADNc de manosidasa de Golgi de ratolí, membre d'una família de gens conservats des de llevats fins a mamífers. J. Biol. Chem. 1994, 269, 9864–9871. [Ref creuat]

55. Tempel, W.; Karaveg, K.; Liu, ZJ; Rosa, J.; Wang, BC; Moremen, KW L'estructura de l'alfa-mannosidasa IA de Golgi del ratolí revela la base molecular de l'especificitat del substrat entre les alfa1,2-mannosidases de classe 1 (família 47 glicosilhidrolases). J. Biol. Chem. 2004, 279, 29774–29786. [Ref creuat]

56. Tulsiani, DR; Touster, O. La purificació i caracterització de la manosidasa IA de les membranes de Golgi del fetge de rata. J. Biol. Chem. 1988, 263, 5408–5417. [Ref creuat]

57. Hosokawa, N.; Tu, Z.; Tremblay, LO; Nagata, K.; Herscovics, A. Estimulació de l'ERAD de l'alfa1- antitripsina de Hong Kong mal plegada per alfa1,2-mannosidases de Golgi. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2007, 362, 626–632. [CrossRef] [PubMed]

58. Ogen-Shtern, N.; Avezov, E.; Shenkman, M.; Benyair, R.; Lederkremer, GZ Mannosidase IA està en vesícules de control de qualitat i participa en l'orientació de glicoproteïnes a ERAD. J. Mol. Biol. 2016, 428, 3194–3205. [Ref creuat]

59. Iannotti, MJ; Figard, L.; Sokac, AM; Sifers, RN A, la manosidasa localitzada en Golgi (MAN1B1) té un paper de porter no enzimàtic en el control de qualitat biosintètic de proteïnes. J. Biol. Chem. 2014, 289, 11844–11858. [CrossRef] [PubMed]

60. Pan, S.; Cheng, X.; Sifers, reticle endoplasmàtic alfa-1 situat a RN Golgi, 2-mannosidasa contribueix a la recuperació de substrats ERAD mitjançant la interacció directa amb gamma-COP. Mol. Biol. Cèl·lula 2013, 24, 1111–1121. [CrossRef] [PubMed]

61. Shaukat, I.; Bakhos-Douaihy, D.; Zhu, Y.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Frachon, N.; Weber, S.; Komhoff, M.; Vargas-Poussou, R.; Laghmani, K. Nous coneixements sobre el paper de la degradació associada al reticle endoplasmàtic en la síndrome de Bartter tipus 1. Hum. Mutat. 2021, 42, 947–968. [Ref creuat]

62. Fujita, E.; Kouroku, Y.; Isoai, A.; Kumagai, H.; Misutani, A.; Matsuda, C.; Hayashi, YK; Momoi, T. Dos sistemes de degradació associada al reticle endoplasmàtic (ERAD) per a la nova variant de la disferlina mutant: ubiquitina/proteasoma ERAD(I) i autofàgia/lisosoma ERAD(II). Brunzit. Mol. Genet. 2007, 16, 618–629. [Ref creuat]

63. Bernasconi, R.; Molinari, M. Tuning ERAD i ERAD: eliminació de càrrega i reguladors ERAD de l'ER de mamífers. Curr. Opina. Cèl·lula. Biol. 2011, 23, 176–183. [Ref creuat]

64. Arvan, P.; Zhao, X.; Ramos-Castaneda, J.; Chang, A. Control de qualitat de la via secretora que opera a Golgi, plasmalema i sistemes endosòmics. Trànsit 2002, 3, 771–780. [Ref creuat]

65. Stolz, A.; Wolf, DH Degradació de proteïnes associada al reticle endoplasmàtic: un viatge assistit per una chaperona a l'infern. Biochim. Biofísica. Acta 2010, 1803, 694–705. [CrossRef] [PubMed]

66. Wang, F.; Cançó, W.; Brancati, G.; Segatori, L. La inhibició de la degradació associada al reticle endoplasmàtic rescata el plegament natiu en les malalties de malplegament de proteïnes amb pèrdua de funció. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43454–43464. [CrossRef] [PubMed]

67. Tokunaga, F.; Brostrom, C.; Koide, T.; Arvan, P. La degradació associada al reticle endoplasmàtic (ER) de les glicoproteïnes lligades a N mal plegades es suprimeix després de la inhibició de la ER manosidasa IJ Biol. Chem. 2000, 275, 40757–40764. [CrossRef] [PubMed]

68. Groisman, B.; Shenkman, M.; Ron, E.; Lederkremer, GZ La retallada de manosa és necessària per al lliurament d'una glicoproteïna des d'EDEM1 a XTP3-B i els passos de degradació tardans associats al reticle endoplasmàtic. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1292–1300. [CrossRef] [PubMed]

69. Vargas-Poussou, R.; Feldmann, D.; Vollmer, M.; Konrad, M.; Kelly, L.; van den Heuvel, LP; Tebourbi, L.; Brandis, M.; Karolyi, L.; Hebert, SC; et al. Noves variants moleculars del gen cotransportador de Na-K-2Cl són responsables de la síndrome de Bartter prenatal. Am. J. Hum. Genet. 1998, 62, 1332–1340. [CrossRef] [PubMed]

70. Helenius, A.; Aebi, M. Rols of N-linked glycans in the endoplasmic reticlum. Ann. Rev. Biochem. 2004, 73, 1019–1049. [Ref creuat]

71. Spiro, RG Paper dels oligosacàrids de polimanosa lligats a N en l'orientació de glicoproteïnes per a la degradació associada al reticle endoplasmàtic. Cel·lular Mol. Ciència de la vida. 2004, 61, 1025–1041. [Ref creuat]

72. Marcus, Nova York; Perlmutter, DH Glucosidase i inhibidors de la manosidasa medien l'augment de la secreció d'alfa1 antitripsina mutant ZJ Biol. Chem. 2000, 275, 1987–1992. [Ref creuat]

73. Liu, Y.; Choudhury, P.; Cabral, CM; Sifers, RN L'eliminació intracel·lular de l'alfa1-antitripsina humana incompletament plegada implica l'alliberament de la calnexina i la retallada post-traducció d'oligosacàrids lligats a l'asparagina. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7946–7951. [CrossRef] [PubMed]

74. Cabral, CM; Liu, Y.; Sifers, RN Dissecció del control de qualitat de la glicoproteïna a la via secretora. Tendències Bioquímica. Ciència. 2001, 26, 619–624. [Ref creuat]

75. Ermonval, M.; Kitzmuller, C.; Mir, AM; Cacan, R.; L'estructura d'Ivessa, NE N-glicà d'una variant de curta durada de la riboforina I expressada a la línia cel·lular defectuosa de la glicosilació MadIA214 revela el paper d'una manosidasa que no és ER manosidasa I en el procés de degradació de la glicoproteïna. Glycobiology 2001, 11, 565–576. [CrossRef] [PubMed]

76. Foulquier, F.; Edredó, S.; Klein, A.; Mir, AM; Chirat, F.; Cacan, R. Degradació associada al reticle endoplasmàtic de les glicoproteïnes que porten espècies Man5GlcNAc2 i Man9GlcNAc2 a la línia cel·lular MI8-5 CHO. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 398–404. [Ref creuat]

77. Avezov, E.; Frenkel, Z.; Ehrlich, M.; Herscovics, A.; Lederkremer, GZ Manosidasa del reticle endoplasmàtic (ER) Estic compartimentat i requerit per a la retallada de N-glicans a Man5-6GlcNAc2 en la degradació associada a la glicoproteïna ER. Mol. Biol. Cèl·lula 2008, 19, 216–225. [Ref creuat]

78. Hosokawa, N.; Tremblay, LO; Tu, Z.; Herscovics, A.; Wada, I.; Nagata, K. Millora de la degradació del reticle endoplasmàtic (ER) de l'alfa1-antitripsina nul de Hong Kong mal plegada per la manosidasa ER humana IJ Biol. Chem. 2003, 278, 26287–26294. [Ref creuat]

79. Sifers, RN Biologia cel·lular. Degradació de proteïnes desbloquejada. Ciència 2003, 299, 1330–1331. [Ref creuat]

80. Wu, Y.; Swulius, MT; Moremen, KW; Sifers, RN Elucidació de la lògica molecular mitjançant la qual l'alfa 1-antitripsina mal plegada es selecciona preferentment per a la degradació. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2003, 100, 8229–8234. [CrossRef] [PubMed]

81. Hirao, K.; Natsuka, Y.; Tamura, T.; Wada, I.; Morito, D.; Natsuka, S.; Romero, P.; Sleno, B.; Tremblay, LO; Herscovics, A.; et al. EDEM3, un homòleg soluble d'EDEM, millora la degradació associada al reticle endoplasmàtic de la glicoproteïna i la retallada de la manosa. J. Biol. Chem. 2006, 281, 9650–9658. [Ref creuat]

82. Olivari, S.; Cali, T.; Saló, KE; Paganetti, P.; Ruddock, LW; Molinari, M. EDEM1 regula la degradació associada a ER accelerant la desmanosilació de polipèptids defectuosos de plegament i inhibint la seva agregació covalent. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2006, 349, 1278–1284. [CrossRef] [PubMed]

83. Bieberich, E.; Bause, E. Man9-mannosidasa del ronyó humà s'expressa a les cèl·lules COS com una N-glicoproteïna transmembrana de tipus II resident a Golgi. Eur. J. Biochem. 1995, 233, 644–649. [CrossRef] [PubMed]

84. Velasco, A.; Hendricks, L.; Moremen, KW; Tulsiani, DR; Touster, O.; Farquhar, MG Variacions dependents del tipus de cèl·lules en la distribució subcel·lular de l'alfa-mannosidasa I i II. J. Cell Biol. 1993, 122, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

85. Bieberich, E.; Treml, K.; Volker, C.; Rolfs, A.; Kalz-Fuller, B.; Bause, E. Man9-mannosidasa del fetge de porc és una proteïna de membrana de tipus II que resideix al reticle endoplasmàtic. Clonació d'ADNc i expressió de l'enzim en cèl·lules COS 1. Eur. J. Biochem. 1997, 246, 681–689. [Ref creuat]

86. Ron, E.; Shenkman, M.; Groisman, B.; Izenshtein, Y.; Leitman, J.; Lederkremer, GZ Bypass del lliurament de glicoproteïnes dependents de glicans a ERAD mitjançant EDEM1 regulat. Mol. Biol. Cell 2011, 22, 3945–3954. [Ref creuat]

87. Casagrande, R.; Stern, P.; Diehn, M.; Shamu, C.; Osario, M.; Zúñiga, M.; Brown, PO; Ploegh, H. La degradació de proteïnes de l'ER de S. cerevisiae requereix una via de resposta de proteïnes desplegada intacta. Mol. Cell 2000, 5, 729–735. [Ref creuat]

88. Schroder, M.; Kaufman, estrès RJ ER i resposta proteica desplegada. Mutat. Res. 2005, 569, 29–63. [Ref creuat]

89. Liang, CJ; Chang, YC; Chang, HC; Wang, CK; Hung, YC; Lin, YE; Chan, CC; Chen, CH; Chang, HY; Sang, TK Derlin-1 regula la patogènesi mutant vinculada a VCP i l'apoptosi induïda per l'estrès del reticle endoplasmàtic. PLoS Genet. 2014, 10, e1004675. [CrossRef] [PubMed]

90. Houck, SA; Singh, S.; Cyr, DM Respostes cel·lulars a proteïnes mal plegades i agregats de proteïnes. Mètodes Mol. Biol. 2012, 832, 455–461. [CrossRef] [PubMed]

91. Chaudhuri, TK; Paul, S. Malalties de plegament incorrecte de proteïnes i enfocaments terapèutics basats en chaperones. FEBS J. 2006, 273, 1331–1349. [Ref creuat]

92. Yadav, K.; Yadav, A.; Vashistha, P.; Pandey, VP; Dwivedi, Malalties de plegament incorrecte de proteïnes de l'ONU i enfocaments terapèutics. Curr. Proteïna. Pept. Ciència. 2019, 20, 1226–1245. [Ref creuat]

93. Fresno, I.; Molinari, M. Rotació del reticle endoplasmàtic: pàgina ER i altres sabors en l'eliminació selectiva i no selectiva d'ER. F1000Res 2018, 7, 454. [CrossRef]

94. Okiyoneda, T.; Apaja, PM; Lukacs, GL Control de qualitat de proteïnes a la membrana plasmàtica. Curr. Opina. Biol cel·lular. 2011, 23, 483–491. [Ref creuat]

95. Caldwell, SR; Hill, KJ; Cooper, AA La degradació dels substrats de control de qualitat del reticle endoplasmàtic (ER) requereix transport entre l'ER i Golgi. J. Biol. Chem. 2001, 276, 23296–23303. [CrossRef] [PubMed]

96. Taxis, C.; Vogel, F.; Wolf, DH El trànsit ER-Golgi és un requisit previ per a una degradació eficient de l'ER. Mol. Biol. Cel·la 2002, 13, 1806–1818. [CrossRef] [PubMed]

97. Vashist, S.; Ng, DT Les proteïnes malplegades s'ordenen mitjançant un mecanisme de control seqüencial de control de qualitat ER. J. Cell Biol. 2004, 165, 41–52. [CrossRef] [PubMed]

98. Schmidt, O.; Weyer, Y.; Baumann, V.; Widerin, MA; Eising, S.; Angelova, M.; Schleiffer, A.; Kremser, L.; Lindner, H.; Pere, M.; et al. La degradació associada a l'endosoma i a Golgi (EGAD) de les proteïnes de membrana regulen el metabolisme dels esfingolípids. EMBO J. 2019, 38, e101433. [Ref creuat]

99. Pan, S.; Wang, S.; Utama, B.; Huang, L.; Blok, N.; Estes, MK; Moremen, KW; La localització de Sifers, RN Golgi d'ERManI defineix la separació espacial del sistema de control de qualitat de la glicoproteïna dels mamífers. Mol. Biol. Cel·la 2011, 22, 2810–2822. [Ref creuat]

Sylvie Demaretz 1,2, Elie Seaayfan 1,2,† , Dalal Bakhos-Douaihy 1,2, Nadia Frachon 1,2, Martin Kömhoff 3 i Kamel Laghmani 1,2,

1 Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, Inserm, Université de Paris, F-75006 París, França; sylvie.demaretz@sorbonne-universite.fr (SD); elie.seaayfan@uni-marburg.de (ES); dalal.bakhos_aldouaihy@sorbonne-universite.fr (DB-D.); nadia.frachon@sorbonne-universite.fr (NF)

2 CNRS, ERL8228, F-75006 París, França

3 Divisió de Nefrologia Pediàtrica i Trasplantaments, Hospital Infantil Universitari, Philipps-University, 35043 Marburg, Alemanya; Martin.Koemhoff@uk-gm.de