L'extracte de metanol de pela Beta Vulgaris Rubra L. (remolatxa) redueix l'estrès oxidatiu i estimula la proliferació cel·lular mitjançant l'augment de l'expressió de VEGF a les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana induïda per l'estrès oxidatiu induït per H2O2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper saber-ne més

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 i Amna Abdullah Alotiby 2

Resum:La capacitat antioxidant dels polifenols iflavonoidespresent en els agents dietètics ajuda a aturar el desenvolupament d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i a protegir les cèl·lules del múscul llis endotelial de l'estrès oxidatiu/necrosi induïda. La remolatxa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) és una hortalissa de consum habitual que representa una rica font deantioxidants. Els compostos bioactius de la pell de remolatxa i el seu paper en les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana (HUVEC) encara estan poc investigats. En el present estudi, es va preparar extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) i el seu efecte sobre la bioeficàcia, la integritat nuclear, el potencial de la membrana mitocondrial, el creixement de cèl·lules vasculars i els nivells d'expressió gènica relacionats amb la immunoregulació en HUVEC amb induïts.oxidatiuS'ha analitzat l'estrès. Els resultats de la cromatografia de gasos-espectroscòpia de masses (GC-MS) van confirmar que BPME conté 5-hidroximetilfurfural (32,6 per cent ), piruvat de metil (15,13 per cent ), furfural (9,98 per cent ) i 2,3-dihidro{{11} },5-dihidroxi-6-metil-4H-Pyran-4-un (12,4 per cent). L'extracte de BPM va millorar eficaçment la proliferació cel·lular i es va confirmar mitjançant un assaig MTT; la integritat nuclear es va confirmar mitjançant un assaig de tinció amb iodur de propidi (PI); el potencial de membrana mitocondrial (∆ψm) es va confirmar mitjançant un assaig de tinció JC-1. L'assaig de l'Annexina V va confirmar que els HUVEC tractats amb BPME mostraven un 99 per cent de cèl·lules viables, però només es va mostrar una viabilitat del 39,8 per cent en els HUVEC tractats només amb H2O2. A més, el tractament amb BPME d'HUVEC durant 48 h va reduir l'expressió d'ARNm de peròxid lipídic (LPO) i va augmentar NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, òxid nítric sintasa endotelial (eNOS). ), i els nivells d'expressió d'ARNm del factor de creixement de cèl·lules vasculars (VEGF). Vam trobar que el tractament amb BPME va disminuir el proinflamatori (factor nuclear-κ (F-κ), factor de necrosi tissular (TNF-), receptor similar al peatge-4 (TLR{-4), interleucina{{37} } (IL-1 ))i vascularinflamació(molècula d'adhesió intracel·lular (ICAM), molècula d'adhesió de cèl·lules vasculars (VCAM), expressions d'ARNm relacionades amb EDN1, IL-1). En conclusió, el tractament amb pell de remolatxa va augmentar eficaçment els factors de creixement de cèl·lules llises vasculars i el desenvolupament de microtúbuls, mentre que va disminuir els reguladors inflamatoris vasculars. BPM pot ser beneficiós per a la regeneració de cèl·lules llises vasculars, la reparació de teixits i el potencial anti-envelliment.

Paraules clau:remolatxa; estrès oxidatiu; mitocondris; angiogènesi; inflamació

Feu clic aquí per obtenir més informació

1. Introducció

L'angiogènesi és el procés fisiològic de la vasculogènesi a partir de la vasculatura existent del cos [1]. És essencial no només per al desenvolupament i reproducció embrionària, sinó també per al cicle cel·lular i la reparació dels teixits [2,3]. Tanmateix, s'associa amb la patogènesi de diverses malalties, com ara el creixement del tumor, l'artritis reumatoide i diverses malalties isquèmiques i inflamatòries [3–5]. L'endoteli vascular té un paper important en el manteniment de l'hemostàsia vascular mitjançant la regulació del to dels vasos sanguinis i les reaccions immunes i inflamatòries [6,7]. Les cèl·lules endotelials (EC) són capes monocel·lulars primes que recobreixen totes les superfícies internes dels vasos sanguinis i produeixen una varietat de molècules que actuen localment o en llocs distants [7]. L'endoteli és fonamental per a l'homeòstasi corporal, i qualsevol alteració en la resposta de les cèl·lules de l'endoteli condueix als esdeveniments primaris de processos inflamatoris i de malalties vasculars, com ara l'aterosclerosi i la hipertensió [6,8,9]. Aquestes malalties causen estrès oxidatiu, que altera l'estructura de la CE i la integritat de la funció i condueix a una disfunció endotelial [9]. Els EC de la vena umbilical humana (HUVEC) s'han utilitzat àmpliament com a model per a estudis relacionats amb l'endoteli vascular humà. A més, representen un model útil per estudiar les principals vies biològiques implicades en la funció de l'endoteli [10]. Els compostos bioactius i els fitoquímics es troben abundantment en fruites, verdures, herbes verdes i moltes plantes, que presenten nombrosos beneficis per a la salut, com ara propietats antiinflamatòries, antioxidants, anticancerígenes i angiogèniques [11–13]. En aquest sentit, la remolatxa vermella (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) pertany a la família de les Amaranthaceae i es classifica com una de les millors fonts d'alts nivells d'antioxidants [14,15]. Concretament, conté múltiples fitoquímics que són biològicament actius, inclososbetalaïnes, flavonoides,polifenols, enzims terapèutics, àcid ascòrbic, àcid dehidroascòrbic (DHAA) i nitrat inorgànic (NO3) [16–18]. A més, proporciona nutrients essencials valuosos, com ara potassi, calci, magnesi, sodi, ferro, zinc, fòsfor, coure i manganès [19]. Diversos estudis han informat que l'extracte de remolatxa vermella (arrel) té nombrosos efectes beneficiosos a causa de les seves propietats hipoglucèmiques, hipolipemiants, antiinflamatòries, antihipertensives i antiproliferatives [20–22]. Totes aquestes propietats beneficioses es poden relacionar amb les capacitats d'eliminació de radicals lliures dels compostos bioactius. Així, el consum de remolatxa vermella s'ha relacionat amb nombrosos beneficis nutricionals i per a la salut. A causa del seu valor nutricional, es pot utilitzar com a font d'aliment funcional contra l'estrès oxidatiu que indueix malalties metabòliques cròniques, com la diabetis tipus 2 i les malalties cardiovasculars [23]. Segons la revisió de la literatura, Beta vulgaris posseeix potents propietats antioxidants, immunoreguladores i angiogèniques. S'ha trobat apigenina a les fulles de remolatxa; té efectes antiproliferatius en les cèl·lules hepàtiques i intestinals, i pot millorar la comorbiditat de l'obesitat induïda per la dieta alta en greixos mitjançant l'activació d'AMPK [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] van identificar que Beta vulgaris protegeix els EC vasculars de l'estrès oxidatiu induït externament, que pot ser degut a l'efecte combinat de diversos compostos bioactius presents en aquesta planta. Fins ara, l'acció mecanicista per a la proliferació d'EC i l'efecte angiogènesi de la pela de l'arrel de Beta vulgaris s'ha investigat poc. Per tant, el nostre objectiu és dur a terme el present estudi per examinar la proliferació de cèl·lules vasculars, el desenvolupament de microtúbuls, l'estrès oxidatiu i la capacitat d'angiogènesi relacionada amb la pela de l'arrel de Beta vulgaris mitjançant l'anàlisi de la morfologia cel·lular i l'expressió gènica en HUVEC. S'exploren els efectes angiogènics de l'extracte de metanol de pell de remolatxa vermella associats amb la integritat nuclear, el desenvolupament de microtúbuls, l'eficiència mitocondrial i l'estimulació del cicle cel·lular en els EC vasculars humans.

2. Materials i Mètodes

2.1. Preparació de la remolatxa(Beta vulgaris rubra L.) Extracte de metanolLes mostres de remolatxa fresca (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) es van obtenir inicialment de botigues de verdures, Riad, Regne d'Aràbia Saudita (KSA). Les remolatxes fresques es van rentar amb aigua destil·lada per eliminar les tiges i els contaminants. La pell exterior es va pelar per retirar-la i tallar-la a trossos petits. Les mostres es van assecar en un forn d'aire calent a 40 ◦ I després es van triturar en pols amb una batedora electrònica. A continuació, es van extreure 5{{10}}{0 g de pols en una ampolla estèril que contenia 1 L de metanol (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durant 24 h a temperatura ambient a una coctelera i repetida tres vegades. Després, es va utilitzar un Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, EUA) per filtrar l'extracte. Finalment, reduint la pressió, es va separar el dissolvent de l'extracte i l'extracte es va recollir com a substància sòlida seca després de l'evaporació del metanol. La mostra extreta es va emmagatzemar a la nevera a 4 ◦ C fins a un nou ús. 2.2. Cromatografia de gasos i anàlisi d'espectroscòpia de masses L'extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) es va injectar en una columna capil·lar de sílice (30 m × {{0}}, 25 mm ID × 0 .25 µm de gruix de pel·lícula) de l'instrument GC-MS (Agilent 6890N/5973I, Califòrnia, CA, EUA) amb un detector selectiu de masses per detectar les composicions químiques. La temperatura de l'instrument es va establir com a 7{{90}} ◦C inicials, mantenint 2 min, a 305 ◦C a 20 ◦C/min, seguit de mantenir-lo durant 1 min. El temps total de funcionament del GC es va establir en 45 min amb el gas heli (99,999 per cent) com a gas portador (una taxa constant d'1,2 ml/min), 250 ◦C com a temperatura de l'injector i 230 ◦C com a font d'ions. temperatura. A partir de l'espectre GC-MS, es va calcular el percentatge relatiu del component corresponent i es van identificar els espectres de masses del component desconegut en comparació amb els 62 patrons coneguts000 disponibles al National Institute of Standard and Technology. biblioteca informàtica (NIST08). 2.3. Materials i productes químics de cultiu cel·lular Els HUVEC es van comprar a la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Es van obtenir materials de cultiu cel·lular com el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), EDTA, tripsina i altres de Gibco (Paisley, Regne Unit). La penicil·lina-estreptomicina (PS) i el sèrum boví fetal (FBS) es van comprar a Hyclone Laboratories, EUA. Els productes químics utilitzats en l'experiment de biologia molecular es van obtenir de Sigma-Aldrich, especialment, MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- bromur de difeniltetrazoli], tinció de PI i JC-1. El SYBR Green PCR Master Mix i el kit de síntesi d'ADNc es van obtenir de Qiagen (Hilden, Alemanya). 2.4. HUVEC Els HUVEC es van cultivar en DMEM i es van complementar amb un 1% de PS i un 10% de complex FBS. Les cèl·lules es van incubar en una atmosfera humidificada a 37 ◦ C, 5 per cent de CO2, i es van subcultivar aproximadament cada 3 dies. 2.5. Viabilitat cel·lular i proliferació cel·lular per assaig MTT Els HUVEC (1 × 104 cèl·lules/pou) es van cultivar amb un medi de manteniment i es van deixar adherir durant la nit en una placa de cultiu de 96-pou. Aleshores, el medi es va substituir per un nou medi de cultiu que contenia concentracions creixents de BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 i 3,2 µg/mL) segons el mapa de plaques d'assaig MTT i es va incubar durant 24 i 48 h; Les cèl·lules no tractades es van utilitzar com a controls. Després del període d'incubació, les cèl·lules experimentals es van tractar amb 20 µL/pou de 5 mg/mL de MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-bromur de difeniltetrazoli que es va dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO)) i es va incubar addicionalment durant 4 h a 37 ◦C. A continuació, es va descartar el medi i el formazà morat produït es va dissoldre en 100 µL de DMSO al 100%. L'absorbància de la solució es va mesurar mitjançant un lector de microplaques (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) a una longitud d'ona de 570 nm. El percentatge (per cent) de proliferació cel·lular es va calcular mitjançant l'equació següent: (absorbància de la mostra/absorbància mitjana del control) × 100. 2.6. Disseny experimental Segons el present assaig de proliferació cel·lular, la concentració més baixa provada de BPME (0,1 i 0,2 µg/mL) va mostrar HUVECs proliferants i morfologia de microtúbuls sense toxicitat. Es van seleccionar volums de 0,1 i 0,2 µg/mL de dosi de BPME i es van tractar amb HUVEC normals i 10 mM d'HUVEC d'estrès oxidatiu induïts per H2O2- durant 48 h per determinar la proliferació cel·lular, els potencials antiinflamatoris, angiogènics i apoptòtics. (Figura 1). El control del vehicle també es va mantenir durant 48 h en ambdós grups. La quercetina (10 µM) es va utilitzar com a control de referència en els dos grups experimentals. Després de la incubació, les cèl·lules experimentals i no tractades es van analitzar per a la morfologia cel·lular i nuclear i el potencial de membrana mitocondrial mitjançant un kit BDTM MitoScreen (JC-1); L'apoptosi es va determinar mitjançant el mètode d'ordenació cel·lular basat en l'annexina V/apoptosi en citometria companya. Es van investigar els nivells d'expressió gènica relacionats amb l'estrès oxidatiu, proinflamatori i angiogènesi.

2.7. Assaig de tinció de iodur de propidi per a danys nuclears Morfologies cel·lulars per dany nuclear característic, picnosi o canvis morfològics apoptòtics després del tractament amb 0.1 i 0.2 µg/mL de BPME (amb o sense H2O2) en HUVEC es va determinar mitjançant l'anàlisi de tinció de PI sota microscòpia de fluorescència invertida, tal com descriu Leite et al. [27].

2.8. Assaig del potencial de la membrana mitocondrial (∆ψm) per tinció de colorant JC-1 El potencial de la membrana mitocondrial (∆ψm) es va determinar mitjançant l'assaig JC-1 per avaluar l'eficiència mitocondrial en el control del vehicle i {{4} }.1 i 0.2 µg/mL de HUVEC tractats amb BPME (amb i sense H2O2). Breument, la solució de tinció JC-1 es va barrejar amb un volum similar de medi de cultiu i després es va afegir als HUVEC experimentals i es va incubar a les fosques durant 20 min a 37 ◦C. A continuació, el colorant JC-1 no lligat es va rentar suaument dues vegades amb 200 µL de tampó de rentat de tinció JC-1 a 4 ◦C. Després, es va observar l'acumulació de j-agregat contra la tinció de JC-1 sota microscòpia de fluorescència mitjançant un microscopi de fluorescència i es van capturar imatges. A més, es va mesurar el potencial de la membrana mitocondrial en citometria de flux mitjançant el kit BDTM MitoScreen (JC-1).

2.9. Anàlisi de l'annexina V/apoptosi mitjançant citometria de flux El mètode de detecció d'Annexin V/PI basat en citometria (Sigma Chemicals, EUA) es va utilitzar per quantificar cèl·lules viables, proapoptòtiques, apoptòtiques primerenques i necròtiques. Els HUVEC induïts per l'estrès oxidatiu (1 × 105/pou) es van xapar en plaques 24-pous i es van incubar amb BPME (0,1 i 0,2 µg/mL) o control de vehicle per a 48 h. Després de la incubació, les cèl·lules es van incubar en 400 µl de 5 µl d'isotiocianat de fluoresceïna d'annexina V (FITC) i 5 µl de PI que contenia tampó d'unió; després d'això, les cèl·lules es van mantenir durant 15 minuts a temperatura ambient (RT) a la foscor. Les cèl·lules es van analitzar mitjançant citometria companys (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) per identificar cèl·lules apoptòtiques (PI negatives i Annexina V positives) i apoptòtiques tardanes (PI positives i Annexina V positives) [28].

2.10. Anàlisi quantitativa de PCR en temps real El kit Fastlane® Cell to cDNA (Qiagen, Hilden, Alemanya) es va utilitzar per extreure ARN total i síntesi d'ADNc del control del vehicle, HUVEC tractats amb BPME (amb i sense H2O2) mitjançant una PCR quantitativa (qPCR) semiautomatitzada. instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Nivells d'expressió d'estrès oxidatiu que inclouen (peròxid lipídic, NOS-3), antioxidant (Nrf-2, GSK{-3 i GPx), proinflamatori (factor nuclear-κ (NF-κ), factor de necrosi tumoral (TNF-), interleucina-1 (IL{-1 ), factor de creixement de cèl·lules vasculars (VEGF), receptor de tipus toll-4 (TLR{-4)) , i la inflamació vascular (molècula d'adhesió intracel·lular (ICAM), molècula d'adhesió de cèl·lules vasculars (VCAM), EDN1 i gens relacionats amb l'òxid nítric endotelial (eNOS)) i el gen de referència, -actina, es van analitzar en HUVEC i es van quantificar pel mètode. de Yuan et al. [29]. Els valors d'amplificació (∆Ct) es van calcular mitjançant la diferència entre Ct (tractat) i Ct (control). L'expressió gènica es va representar mitjançant l'expressió del valor 2−∆∆Ct.

2.11. Anàlisi estadística Tots els experiments es van triplicar i les dades resultants es van expressar com a valors mitjans ± desviació estàndard (SD). L'anàlisi estadística de les diferències entre els grups es va realitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant el programari SPSS (versió 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Aleshores, es va realitzar la prova de comparació múltiple de Tukey si es van trobar diferències significatives. Tots els resultats es van presentar com a mitjana ± SD per a sis rèpliques a cada grup. Un valor p < 0,05="" es="" va="" considerar="" significatiu="">

Cistanche per millorar la immunitat

3. Resultats

3.1. Molècules bioactives en BPME Els constituents químics de BPME es van confirmar mitjançant GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). La composició química de l'extracte de pell de remolatxa es va determinar comparant els espectres de masses disponibles amb la base de dades espectral de l'Institut Nacional d'Estàndards i Tecnologia (NIST). Els resultats de GC-MS van confirmar que el BPME contenia hidroxiacetona (8,18 per cent), 5-hidroximetilfurfural (32,6 per cent), metil piruvat (15,13 per cent), beta-d-al·lopiranosa (1,48 per cent), furfural (9,98 per cent), 2-hidroxi-gamma-butirolactona (1,32 per cent) i 2,3-dihidro-3,{5-dihidroxi- 6-metil-4H-Pyran -4-un (12,4 per cent; figura 2a, taula 1). 3.2. Proliferació cel·lular El potencial de proliferació cel·lular in vitro de BPME contra HUVEC es presenta a la figura 2b. No es va observar cap inhibició significativa del creixement cel·lular en els grups experimentals en comparació amb el control del vehicle. El present estudi va confirmar que l'augment de la concentració de BPME tractat amb HUVEC va donar lloc a una major proliferació i viabilitat cel·lular després de 48 h (112 per cent) en comparació amb 24 h (103 per cent) de tractament. A més, les imatges microscòpiques de llum dels HUVEC tractats amb BPME després de 48 h van confirmar les cèl·lules normals amb la forma uniforme de la morfologia cel·lular adherent, es va aparentar un augment del nombre de cèl·lules proliferants (replicacions) sense cap dany (figura 2c). 3.3. Anàlisi de la morfologia cel·lular i nuclear, la formació de microtúbuls i la tinció de JC-1 en els HUVEC La figura 3 mostra la morfologia del desenvolupament dels microtúbuls en imatges microscòpiques de fluorescència FL. Els HUVEC d'estrès oxidatiu induïts per H2O2- van mostrar una proliferació pobra i una morfologia irregular de les cèl·lules adherents en comparació amb els HUVEC de control. Els HUVEC normals tractats amb 0.2 µg/mL de BPME van mostrar cèl·lules proliferants mitjançant replicació o neogènesi amb morfologia de microtúbuls. Mentrestant, la dosi de 0,1 µg/mL de cèl·lules tractades amb BPME va mostrar un 100 per cent de cèl·lules adherides amb les primeres etapes de microtúbuls. Els HUVEC amb estrès oxidatiu tractats amb 0,2 µg/mL de BPME van identificar noves cèl·lules proliferants amb morfologia de microtúbuls i una disminució del dany cel·lular oxidatiu. A més, 0,1 µg/mL de BPME també va augmentar la morfologia normal de les cèl·lules vasculars amb cèl·lules proliferants.

La figura 4a mostra la morfologia normal de l'estructura nuclear, amb forma esfèrica, en els HUVEC tractats amb BPME (0.1 o 0.2 µg/mL). La figura 4b mostra les imatges per a la tinció de PI de HUVEC normals i amb estrès oxidatiu induït per H2O2. Els HUVEC tractats amb H2O{{10}} mostren nuclis amb formes irregulars, que presenten condensació i picnosi després de 30 min. Tanmateix, 0,2 µg/mL de tractament BPME per a HUVEC sota estrès oxidatiu va mostrar nuclis circulars amb morfologia normal. En comparació amb 0,2 µg/mL d'extracte de BPME, 0,1 µg/mL de BPME van tenir un efecte protector menor contra l'estrès oxidatiu induït per H2O2- als HUVEC.

Figura 2. Resultats del cromatograma GC-MS d'extracte de metanol de pell de remolatxa (a), proliferació cel·lular in vitro (b) i imatges de microscòpia lleugera per a la morfologia cel·lular (c) en HUVEC, tractades amb una concentració creixent d'extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) ) (forma uniforme de cèl·lules adherents i proliferants esmentades per la punta de fletxa vermella). Tots els valors són mitjans ± SD (n=6). * p Menor o igual a 0,05 en comparació amb el control del vehicle.

Figura 3. Anàlisi de la formació de microtubs a partir del microscòpic de fluorescència en el control del vehicle, dosi de 0.1 i 0.2 µg/mL d'extracte metanol de pell de remolatxa (BPME) tractat normal i H2O{{6} }HUVECs d'estrès oxidatiu induïts després de 48 h. Després de 48 h, els HUVEC d'estrès oxidatiu induïts per H2O2- van mostrar una morfologia alterada en comparació amb el control del vehicle. Els volums de 0,1 i 0,2 µg/mL d'extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) tractats amb HUVEC mostraven una morfologia normal amb microtúbuls vasculars amb cèl·lules proliferants que s'assemblaven a la morfologia comuna del comportament de les cèl·lules musculars llises.

Figura 4. Anàlisi de tinció de iodur de propidi (PI) per a la morfologia nuclear en el control del vehicle, 0.1 i 0.2 µg/mL d'extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) tractat amb normal (3a) i H2O2-HUVEC (3b) induïts per estrès oxidatiu després de 48 h. En PIstaining, el control del vehicle va mostrar que el nucli semblava normal sense signes de reducció, picnosi o nucli apoptòtic. Només amb H2O2, les cèl·lules tractades van mostrar una membrana nuclear polaritzada després de 48 h. El tractament amb 0,2 µg/mL de BPME va normalitzar la polarització de la membrana nuclear induïda per H2O2-en comparació amb 0,1 µg/mL BPME o quercetina 10 µM.

La figura 5a mostra els resultats de la tinció de JC-1 per a HUVEC, incloses les cèl·lules de control i tractades amb BPME; la figura il·lustra cèl·lules sanes amb mitocondris actius, tal com es confirma per l'absorció de mitocondris carregats negativament del catiònic lipofílic extramitocondrial JC-1 (color verd) i els agregats J convertits amb color vermell intramitocondrialment. La figura 5b mostra els resultats de la tinció de JC-1 per a 0.2 µg/mL de BPME administrat a HUVEC amb estrès oxidatiu induït per H2O2; els resultats van confirmar que gairebé el 94 per cent dels mitocondris carregats negativament van convertir el JC catiònic lipòfil (color verd) en agregats J de color vermell en comparació amb 0,1 µg/mL de tractament BPME (61,4 per cent) o H2O{{20}}estrès oxidatiu induït en HUVEC (2 per cent). Es va observar que el potencial de membrana mitocondrial (MMP) era més gran a les cèl·lules tractades amb BPME en comparació amb el fàrmac de referència quercetina. 3.4. Potencial de membrana mitocondrial assistit per FACS (∆ψm; BD MitoScan) i anàlisi d'annexina V/apoptosi en HUVEC La figura 6 mostra la capacitat potencial de membrana mitocondrial en l'anàlisi BD MitoScan després de 0.2 µg/mL de tractament BPME de HUVEC normals i HUVEC amb estrès oxidatiu induït per H2O2. Vam trobar que 0,2 µg/mL de tractament amb BPME van augmentar la MMP (∆ψm) fins al 92,7 per cent ± 3,7 per cent en comparació amb els HUVEC tractats només amb H2O2 (27,9 per cent ± 7,2 per cent). En canvi, les cèl·lules tractades amb quercetina van mostrar un percentatge del 41,4% ± 1,6% d'augment de MMP (∆ψm) en comparació amb els HUVEC tractats amb BPME i H2O2 o H2O2 sols.

Figura 5. Anàlisi del potencial de la membrana mitocondrial mitjançant tinció JC-1 per al control del vehicle, 0.1 i 0.2 µg/mL d'extracte de metanol de pell de remolatxa (BPME) tractat amb normalitat (a ) i H2O2-HUVEC induïts per estrès oxidatiu (b) després de 48 h. JC{{10}}Imatges de fluorescència que mostren imatges combinades dels senyals vermells i verds del colorant, corresponents a JC-1 en agregats J en comparació amb la forma monomèrica. Hem trobat menys agregats J H2O2 només HUVEC tractats. En 0, 2 µg/mL HUVEC tractats amb BPME que mostren agregats j elevats que representen directament (MMP alt, ∆ψm) un alt potencial de membrana mitocondrial en comparació amb 0,1 µg/mL de BPME o 10 µM de quercetina.

4. Discussió

En cas d'estrès extracel·lular o intracel·lular, la biodisponibilitat de les espècies reactives d'oxigen (ROS) supera la defensa antioxidant i l'estrès oxidatiu altera la senyalització i el control redox [31]. El desenvolupament de l'estrès oxidatiu està associat a la patogènesi de trastorns crònics, com les malalties neurodegeneratives, la diabetis i l'aterosclerosi. Com per exemple, l'estrès oxidatiu inicia la disfunció endotelial i promou la inflamació sistèmica i el reclutament de macròfags [32]. Les cèl·lules immunitàries activades migren a la vasculatura i alliberen citocines i quimiocines associades a la vasoconstricció i remodelació dels vasos sanguinis de cèl·lules musculars llises i la inflamació que afecta les cèl·lules musculars llises vasculars i la paret vascular [33]. L'augment de l'estrès oxidatiu vascular acaba amb dany vascular, rigidesa de les cèl·lules musculars llises i anomalies estructurals de l'elastina. A més, l'estrès oxidatiu vascular s'ha estimulat en altres condicions patològiques, com l'obesitat visceral o l'aterosclerosi, a causa de l'augment de l'activitat de la NADPH oxidasa (NOX-2) al teixit adipós perivascular [34]. L'estrès oxidatiu vascular provoca els principals canvis epigenètics que es produeixen durant l'envelliment i acaba amb un procés d'envelliment precoç [35]. El desenvolupament de la producció de ROS i l'estrès oxidatiu al sistema biològic depèn en gran mesura de la disfunció mitocondrial, a més de NOX-2, xantina oxidasa endotelial, eNOS desacoblada i lipoxigenasa [36]. Les propietats antioxidants dels agents dietètics poden neutralitzar la generació de ROS mitjançant l'augment de la capacitat antioxidant [26]. L'extracte de Ginkgo Biloba protegeix contra el desenvolupament de l'aterosclerosi reduint la generació de ROS i l'activitat de la lipoxigenasa en la disfunció endotelial induïda per OxiLDL [37]. A més, diversos compostos fenòlics iflavonoides deLes plantes i els grans comestibles tenen la propietat d'eliminar ROS i la peroxidació lipídica [38]. L'extracte metanòlic de pela de remolatxa (Beta vulgaris) té potencial antioxidant a causa de la disponibilitat d'alta fibra, antocianines i flavonoides com la vitexina i la betanina [39]. En el present estudi, es va seleccionar BPME per identificar l'enfocament mecanicista depenent dels mitocondris per descobrir el seu efecte sobre el potencial de la membrana mitocondrial, la extinció de LPO i la inhibició dels nivells d'expressió d'ARNm relacionats amb la inflamació vascular. L'assaig MTT va confirmar que el BPME va augmentar significativament la proliferació cel·lular, com ho confirma l'augment de la integritat nuclear en la tinció de PI amb la dosi efectiva de 0.2 µg/mL de BPME en comparació amb 0.1 µg/mL provat de BPME. La identificació de la dosi efectiva amb baixa concentració i activitat més alta es pot considerar fisiològicament segura. Hem trobat una tinció microscòpica de fluorescència FL de JC-1 i el potencial de la membrana mitocondrial es va restaurar tant en HUVEC normals com H2O{{{0}}induïts per estrès oxidatiu estimulats externament després de 0,2 µg/mL de BPME. tractament. La disfunció mitocondrial altera la fosforilació oxidativa, que no aconsegueix transformar els radicals d'oxigen (O2·−) en H2O2 i H2O per la glutatió peroxidasa. A causa de la desintoxicació insuficient de ROS o la producció incontrolada de ROS, l'augment de l'estrès oxidatiu mitocondrial està relacionat amb l'aterosclerosi [40]. Els extractes de pell de remolatxa van restaurar eficaçment el potencial de la membrana mitocondrial, que va augmentar amb èxit la desintoxicació de ROS i la generació d'H2O2. L'anàlisi de tinció d'annexina V/PI va confirmar que el tractament amb BPME va mantenir el percentatge de cèl·lules viables i va millorar l'etapa de proliferació cel·lular tant en HUVEC normals com en HUVEC amb estrès oxidatiu induït per H2O2. En aquest context, Choo et al. [41] van confirmar que després de la generació excessiva de ROS o H2O2 exògena al lloc isquèmic, les cèl·lules mare mesenquimals (MSC) trasplantades poden perjudicar l'autoproliferació i la capacitat de múltiples llinatges. En medicina regenerativa, les cèl·lules musculars llises vasculars són els principals reguladors de les artèries del to contràctil mitjançant el manteniment de la resistència perifèrica arterial, els reguladors de la pressió arterial, els companys de sang i la reparació de les artèries [42]. A més, la modulació del fenotip de les EC induïda per l'edat s'associa amb una disminució de la contractilitat cel·lular i un augment de la senescència cel·lular. En cas d'estrès continu o a causa de la mecanosensibilitat reduïda, s'identifica una disminució de l'adaptació dels senyals del microambient a les cèl·lules musculars llises envellides [43]. Els resultats actuals van confirmar que el tractament amb BPME va mantenir la població cel·lular viable, com ho demostra la capacitat d'angiogènesi. La capacitat de proliferació identificada de BPME en HUVECs ha estat recolzada per la reducció de l'expressió de LPO i l'augment de les expressions gèniques antioxidants. ROS i LPO es generen inicialment a partir del complex mitocondrial (I i III) i NOX-4 durant la proliferació o diferenciació cel·lular [44]. L'excés de ROS reacciona i danya les biomolècules, especialment alterant la integritat de l'ADN genòmic, que és fonamental per a la proliferació i les funcions cel·lulars [45]. Tanmateix, s'ha confirmat que la ingesta dietètica de polifenols antioxidants, com l'epigalocatequina i el tocoferol, protegeix les cèl·lules de l'estrès oxidatiu i augmenta la capacitat de proliferació [46]. En el nostre estudi, els nivells d'expressió d'ARNm de LPO van disminuir i es va trobar que NOS-3, Nrf-2 i eNOS es van duplicar en HUVEC amb estrès oxidatiu induït per H2O2. eNOS és la isoforma predominant de la NOS, responsable de la majoria dels productes NO· a les cèl·lules musculars llises i als teixits vasculars. NO· dilata tot tipus de vasos vasculars i protegeix l'agregació plaquetària i l'adhesió de leucòcits a les CE [47]. Fins ara, hi ha hagut molts informes contradictoris sobre factors de risc cardiovascular i la disfunció endotelial s'ha associat amb una disminució o augment de l'expressió d'eNOS [48]. S'ha observat una expressió elevada d'eNOS a la malaltia vascular, que és probable que sigui conseqüència de l'excés de producció d'H2O2. L'O2·−, un producte de dismutació, pot augmentar l'expressió d'eNOS mitjançant mecanismes transcripcionals i post-transcripcionals [49]. La patogènesi de la malaltia vascular va acompanyada d'una degradació accelerada de NO· després de la reacció amb O2·− i, finalment, de la forma ONOO−, que condueix al desacoblament d'eNOS i a la disfunció de l'enzim NOX [50]. L'estrès oxidatiu ha estat suprimit pels enzims antioxidants i els nivells d'ARNm de GSK-3 i GPX s'han incrementat després del tractament amb BPME. El BPME conté múltiples fitoquímics biològicament actius, com ara betalaïnes, flavonoides, polifenols, enzims terapèutics, àcid ascòrbic, àcid dehidroascòrbic (DHAA) i nitrat inorgànic (NO3), i aquests poden estar implicats en la regulació de la capacitat antioxidant dels HUVEC. En aquest context, Cha et al. (2014) [51] van informar que l'àcid clorogènic protegeix eficaçment contra el dany de l'ADN induït per l'estrès oxidatiu en els queratinòcits humans. L'endotelina-1 (Edn{-1), un vasoconstrictor derivat de l'endoteli, realitza la migració de cèl·lules musculars llises i actua com a factor antiapoptòtic en cèl·lules amb estrès induït per òxid nítric [52,53]. Els processos de remodelació vascular, migració, proliferació i acumulació de matriu extracel·lular han estat estimulats tant per Edn-1 com per NO [54,55]. Vam observar un augment de l'expressió d'Edn-1 després del tractament amb BPME en HUVEC amb estrès oxidatiu. Amb l'estrès oxidatiu o l'acumulació de LPO, l'etapa primerenca de la inflamació vascular és l'adhesió dels leucòcits a les cèl·lules musculars llises endotelials, és important per als esdeveniments crítics d'isquèmia i aterosclerosi [56]. Està mediat per expressions VCAM i ICAM; ha estat estimulat per moltes de les quimiocines i agents de quimiotaxi, com ara expressions NF-κB, IL-1 i TNF-[57]. La inhibició de l'activació de IL-1 seguida de l'expressió de la molècula d'adhesió s'ha aconseguit mitjançant el compost fenòlic dietètic àcid elàgic [58]. El tractament amb BPME a HUVEC estimulats externament amb estrès oxidatiu va disminuir significativament els factors proinflamatoris específics de les cèl·lules vasculars, com ara els nivells d'expressió VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 i TNF. En aquest context, Crespo et al. [59] van informar que el kaempferol i la quercetina inhibien gens proinflamatoris, com les expressions VCAM, ICAM, NF-κB i IL-1, respectivament. En general, la inhibició de l'estrès oxidatiu i el potencial d'expressió gènica relacionada amb la inflamació vascular de BPME va afavorir l'expressió de factors de creixement de les cèl·lules vasculars i va ajudar potencialment a la proliferació i el creixement de les cèl·lules vasculars.

5. Conclusions

Les troballes actuals confirmen que l'augment de l'expressió de gens antioxidants es va associar amb la extinció de l'estrès oxidatiu, ajudant a superar el deteriorament de la proliferació i l'angiogènesi de HUVEC. L'all negre que conté hidroximetilfurfural suprimeix l'efecte inflamatori de l'adhesió de cèl·lules de monòcits induïda per TNF als HUVEC i suprimeix encara més la generació de ROS, l'expressió VCAM-1 i l'activació de NF-κB [60]. A més, He et al. [61] van confirmar que l'hidroximetilfurfural té el potencial de protegir els EC de la hipòxia. També s'ha identificat que la pell de remolatxa inclou flavonoides, furà i components antioxidants, com ara 5-hidroximetilfurfural, metil piruvat, furfural i 2,3-dihidro-3,5- dihidroxi-6-metil-4H-Pyran-4-un; aquests components són responsables de la capacitat antioxidant millorada i de la supressió de les molècules d'adhesió de cèl·lules musculars llises vasculars proinflamatòries. La pell de remolatxa s'ha utilitzat com a estimulant de les piscines d'antioxidants per apagar l'estímul extern o l'estímul patològic intern de l'estrès cel·lular peroxidatiu. Els nostres resultats van demostrar que els components de la remolatxa ajuden a reduir l'estrès metabòlic i la inflamació en els HUVEC, que poden ser beneficiosos per a la proliferació de cèl·lules vasculars i l'angiogènesi.

Contribucions de l'autor:

Conceptualització, LNA-H. i S.-BP; metodologia, LNA-H. i S.-BP; programari, GS; validació, LNA-H. i S.-BP; anàlisi formal, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi)i GS; investigació, LNA-H., S.-BP i AMA-D.; recursos, LNA-H.; curació de dades, S.-BP i LNA-H.; redacció: preparació de l'esborrany original, LNA-H. i S.-BP; redacció: revisió i edició, LNA-H., AMS, GS i AAA (Amna Abdullah Alotiby); visualització, S.-BPi AAA (Ali A Alshatwi); supervisió, LNA-H., i S.-BP; administració de projectes, LNA-H.; adquisició de finançament, LNA-H. Tots els autors han llegit i acceptat la versió publicada del manuscrit. Finançament: els autors agraeixen al Deganat d'Investigació Científica de la Universitat King Saud per finançar aquest treball a través del grup de recerca no RG-1442-432. Declaració de la Junta de Revisió Institucional: No aplicable. Declaració de consentiment informat: No aplicable. Declaració de disponibilitat de dades : Les dades presentades en aquest estudi estan disponibles a petició de l'autor corresponent. Conflictes d'interès: No hi ha cap conflicte d'interès per a aquest estudi.

Referències

1. Abdolmaleki, Z.; àrab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Efectes antiangiogènics de l'extracte etanòlic d'Artemisia sieberi en comparació amb la seva substància activa, l'artemisinina. mossèn Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [Ref creuat]
2. Jo, SY; Kwon, SM L'angiogènesi i les seves oportunitats terapèutiques. Mediat. Inflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenesis en càncer, malalties vasculars, reumatoides i altres. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [Ref creuat]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Factor de creixement endotelial vascular i angiogènesi. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [Ref creuat]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Aplicacions clíniques dels factors de creixement angiogènics i els seus inhibidors. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [Ref creuat]
6. Galera, HF; Webster, NR Fisiologia de l'endoteli. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [Ref creuat]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Cèl·lules endotelials vasculars humanes: un sistema model per estudiar la inflamació vascular en diabetis i aterosclerosi. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Inflamació a l'aterosclerosi: de la biologia vascular al descobriment de biomarcadors i predicció del risc. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [Ref creuat]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Disfunció endotelial: una avaluació integral. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. Un protocol per a l'aïllament i el cultiu de cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana. Nat. Protoc. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogènesi inhibida per beure te. Natura 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Propietats antioxidants i prooxidants de l'àcid ascòrbic i l'àcid gàl·lic. Química dels Aliments. 2002, 79, 307–313. [Ref creuat]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Compostos bioactius de fruites comestibles amb les seves propietats anti-envelliment: una revisió exhaustiva per allargar la vida humana. Antioxidants 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Característiques nutricionals, bioactives i fisicoquímiques de diferents formulacions de remolatxa. Addict als aliments. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Sobre l'evolució del comportament d'aparellament als arbres: depredació o clima? Am. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanina com a modulador de l'estrès oxidatiu i de la inflamació múltiples: un pigment de remolatxa amb efectes protectors sobre la patogènesi de les malalties cardiovasculars. Crit. Rev. Food Science. Nutr. 2020, 1–16. [Ref creuat]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Vegetal remarcable: el seu contingut en nitrats i fitoquímics es pot ajustar en noves formulacions per beneficiar la salut i donar suport a les teràpies de malalties cardiovasculars. Antioxidants 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. Anàlisi HPLC-ESI-MS/MS de fulles de remolatxa (Beta vulgaris) i les seves propietats beneficioses en rates amb diabetis tipus 1. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Composició química, propietats funcionals i processament de la remolatxa: una revisió. Int. J. Sci. Eng. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Potencial nutricional i funcional de Beta vulgaris cicla i rubra. Fitoterapia 2013, 89, 188–199. [Ref creuat]