Lliurament mediat per neutròfils de CAR de nanomedicaments sensibles al microentorn del tumor per a la quimioimmunoteràpia del glioblastoma

El glioblastoma (GBM) és un dels tumors sòlids més agressius i letals en humans. Tot i que s'han desenvolupat terapèutiques eficaços, com les cèl·lules T emergents del receptor d'antigen quimèric (CAR) i quimioterapèutics, per tractar diversos càncers, la seva eficàcia en el tractament amb GBM s'ha vist obstaculitzada en gran mesura per la barrera hematoencefàlica i les barreres hematoencefàliques i tumorals. Els neutròfils humans travessen eficaçment les barreres fisiològiques i mostren immunitat efectora contra patògens, però la curta vida útil i la resistència a l'edició del genoma dels neutròfils primaris han limitat la seva àmplia aplicació en immunoteràpia. Aquí fem enginyeria genètica de cèl·lules mare pluripotents humanes amb una incidència genètica mediada per CRISPR/Cas9-per expressar diverses construccions CAR anti-GBM amb dominis de senyalització específics de CD3ζ o de neutròfils específics. Els neutròfils CAR amb la millor activitat antitumoral es produeixen per lliurar i alliberar nanomedicaments sensibles al microambient del tumor de manera específica i no invasiva per orientar GBM sense necessitat d'induir inflamació addicional als llocs del tumor. Aquesta quimioimmunoteràpia combinatòria presenta activitats anti-GBM superiors i específiques, redueix el lliurament de fàrmacs fora de l'objectiu i allarga la vida útil en ratolins femenins que porten tumors. En conjunt, aquest sistema biomimètic de lliurament de fàrmacs de neutròfils CAR és una plataforma segura, potent i versàtil per tractar GBM i possiblement altres malalties devastadores.

Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor

El glioblastoma (GBM) es caracteritza per una alta taxa de mortalitat, vida curta i mal pronòstic amb una alta tendència a la recurrència1,2. L'eficàcia terapèutica tant de la cirurgia com dels fàrmacs de quimioteràpia es veu principalment obstaculitzada per l'estructura fina del cervell i la barrera fisiològica hematoencefàlica (BBB) ​​o la barrera hematoencefàlica i tumoral (BBTB)3–5. En particular, el lliurament de fàrmacs al sistema nerviós central (SNC) per tractar tumors cerebrals és molt difícil:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

La immunitat innata i la plasticitat dels neutròfils contra diversos càncers12–16, inclòs GBM, es van explorar menys que la seva aplicació com a portadors cel·lulars en el lliurament de fàrmacs8–10. Els neutròfils que circulen a la sang alberguen el microambient del tumor hipòxic (TME), on es converteixen en neutròfils heterogenis associats al tumor (TAN), un component essencial del TME immunosupressor que contribueix a la progressió del càncer i a la resistència terapèutica12,17. De manera similar als macròfags, es van trobar fenotips antitumorals N1 i pro-tumor N2 de TAN dins del TME18-21 hipòxic. S'han desenvolupat diverses estratègies terapèutiques per orientar directament els neutròfils amb un enfocament en l'esgotament o la inhibició dels neutròfils12,22, donant lloc a diversos assaigs clínics (per exemple, l'inhibidor de CCR5 Maraviroc a NCT03274804). Per tant, l'aplicació directa de neutròfils no tractats com a nanoportador pot suposar un risc addicional per als pacients amb càncer en què els neutròfils del tràfic de drogues es poden reprogramar al fenotip immunosupressor pro-tumor N2 dins de TME després d'apropar-se als llocs del tumor13,23. A més, s'han d'explorar i potenciar les activitats antitumorals intrínseques dels neutròfils naïfs per aconseguir una eficàcia terapèutica optimitzada quan s'utilitza com a portador de fàrmacs en combinació amb quimioterapèutics.

Beneficis de cistanche tubulosa-enfortir el sistema immunitari

La modificació del receptor d'antigen quimèric (CAR) ha millorat significativament les activitats antitumorals de les cèl·lules T immunes o assassines naturals (NK)24–27. Tanmateix, la seva eficàcia en tumors sòlids encara és limitada a causa de la seva relativament baixa capacitat de trànsit i penetració del tumor. La presència de BBB i BBTB fisiològics impedeix encara més l'eficàcia d'aquestes terapèutiques emergents contra GBM al cervell. Hem especulat que la combinació d'enginyeria CAR i neutròfils altament mòbils podria mantenir el seu fenotip antitumoral N1 i donar una excel·lent eficàcia terapèutica en el tractament de GBM. Els neutròfils primaris són de curta durada i són resistents a l'edició del genoma28, la qual cosa limita la seva aplicació en la immunoteràpia dirigida per CAR. Les cèl·lules mare pluripotents humanes (hPSC), més accessibles per a l'edició de gens i capaços de diferenciar-se massivament en neutròfils, podrien proporcionar una font il·limitada de neutròfils CAR d'alta qualitat per a la immunoteràpia dirigida en condicions definides químicament i lliures de xeno29. Els neutròfils també fagociten preferentment patògens microbians amb superfícies rugoses o llargues, com S. aureus i E. coli30, que s'han de tenir en compte per al disseny de nanopartícules en el lliurament de fàrmacs mediat per neutròfils. De fet, Safari et al. recentment va informar de la fagocitosi preferida de partícules allargades administrades per via intravenosa, sense modificacions de superfície complicades, mitjançant neutròfils circulants30. Un disseny tan fàcil i bioinspirat en nanopartícules carregades de fàrmacs pot maximitzar la càrrega de fàrmacs en neutròfils i permetre nivells terapèutics de lliurament de fàrmacs en llocs orientats.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>El 20% dels nanomedicaments administrats són lliurats als tumors cerebrals mitjançant neutròfils CAR, en comparació amb l'1% dels nanomedicaments gratuïts. En resum, el nostre sistema de lliurament de fàrmacs CAR-neutròfils biomimètic és una plataforma segura, potent i versàtil per tractar GBM i altres malalties devastadores.

Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor

Resultats

Detecció d'estructures CAR específiques de neutròfils per a activitats antitumorals millorades

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >El 90% i la majoria dels clons dirigits són heterozigots (figura suplementària 1a-d). L'expressió CAR a les hPSC dissenyades es va confirmar encara més mitjançant RT-PCR i anàlisi de citometria de flux de CLTX-IgG4 (figura suplementària 1e-g). Com era d'esperar, els hPSC que expressaven CAR van conservar nivells elevats d'expressió de marcadors pluripotents, inclosos OCT4, SSEA4 i SOX2 (figura suplementària 1f).

Per produir neutròfils CAR de nou, les hPSC que expressen CAR es van diferenciar primer en progenitors hematopoètics multipotents i després mieloides amb tractament amb citocines específics per a l'etapa35 (Fig. 2c). L'ocupació posterior de G-CSF i agonista de l'àcid retinoic AM580 va promoure una producció robusta de neutròfils36. De manera similar als seus homòlegs a la sang perifèrica (PB), els neutròfils CLTX-CAR derivats de hPSC presentaven la morfologia típica dels neutròfils i els marcadors de superfície CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b i CD18 (figura suplementària 2). A continuació, vam determinar els efectes de l'expressió CAR sobre la citotoxicitat antitumoral dels neutròfils derivats de hPSC cocultivant-los amb cèl·lules U87MG de glioblastoma (GBM) in vitro. Com era d'esperar, els neutròfils CLTX-CAR derivats de hPSC van presentar una capacitat de destrucció de tumors millorada en comparació amb els neutròfils PB (Fig. 2d), d'acord amb les observacions anteriors a les cèl·lules CLTX CAR-T27. Entre aquests diferents CAR, el CAR #1 va mediar activitats superiors de destrucció de tumors en neutròfils hPSC. En particular, el CAR #4 basat en cadena és el menys efectiu per desencadenar la matança de tumors mediada per neutròfils, cosa que pot ser degut a la còpia inferior d'ITAM a la subunitat ζ i a una menor expressió de CAR que porten a la superfície cel·lular28. Els neutròfils alliberen espècies reactives d'oxigen citotòxiques (ROS) i factor de necrosi tumoral (TNF-) per matar les cèl·lules diana. La producció de ROS i TNF- (Fig. 2e, f) a partir de diferents neutròfils va coincidir bé amb la seva citòlisi augmentada. Com era d'esperar, la producció de ROS i TNF- a partir de diferents neutròfils després del cocultiu amb cèl·lules glials SVG p12 normals es va mantenir tan baixa com el grup de control negatiu (figura suplementària 3a, b). A més, només es va observar una citotoxicitat antitumoral millorada dels neutròfils CAR en la co-incubació amb cèl·lules GBM, incloses les cèl·lules U87MG, GBM43 adultes primàries i les cèl·lules SJ-GBM2 pediàtriques (figura suplementària 3c), demostrant l'alta especificitat del nostre CLTX. - COTXE. En particular, els neutròfils CAR presentaven una alta biocompatibilitat amb cèl·lules glials SVG p12 normals, hPSC i cèl·lules derivades de hPSC (figura suplementària 3d), d'acord amb una observació anterior que els neutròfils primaris inactivats no maten les cèl·lules sanes16. Col·lectivament, els neutròfils CAR derivats de hPSC, especialment els neutròfils CAR que contenen CD3ζ, van presentar una citotoxicitat antitumoral millorada i van produir més ROS i TNF in vitro, destacant el seu potencial en la immunoteràpia dirigida.

Fig. 1|Esquema de l'eficàcia anti-glioblastoma millorada mitjançant immunoteràpia combinatòria de neutròfils CAR i nanomedicaments sensibles al microambient tumoral. Les cèl·lules mare pluripotents humanes es van dissenyar amb CAR i es van diferenciar en neutròfils CAR carregats amb nanopartícules de sílice rugoses (SiO2 NPs) que contenen tirapazamina (TPZ) o altres fàrmacs, com a immunoquimioteràpia dual. b Els NP TPZ de CAR-neutrophil@R-SiO2- administrats sistèmicament ataquen primer les cèl·lules tumorals normoxiques externes formant sinapsis immunològiques i maten les cèl·lules tumorals mitjançant la fagocitosi. Després de l'apoptosi, els neutròfils CAR podrien alliberar NP R-SiO2-TPZ, que són superats per cèl·lules tumorals. Després, els nanoprofàrmacs responen al microentorn del tumor hipòxic i maten de manera efectiva les cèl·lules tumorals. Ortosilicat de tetraetil TEOS, tetrasulfur de bis[3-(trietoxisilil)propil] BTES, tirapazamina TPZ, benzotriazinil BTZ.

Els neutròfils CAR van mantenir activitats antitumorals superiors en microambients tumorals immunosupressors

De manera similar als macròfags, es van trobar fenotips antitumorals N1 i pro-tumor N2 de neutròfils associats al tumor dins del microambient tumoral immunosupressor17. Els neutròfils pro-tumor N2 tenen un paper crític en l'angiogènesi tumoral, la metàstasi i la immunosupressió, però l'orientació terapèutica d'aquest tipus de cèl·lules ha estat un repte.

En lloc d'una estratègia d'esgotament sistèmic22, aquí vam avaluar el potencial de l'enginyeria CAR per mantenir el fenotip antitumoral dels neutròfils. Els neutròfils derivats de CAR hPSC i PB es van tractar amb hipòxia (3% O2) i TGF, que contribueixen a la immunosupressió del microambient tumoral37,38, per avaluar la seva activitat sostinguda de destrucció del tumor. Tot i que els neutròfils PB presentaven una citòlisi significativament disminuïda contra les cèl·lules GBM en condicions immunosupressores, els neutròfils CAR van mantenir activitats de destrucció de tumors elevades (figura suplementària 4a). També es van fer observacions similars en l'alliberament de TNF i la generació de ROS (figura suplementària 4b, c) a partir de neutròfils PB o CAR en condicions immunosupressores i normals. Per confirmar encara més el fenotip dels neutròfils en condicions hipòxiques i de TGF, vam mesurar l'expressió d'iNOS específica de N1-i N2- N2-arginasa específica als neutròfils aïllats mitjançant citometria de flux (figura suplementària Fig. 4d-f). En comparació amb la normòxia, la hipòxia immunosupressora i el TGF van disminuir significativament els nivells d'expressió d'iNOS i van augmentar els nivells d'arginasa en els neutròfils PB, mentre que els neutròfils CAR van mantenir nivells d'expressió elevats d'iNOS. Estudis anteriors indiquen que l'activació de la via de senyalització Syk-Erk condueix a la producció de ROS39–42. Per tant, vam detectar i comparar l'activació de Syk-Erk en neutròfils i neutròfils CAR no modificats, i els nostres resultats van suggerir una activació significativament més alta de la via Syk-Erk en neutròfils CAR sota hipòxia (figura suplementària 5a-d), que pot mantenir-se. la producció sense canvis de ROS de neutròfils CAR sota hipòxia. En conjunt, els neutròfils CAR van mantenir un fenotip antitumoral i van mantenir activitats antitumorals elevades en condicions que imitaven el microambient tumoral in vitro, destacant el seu potencial en la immunoteràpia dirigida.

Fig. 2|Detecció d'estructures del receptor d'antigen quimèric (CAR) específic de neutròfils amb activitats antitumorals millorades mediades per neutròfils. a Esquema de diverses estructures CAR. b Esquema de la construcció CAR #1 i l'estratègia d'inserció dirigida al lloc de port segur AAVS1 de cèl·lules mare pluripotents humanes (hPSC). La fletxa vertical indica el sgRNA orientat a l'AAVS1. Les fletxes horitzontals vermelles i blaves indiquen primers per avaluar l'eficiència de l'orientació i l'homozigositat, respectivament. HDR: reparació de recombinació homòloga. c Esquema de la diferenciació optimitzada de neutròfils a partir de hPSC en condicions definides químicament. d Es van realitzar assajos de citotoxicitat contra cèl·lules de glioblastoma U87MG amb diferents proporcions de neutròfils a diana tumoral utilitzant neutròfils indicats. Les dades es representen com a mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques independents, prova t de Student de dues cues. Es va determinar la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) (e) i l'anàlisi ELISA de l'alliberament de TNF (f) de diferents neutròfils després del cocultiu amb cèl·lules U87MG. n=5 mostres biològicament independents. Les dades es representen com a mitjana ± SD, prova t de Student de dues cues. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font.

Preparació i caracterització de neutròfils CAR hPSC carregats amb nanopartícules de SiO2 que contenen tirapazamina (TPZ)

Els neutròfils PB s'han utilitzat com a portadors cel·lulars per lliurar imatges i fàrmacs terapèutics als tumors cerebrals8-10, tot i que la infiltració de neutròfils dirigida requereix inflamació induïda per cirurgia o llum i el lliurament de fàrmacs fora de l'objectiu pot ser una preocupació11. Per millorar encara més les activitats antitumorals dels neutròfils CAR, vam preparar nanopartícules de sílice (SiO2-NP) amb una superfície rugosa o llisa per carregar fàrmacs quimioterapèutics o de radiació als neutròfils. Les imatges del microscopi electrònic de transmissió (TEM) van demostrar que les dues nanopartícules de SiO2 estaven ben disperses i presentaven una morfologia esfèrica amb una mida uniforme (Fig. 3a, Fig. 6a suplementària). L'anàlisi de la distribució de la composició mitjançant TEM d'escaneig (STEM) amb espectroscòpia de raigs X (EDS) dispersa per energia va mostrar que l'element de sofre (S) es distribuïa uniformement dins de totes les nanopartícules rugoses de SiO2 (R-SiO2) (Fig. 3b). Utilitzant isotermes d'adsorció-desorció de nitrogen (N2) i l'anàlisi corresponent de la distribució de la mida dels porus, es van mesurar les mides dels porus de R- i SSiO2 NPs com a 25 nm i 35 nm (Fig. 3c, Fig. 6b suplementària), respectivament. Atesa l'elevada superfície i la gran mida dels porus, els fàrmacs terapèutics es podrien carregar eficaçment tant en R- com en S- SiO2 NPs, com s'exemplifica amb la tirapazamina (TPZ) sensible a la hipòxia (figura 3d, figura suplementària 6c). . Després de la càrrega de TPZ, no es van observar canvis significatius en la dispersitat, la morfologia i la mida de R-SiO2-TPZ mitjançant TEM i anàlisi dinàmica de dispersió de la llum (figura suplementària 6d, e). Els enllaços tetra-sulfur incorporats als NP R-SiO2 són sensibles als entorns reductors i es poden degradar ràpidament per la gran quantitat de glutatió (GSH) present a les cèl·lules tumorals43. A continuació, vam determinar la degradabilitat sensible a GSH dels NP R-SiO2-TPZ en presència de 10 mM, 1 mM i 10 μM de GSH, que eren les mateixes que les condicions intracel·lulars de les cèl·lules canceroses, les cèl·lules normals i els entorns extracel·lulars43, respectivament. Després del tractament amb 10 mM de GSH, l'estructura esfèrica inicial dels NP R-SiO2-TPZ es va destruir greument després de 24 hores (figura suplementària 6f, g). Les nanopartícules es van desintegrar completament en petits residus després de 48 h, donant lloc a l'alliberament de TPZ d'una manera sensible a GSH (Fig. 3e). Els residus de R-SiO2 NPs no van causar cap citotoxicitat significativa a les cèl·lules provades in vitro (figura suplementària 6h), cosa que indica la seguretat relativa dels R-SiO2 NPs.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

A continuació, vam avaluar la viabilitat d'utilitzar NPs SiO2-TPZ per carregar fàrmacs terapèutics en neutròfils CAR com a quimioimmunoteràpia combinatòria per aconseguir una eficàcia terapèutica augmentada. Després de la centrifugació, vam mesurar l'absorció cel·lular de SiO2-TPZ NPs pels neutròfils mitjançant un microscopi de fluorescència i anàlisi de citometria de flux (Fig. 3f, g) i vam detectar una captació cel·lular més significativa de R-SiO2-TPZ NPs que S-SiO2- TPZ NP per neutròfils. El contingut de Si cel·lular en neutròfils es va mesurar com 11,3 i 19,1 ng de proteïna Si/ug per a SiO2 NPs@TPZ suau i rugós (Fig. 3h), respectivament, mitjançant espectrometria de masses de plasma acoblada inductivament (ICP-MS). Donada la seva alta capacitat de càrrega en neutròfils, es van utilitzar NP R-SiO2-TPZ per a experiments posteriors. A continuació, vam intentar provar les funcions fisiològiques dels neutròfils CAR després de carregar els NP R-SiO2-TPZ. No es van observar canvis en la viabilitat cel·lular (Fig. 3i, Fig. 6i suplementària), la capacitat de migració transwell (Fig. 3j), la quimiotaxi i la velocitat corresponent (Fig. 3k, l) dels neutròfils CAR abans o després de carregar R-SiO2 –TPZ NPs, demostrant la seva alta biocompatibilitat. També es va realitzar una anàlisi de càrrega de nanomedicaments depenent del temps i el contingut de càrrega màxim es va assolir a 1 h després de la incubació de la cèl·lula-NP (figura suplementària 7a). Més del 95% dels neutròfils CAR es van carregar amb èxit amb R-SiO2-TPZ NPs (figura suplementària 7b). El nivell d'expressió de CD11b, una proteïna de superfície de neutròfils que media la funció d'adhesió i migració a l'estimulació de molècules inflamatòries, no es va canviar en els neutròfils CAR amb o sense càrrega R-SiO2-TPZ (figura suplementària 7c, d). Superòxid o espècies reactives d'oxigen (ROS) s'alliberen dels neutròfils actius per matar microbis i cèl·lules tumorals44. Com era d'esperar, la generació de ROS pels neutròfils CAR es va augmentar significativament després del tractament amb N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP), i no es van observar diferències significatives en la producció de ROS pels neutròfils CAR abans i després de carregar R-SiO2- TPZ (Fig. 3m). En conjunt, les nostres dades van demostrar que els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ mantenien les activitats fisiològiques dels neutròfils de tipus salvatge i podien migrar activament cap a estímuls inflamatoris, destacant el seu potencial en la quimioimmunoteràpia dirigida contra el càncer.

Els neutròfils CAR carregats amb nanopartícules R-SiO2-TPZ maten eficaçment les cèl·lules del glioblastoma

A continuació, vam avaluar l'efecte de R-SiO2-TPZ sobre la capacitat de matar tumors dels neutròfils CAR. La interacció íntima efector-objectiu era un requisit previ per a la citòlisi mediada per neutròfils. Com era d'esperar, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ va formar sinapsis immunes amb cèl·lules tumorals en 2 hores i va mostrar números d'interacció efector-objectiu similars als neutròfils CAR sense fàrmacs (figura 4a, figura suplementària 8) . En particular, no es van trobar interaccions observables entre els neutròfils CAR-RSiO2-TPZ i les cèl·lules somàtiques no canceroses (figura suplementària 8), posant de manifest l'especificitat de CLTX-CAR contra els tumors cerebrals. A més, els NP R-SiO2-TPZ es van alliberar dels neutròfils al medi de cultiu (figura suplementària 9a, b) 12 hores després del cocultiu i van entrar a les cèl·lules tumorals restants (figura 4a). Vint-i-quatre hores després de la co-incubació de neutròfils CAR carregats de SiO2-TPZ NP amb cèl·lules tumorals, fins al 95% de les cèl·lules tumorals contenien R-SiO2-TPZ NPs (Fig. 4a, Fig. 9c suplementària), cosa que indica un èxit. cascada de transport que implica neutròfils portadors que exerceixen la seva funció de cèl·lules efectores i pateixen apoptosi, alliberant així de manera passiva els NP R-SiO2-TPZ a les cèl·lules tumorals diana45. També vam validar la funció de resposta hipòxica i la citotoxicitat de la TPZ pro-fàrmac dins de les cèl·lules tumorals mitjançant l'anàlisi d'espectroscòpia de ressonància paramagnètica electrònica (EPR) de la generació de radicals a partir de TPZ (figura suplementària 9d) i l'anàlisi de citometria de flux de TOPRO-3 al tumor. cèl·lules (figura suplementària 9e) sota hipòxia i normòxia. Per determinar la citòlisi dels neutròfils CAR carregats de R-SiO2-TPZ NP, vam implementar un model de repte de tumor de normòxia-hipòxia in vitro (Fig. 4b). Vint-i-quatre hores després del cocultiu normòxic, els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NPs o no presentaven una citotoxicitat antitumoral similar (Fig. 4c), i tots dos eren superiors a la dels neutròfils PB carregats amb R. -SiO2-TPZ NPs o no i R-SiO2- TPZ NPs sols. La citotoxicitat millorada es deu principalment a l'augment de la capacitat d'orientació tumoral dels neutròfils després de l'enginyeria CAR. Després d'un cocultiu hipòxic de 12 i 24-h addicionals amb cèl·lules tumorals, els neutròfils CAR carregats de R-SiO2-TPZ NP van mostrar una capacitat antitumoral superior en comparació amb altres grups (figura 4d, e). A més, els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NPs van mostrar una excel·lent citòlisi contra cèl·lules tumorals fresques re-sembrades (Fig. 4f), cosa que indica la capacitat antitumoral del R-SiO2-TPZ alliberat. nanopartícules després de l'apoptosi dels neutròfils.

A continuació, vam realitzar una anàlisi de seqüenciació d'ARN (ARN-seq) a les cèl·lules tumorals per dilucidar el mecanisme molecular potencial subjacent a la citòlisi antitumoral millorada dels neutròfils mitjançant l'expressió CAR i els NPs R-SiO2-TPZ. L'anàlisi de l'expressió gènica va demostrar que, en comparació amb els NPs control i R-SiO2-TPZ, els neutròfils CAR carregats amb o sense R-SiO2-TPZ NPs van disminuir significativament l'expressió del citoplasma i els gens de membrana a les cèl·lules tumorals ( Fig. 10a suplementària, figura 4g), donant suport encara més a la seva fagocitosi de cèl·lules tumorals després del cocultiu. Tot i que tots els grups experimentals van augmentar l'estrès oxidatiu cel·lular a les cèl·lules tumorals, els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ van superar els altres grups en desencadenar la senyalització de l'estrès oxidatiu. A més, els neutròfils CAR carregats de R-SiO2-TPZ van promoure significativament l'apoptosi i van reduir la proliferació a les cèl·lules tumorals. Per entendre millor les activitats antitumorals millorades dels neutròfils CAR carregats de R-SiO2-TPZ, hem aplicat un inhibidor de la fagocitosi citocalasina D i un eliminador d'espècies reactives d'oxigen (ROS) N-acetil-cisteïna (NAC) i un inhibidor de ROS GSK2795039 al cocultiu tumoral-neutròfil. La citòlisi de cèl·lules tumorals per neutròfils CAR es va reduir significativament amb 5 μM de citocalasina D, 5 mM de NAC i 100 nM de GSK2795039 (figura suplementària 10b, c), cosa que indica el paper destacat de la fagocitosi i ROS a la cèl·lula tumoral mediada per neutròfils CAR. matant. El 40%-50% restant de lisi de cèl·lules tumorals en presència de neutròfils i NAC o GSK2795039 indica la implicació del mecanisme independent de ROS en la matança de tumors mediada per neutròfils que val la pena investigar més.

Fig. 3|Preparació i caracterització de neutròfils CAR hPSC carregats amb nanopartícules de SiO2 que contenen tirapazamina (TPZ). Es mostren imatges de mapeig elemental de microscopi electrònic de transmissió (TEM) (a) i espectroscòpia dispersiva d'energia (EDS) (b) de nanopartícules rugoses de SiO2. c Es mostra la isoterma d'adsorció-desorció de nitrogen de nanopartícules rugoses de SiO2 juntament amb el diagrama de distribució de la mida de porus de Barrett-JoynerHalenda (BJH). Els triplicats biològics es van realitzar de manera independent. El contingut de càrrega de TPZ en nanopartícules de SiO2 (d) i l'alliberament de TPZ sensible al glutatió (GSH)--es va mesurar en el moment indicat. n=3 mostres biològicament independents. Anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) per a (e). Imatges de fluorescència (f) i anàlisi de citometria de flux (g) de neutròfils carregats amb SiO2-TPZ suau i rugós. Els triplicats biològics es van realitzar de manera independent. h Es va mesurar el contingut cel·lular de SiO2 en neutròfils CAR derivats de hPSC. n=5 mostres biològicament independents, prova t de Student de dues cues. Viabilitat cel·lular (i), n=3 mostres biològicament independents, transmigració (j), n=5 mostres biològicament independents, capacitats de quimioatracció (k, l), n=20 mostres biològicament independents i Es va mostrar la capacitat de generació de ROS (m) de neutròfils CAR derivats de hPSC carregats amb o sense SiO2-TPZ rugós, n=5 mostres biològicament independents, prova t de Student de dues cues. PMA: acetat de miristat de forbol. Totes les dades d'aquesta figura es representen com a mitjana ± SD. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font.

Avaluació funcional de neutròfils CAR carregats amb nanomedicaments mitjançant models de glioblastoma biomimètics in vitro

Per avaluar encara més les activitats dels neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP, vam implementar un model de tumor de barrera hematoencefàlica (BBB) ​​basat en transwell mitjançant cèl·lules endotelials microvasculars cerebrals humanes (figura 5a, figura suplementària). . 11a). Com era d'esperar, els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP van mostrar una excel·lent capacitat de transmigració a través del model BBB in vitro (Fig. 5b), matant eficaçment les cèl·lules tumorals dirigides després de la transmigració tant en condicions normòxiques com hipòxiques (Fig. 5c). , d) i alliberant més citocines inflamatòries (Fig. 5e) que poden atraure altres cèl·lules efectores per matar les cèl·lules tumorals. A més, els neutròfils CAR no van afectar significativament la viabilitat de les cèl·lules endotelials després de la transmigració (figura suplementària 11b). Els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP van conservar una excel·lent capacitat de transmigració durant el segon experiment de transmigració (Fig. 5f) i una capacitat antitumoral superior en comparació amb altres grups (Fig. 5g). A continuació, es va utilitzar un model d'esferoide tumoral tridimensional (3D) per avaluar la capacitat de penetració del tumor dels neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP (Fig. 5h). Els neutròfils CAR van emigrar gradualment cap al centre de l'esferoide tumoral i es van distribuir uniformement a l'esferoide després de 8 h d'incubació (Fig. 5i). Es va observar un alt grau de co-localització entre els neutròfils CAR i els NP R-SiO2-TPZ (figura suplementària 12a-c), demostrant que els NPs R-SiO2-TPZ estaven encapsulats de manera estable al CAR -neutròfils durant la infiltració tumoral abans de la seva citòlisi. Sense el lliurament mediat per neutròfils, els NP R-SiO2-TPZ només es van trobar a la capa exterior dels esferoides tumorals. En comparació amb els NPs R-SiO2-TPZ i els neutròfils CAR, els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP van mostrar una citòlisi antitumoral superior al model de tumor 3D (Fig. 5j). Els NP dels neutròfils CAR-R-SiO2 també es poden utilitzar per administrar altres fàrmacs, com ara temozolomida clínica (TMZ) i JNJ- 64619187, en models de tumors 3D i matar de manera eficient les cèl·lules GBM (figura suplementària 12d-f). En conjunt, els neutròfils CAR combinatoris i els nanomedicaments van mostrar excel·lents activitats antitumorals en el microambient tumoral biomimètic que imitava condicions in vitro, destacant el potencial terapèutic de la quimioimmunoteràpia combinatòria basada en neutròfils.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Distribució in vivo de nanopartícules R-SiO2-TPZ de neutròfils CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >El 20% dels nanomedicaments administrats es van lliurar als tumors cerebrals per neutròfils CAR, en comparació amb l'1% per nanomedicaments gratuïts, que és coherent amb els informes anteriors6. El lliurament dirigit de R-SiO2-TPZ NPs al cervell hoste a través de BBB per part dels neutròfils CAR també es va confirmar mitjançant l'anàlisi histologia (Fig. 6d). Per contra, els NP R-SiO2-TPZ només s'acumulen principalment al fetge i la melsa. Col·lectivament, les nostres dades van demostrar un lliurament objectiu millorat de R-SiO2-TPZ NPs per neutròfils CAR sense necessitat d'induir inflamació addicional al lloc del tumor, posant de manifest la viabilitat i seguretat de la quimioimmunoteràpia basada en neutròfils en el tractament del càncer.

La quimioimmunoteràpia combinatòria de neutròfils CAR i nanopartícules R-SiO2-TPZ va mostrar excel·lents activitats anti glioblastoma in vivo

Per determinar l'eficàcia terapèutica dels neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ NP, es va establir un model de xenograft in situ de glioblastoma als ratolins NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) mitjançant cèl·lules que expressen luciferasa U87MG. Els ratolins portadors de tumors es van administrar per via intravenosa 5 × 106 neutròfils setmanals (Fig. 7a) i es va mesurar i quantificar la càrrega tumoral als hostes (Fig. 7b, c). En comparació amb els ratolins tractats amb PBS o amb neutròfils PB, el tractament amb neutròfils CAR i NPs CAR neutrophil@R-SiO2–TPZ va frenar eficaçment el creixement del tumor. Els neutròfils CAR @R-SiO2–TPZ NPs van mostrar una citotoxicitat antitumoral molt més alta que qualsevol altre grup experimental. Per contra, els neutròfils PB van promoure significativament el creixement del tumor al cervell, donant lloc a la mort de ratolins portadors de tumors ja el dia 23 (Fig. 7d), cosa que suggereix que els neutròfils no dissenyats poden suposar riscos addicionals. A continuació, vam mesurar l'alliberament de citocines humanes al plasma de diferents grups de ratolins experimentals (Fig. 7e). Tots els grups experimentals no PBS van produir TNF i IL{28}} detectables al plasma des del dia 5 fins al dia 26, cosa que suggereix l'activació de neutròfils humans després de l'estimulació del tumor. D'acord amb la taxa de creixement tumoral més alta observada, els neutròfils no modificats van alliberar gradualment més IL-6 i TNF, cosa que pot provocar la síndrome d'alliberament de citocines en pacients i requerir estudis de seguretat més profunds amb bloquejadors IL-646,47. . En particular, els NP de CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ van mostrar una disminució de la capacitat de producció de citocines en moments posteriors (dia 19 i dia 26), cosa que suggereix un risc potencialment baix de síndrome d'alliberament de citocines en pacients tractats amb quimioimmunoteràpia basada en neutròfils CAR. La biocompatibilitat dels neutròfils CAR combinatoris i els NP R-SiO2-TPZ es va avaluar mitjançant la mesura setmanal del pes corporal i el seguiment dels canvis patològics en els òrgans principals dels ratolins. No es va observar cap diferència en el pes corporal entre els ratolins tractats amb CAR neutròfils@R-SiO2–TPZ NP i cap altre grup experimental (Fig. 7f), cosa que indica una toxicitat sistèmica mínima i una excel·lent biocompatibilitat dels neutròfils CAR@R-SiO2–TPZ NPs dins de 28 dies de tractament. L'anàlisi histològica dels òrgans principals tallats de ratolins el dia 30 va mostrar que els ratolins tractats amb CAR-neutròfils@R-SiO2-TPZ NP no van causar anormalitats notables ni danys en els òrgans al cor, fetge, melsa, pulmó i ronyó (figura suplementària Fig. 13), confirmant encara més la seguretat dels neutròfils CAR combinatoris i dels NP R-SiO2-TPZ.

Fig. 4|Els neutròfils CAR carregats amb nanopartícules R-SiO2-TPZ maten eficaçment les cèl·lules del glioblastoma. Es van mostrar imatges representatives de sinapsis immunològiques indicades per l'acumulació d'actina F polaritzada a la interfície entre els neutròfils CAR i les cèl·lules tumorals a les 6, 12 i 24 h. Les nanopartícules R-SiO2-TPZ alliberades dels neutròfils CAR després de la fagocitosi de les cèl·lules tumorals van ser captades per cèl·lules tumorals. Els triplicats es van realitzar de manera independent. b Esquema de l'assaig de citotoxicitat antitumoral mediat per neutròfils. La citotoxicitat contra les cèl·lules de glioblastoma U87MG es va realitzar en diferents proporcions de neutròfils a objectiu tumoral mitjançant neutròfils indicats a 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) i 72 h (f). n=3 mostres biològicament independents. Les dades es representen com a mitjana ± SD, anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). g Es va realitzar una anàlisi de seqüenciació d'ARN a granel a cèl·lules U87MG en diverses condicions. El mapa de calor mostra els nivells d'expressió del citoplasma seleccionat, la membrana, l'estrès oxidatiu, l'apoptosi i els gens relacionats amb la proliferació a les cèl·lules de glioblastoma indicades. n=2 mostres biològicament independents. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font.

Fig. 5|Avaluació funcional de neutròfils CAR carregats amb nanopartícules R-SiO2-TPZ mitjançant models de glioblastoma biomimètic (GBM) in vitro. un Esquema del nostre model de tumor in vitro de GBM amb barrera hematoencefàlica (BBB), que es compon de cèl·lules endotelials a la membrana d'inserció cel·lular i cèl·lules tumorals a la part inferior del mateix transwell. b Es mostra l'anàlisi de migració Transwell dels neutròfils a les 12 h. Es va mesurar i quantificar la citotoxicitat anti-GBM dels neutròfils indicats a les 24 h (c) i 36 h (d). Es va realitzar una anàlisi ELISA d'IL-6 i TNF alliberat dels neutròfils indicats a les 36 h. f Es mostra la segona migració de diferents neutròfils a les 48 h. g Es va mesurar i quantificar la citotoxicitat anti-GBM dels neutròfils indicats a les 60 h. h–j L'esquema del model de tumor tridimensional (3D) infiltrat amb neutròfils es va mostrar a (h). Es van mostrar imatges fluorescents representatives de neutròfils infiltrats en els models de tumors 3D. DAPI es va utilitzar per tenyir la cèl·lula nuclear i CD45 es va utilitzar per tenyir neutròfils. Barres d'escala, 200 μm. Els triplicats biològics es van realitzar de manera independent. j Es va mesurar i quantificar la corresponent capacitat de destrucció de tumors dels neutròfils indicats mitjançant un kit de citotoxicitat. Les dades es representen com a mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques independents, anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font.

Si bé els NPs CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ van frenar significativament el creixement del tumor en ratolins xenograft, la diferència en la supervivència animal en grups experimentals de CAR-neutròfils, SiO2–TPZ NPs i CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ NPs és insignificant. (p > 0.05), que possiblement es deu a la mort de neutròfils de curta durada durant la preparació i la injecció cel·lular. A continuació, ens vam centrar en aquests tres grups i vam determinar si la reducció del temps de preparació cel·lular i l'augment de les dosis de neutròfils CAR i nanomedicaments farien alguna diferència en la supervivència dels animals (Fig. 7g). Quan es van administrar sistemàticament 6 vegades, els NP CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ van superar els altres dos grups en l'allargament de la vida útil dels ratolins portadors de tumors (Fig. 7h), mentre que la diferència de supervivència animal en grups de neutròfils CAR i SiO2- Els NP TPZ es van mantenir insignificants. Si bé es va observar una corba de supervivència similar del grup R-SiO2- TPZ entre aquests dos estudis independents amb animals, es va reduir el temps d'aïllament cel·lular i la preparació per a la injecció d'un total de ~ 4 hores a 1 hora durant els primers 4 neutròfils. Les dosis van conduir a una millora de la supervivència dels animals en grups de neutròfils CAR abans del dia 32. Col·lectivament, les nostres dades van demostrar la importància de la preparació de neutròfils i l'optimització de la dosi en futures aplicacions clíniques de la terapèutica dels neutròfils.

Discussió

S'ha demostrat que els neutròfils del ratolí són un potent portador per lliurar de manera eficient nanomedicaments als tumors cerebrals inflamats postoperatoris8,9. Tot i així, la viabilitat i la seguretat de l'ús de neutròfils humans en el lliurament de fàrmacs segueixen sent difícils de fer. La gran quantitat de neutròfils de ratolí (10 vegades superior al nombre total de neutròfils circulants en ratolins11) utilitzats en aquests estudis per aconseguir un benefici terapèutic pot dificultar encara més la seva traducció clínica, ja que l'extracció d'un gran nombre de neutròfils de pacients amb càncer pot provocar neutropènia i posar. altres riscos. Per abordar aquests reptes, vam aprofitar el poder de les hPSC autorenovables per obtenir neutròfils humans de nou il·limitats29. Hem desenvolupat un potent sistema de lliurament de fàrmacs mediat per neutròfils bioinspirats amb CAR-Engineering29 i hem utilitzat neutròfils CAR humans dissenyats com a nanoportador amb activitats antitumorals sorprenents. Els NPs de SiO2 rugosos funcionen millor que els NPs de SiO2 suaus en portadors de neutròfils CAR, d'acord amb observacions anteriors que els neutròfils fagociten preferentment patògens microbians rugosos30. Es va informar que els neutròfils promouen la proliferació i progressió de les cèl·lules del glioma48. Vam observar un efecte pro-tumoral similar dels neutròfils no modificats en el nostre estudi amb animals, destacant la necessitat de l'enginyeria CCAR o altres modificacions en els neutròfils per garantir la seva seguretat en el lliurament de fàrmacs i altres aplicacions terapèutiques. En particular, el nostre lliurament de fàrmacs mediat per neutròfils CAR depèn únicament de la capacitat d'atracció quimiològica nativa del GBM, però no dels senyals inflamatoris postquirúrgics amplificats, cosa que suggereix l'alta especificitat i el potencial terapèutic del nostre sistema de lliurament de fàrmacs per eradicar gliomes profundament infiltrats. que no es pot extirpar amb cirurgia. Atès que la resecció quirúrgica i la quimioteràpia/radioteràpia adjuvant són les principals intervencions clíniques per a GBM12, el tractament combinat amb nanoportadors de neutròfils CAR i la cirurgia/radioteràpia poden assolir una eficàcia terapèutica òptima i val la pena investigar més. Les construccions CAR específiques de cèl·lules T i NK s'han utilitzat àmpliament per millorar les activitats antitumorals de cèl·lules T i NK, però no s'han descrit CAR específiques de neutròfils que milloren les funcions antitumorals dels neutròfils. Es va informar anteriorment que els receptors immunitaris quimèrics CD4ζ i CD4 milloren la citòlisi dels neutròfils contra cèl·lules transfectades amb HIVenv in vitro. Tot i així, l'eficiència de la lisi només era d'un 10% amb una relació efector-objectiu (E: T) de 10:128. Fc RIIA (CD32a) és un receptor transmembrana de cadena única de baixa afinitat per a IgG monomèrica que està altament expressat en neutròfils (30,000 a 60,000 molècules/cèl·lula31), i la seva lligadura indueix Fc - funcions dependents dels neutròfils, com ara l'alliberament de contingut de grànuls, la mobilització de Ca2+, la citotoxicitat antitumoral i la fagocitosi49. Tenint en compte el paper destacat de CD32a en l'activació i funció dels neutròfils, vam dissenyar i provar construccions CAR basades en CD32a. Tanmateix, els nostres resultats van demostrar que CD3ζ media una citòlisi significativament millor que CD32a quan s'expressa en neutròfils derivats de hPSC, que pot ser en part degut a les còpies més altes d'ITAM en CD3ζ que en CD32a: tres i una còpies, respectivament, i nivells d'expressió més alts de ζ que a la superfície cel·lular dels neutròfils28. Igual que el CD32a, Fc RIII (CD16b) és un altre receptor de baixa afinitat per a la IgG monomèrica i s'expressa a un nivell molt superior al CD32a als neutròfils31. Tot i que la reticulació de CD16b només indueix la mobilització i la desgranulació de Ca2+, però no la fagocitosi i la citòlisi en neutròfils28,50, encara serà d'interès en estudis futurs realitzar una comparació sistemàtica de les capacitats de CD3ζ i CD16b. -CAR en l'activació i la millora de les funcions antitumorals dels neutròfils.

Fig. 6|Distribució in vivo de nanopartícules R-SiO2-TPZ (NP) lliurades per neutròfils CAR. un Esquema de NPs de CAR neutròfil@R-SiO2 i R-SiO2 marcats amb Cy5-administrats per via intravenosa per a un estudi de seguiment de cèl·lules in vivo. Es van implantar estereotàcticament cèl·lules U87MG que expressaven luciferasa (Luci) 5 × 105 al cervell anterior dret dels ratolins NRG. Després de 4 dies, els ratolins van ser tractats per via intravenosa amb PBS, 5 × 106 Cy5-car neutròfil @R-SiO2 NPs i R-SiO2 NPs. b La biodistribució depenent del temps dels neutròfils Cy5+ a tot el cos, el cervell i altres òrgans es va determinar i quantificar mitjançant imatges de fluorescència a les hores indicades. c Es va analitzar la biodistribució de CAR neutròfil@R-SiO2 NP i R-SiO2 NP en ratolins a les 24 hores posteriors a la injecció mitjançant espectrometria d'emissió òptica-plasma acoblada inductivament (ICP-OES) basada en l'element Si, i les dades es van expressar com a percentatge. de dosi injectada per gram de teixit (% ID/g). n=5 mostres biològicament independents. Les dades es representen com a mitjana ± SD. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font. d Es van mostrar imatges de fluorescència representatives de CD45 i SiO2 en els xenografts de glioblastoma indicats aïllats de ratolins portadors de tumors. Barres d'escala, 100 μm. Els triplicats biològics es van realitzar de manera independent.

Fig. 7|Es van avaluar les activitats antitumorals in vivo de neutròfils CAR i de nanopartícules R-SiO2-TPZ (NP) mitjançant injecció intravenosa. un Esquema de PBS, PB-neutròfils, CAR-neutròfils i CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs administrats per via intravenosa per a l'estudi in vivo de destrucció de tumors. Es van implantar estereotàcticament cèl·lules U87MG que expressaven luciferasa (Luci) 5 × 105 al cervell anterior dret dels ratolins NRG. Després de 4 dies, els ratolins van ser tractats per via intravenosa amb neutròfils indicats setmanalment durant un mes. La càrrega tumoral depenent del temps es va determinar (b) i es va quantificar (c) mitjançant imatges bioluminescents (BLI) els dies indicats. Les dades són mitjanes ± SD per als ratolins a (b) (n=5), anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA). d Es va mostrar la corba de Kaplan-Meier que demostra la supervivència dels grups experimentals indicats (n=5). Els dies indicats es van mesurar el factor de necrosi tumoral humana (TNF) i IL{22}} alliberats a la sang perifèrica (e) i el pes corporal (f) de diferents grups de ratolins. Les dades són mitjanes ± SD, n=5 mostres biològicament independents. g, h Es va avaluar l'activitat antitumoral de l'augment de les freqüències de dosificació de neutròfils CAR i RSiO2-TPZ NPs. g Esquema de neutròfils CAR administrats per via intravenosa, NPs R-SiO2-TPZ i NPs CAR-neutròfil@ R-SiO2-TPZ per a l'estudi in vivo de matança de tumors. h Es va mostrar la corba de Kaplan-Meier que demostra la supervivència dels grups experimentals indicats (n=5). Les corbes de Kaplan-Meier es van analitzar mitjançant la prova de rang logarítmic. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font.

També vam presentar aquí una plataforma de lliurament de fàrmacs de neutròfils hPSC modular i versàtil que es pot redissenyar i ajustar en el futur per donar suport a altres esforços basats en neutròfils per tractar altres malalties humanes. En primer lloc, l'enginyeria CAR és més accessible a les hPSC que a les cèl·lules T immunes primàries i als neutròfils. Només requereix una edició única del genoma per aconseguir una expressió estable i homogènia de diversos CAR29. A més dels CLTX CARs, també hem construït línies estables de hPSC que expressen una anti-fluoresceïna universal (FITC)51 o anti-PD-L1 CAR52, que es podrien aprofitar per obtenir neutròfils CAR nanoportadors sòlids universals dirigits a tumors sòlids. També es poden realitzar altres modificacions genètiques, com ara la fibrosi dirigida als CAR53 anti-FAP, per dirigir nanoportadors de neutròfils per tractar malalties degeneratives mortals, com ara trauma cerebral i fibrosi cardíaca. A més, les hPSC que expressen CAR també es podrien adaptar fàcilment per produir cèl·lules CAR-T o CAR-NK29, i les combinacions d'aquestes immunoteràpies amb nanoportadors de neutròfils CAR poden aconseguir beneficis terapèutics antitumorals òptims. Finalment, el nostre sistema de nanomedicaments sensibles al glutatió tumoral bioinspirat (GSH) és una plataforma modular i versàtil per carregar fàrmacs quimioterapèutics o radioactius prometedors en neutròfils CAR per al lliurament de fàrmacs dirigits, com s'exemplifica amb TMZ clínic, JNJ64619187 i TPZ pro-droga. Estudis futurs sobre provar altres nanopartícules poden produir una càrrega de fàrmacs optimitzada en neutròfils i aconseguir la màxima eficàcia terapèutica in vivo.

Tot i que hem demostrat el concepte terapèutic d'utilitzar neutròfils CAR per lliurar de manera específica i eficaç quimiomedicaments als tumors cerebrals de la BBB, hi ha algunes limitacions en aquest estudi. En primer lloc, la 4-inoculació diària de cèl·lules tumorals pot no ser suficient per establir tumors que imiten l'escenari clínic per a la investigació terapèutica, i el treball futur amb diferents períodes d'inoculació del tumor és necessari per recapitular les diferents etapes del desenvolupament del glioblastoma i la resposta terapèutica en diferents pacients54,55. En segon lloc, els ratolins immunodeficients que hem utilitzat aquí no tenen immunitat adaptativa, i es necessiten altres models preclínics amb un sistema immunitari intacte, com ara gossos de companyia amb glioma espontani56, per avaluar millor la seguretat i l'eficàcia dels neutròfils CAR produïts in vitro. En particular, es necessita un perfil de toxicitat fora de l'objectiu dels neutròfils CAR amb o sense càrrega de nanomedicaments en animals infusionats, inclosa la síndrome d'alliberament de citocines, la neurotoxicitat i les toxicitats fora del tumor observades a les cèl·lules CAR-T57, malgrat la curta vida útil. dels neutròfils. Tot i que els enfocaments factibles, com ara l'enginyeria de hPSCs de donant universal hipoimmunogènic58–61 i les biblioteques d'hPSC homozigots d'antigen de leucòcits humans (HLA)62, estan disponibles per evitar el risc potencial de malaltia de l'empelt contra l'hoste (GvHD), els models animals preclínics amb un Encara es necessita un sistema immunitari intacte per avaluar el potencial translacional de la nostra teràpia amb neutròfils. Finalment, es va observar una citotoxicitat antitumoral limitada i l'extensió de la vida animal de la terapèutica de nanofarmacs de neutròfils CAR. Per tant, l'exploració futura de fàrmacs de quimioteràpia o radiosensibilitzants més efectius i teràpies combinatòries amb CAR-T clàssic i resecció quirúrgica és essencial per aconseguir la màxima eficàcia antitumoral de la terapèutica de neutròfils CAR. Per exemple, un estudi recent sobre el disseny basat en mecanismes ha donat lloc a un fàrmac KL-50 més eficaç que supera la resistència adquirida tal com s'observa en el fàrmac clínic TMZ63 i, per tant, es pot incorporar a la nostra plataforma modular de nanomedicaments de neutròfils CAR per a un potencial potencial. millor eficàcia terapèutica. També pot allargar la vida útil dels neutròfils a 5 dies mitjançant el tractament CLON-G (inhibició de la permeabilització de la membrana lisosomal-caspases-oxidant-necroptosi més factor estimulant de colònies de granulòcits64) i/o utilitzar un sistema d'alliberament controlat de fàrmacs a llarg termini en neutròfils CAR. aconseguir una eficàcia antitumoral sostinguda in vivo després de l'apoptosi dels neutròfils. Col·lectivament, les nostres troballes van demostrar clarament que els neutròfils CAR carregats amb R-SiO2-TPZ podrien mantenir el fenotip antitumoral N1 i matar de manera eficient les cèl·lules tumorals en diverses condicions semblants al nínxol tumoral in vitro. Els neutròfils CAR funcionals també es podrien produir en grans quantitats a partir de hPSC dissenyats per lliurar amb precisió nanomedicaments sensibles al microambient del tumor per orientar GBM in vivo, donant lloc a una quimioimmunoteràpia combinatòria amb activitats anti-GBM robustes i específiques i un lliurament mínim de fàrmacs fora de l'objectiu. vida útil prolongada en ratolins portadors de tumors.

Referències

1. Yang F. et al. Immunoteràpia sinèrgica del glioblastoma mitjançant l'orientació dual d'IL-6 i CD40. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. i Weller, M. Estat actual de la immunoteràpia per al glioblastoma. Nat. Reverent Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. El lliurament intratumoral de IL-12 potencia la immunoteràpia de cèl·lules CAR-T en un model preclínic de glioblastoma. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils as emerging therapeutic targets. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA i Torchilin, VP Neutròfils com a diana terapèutica emergent i eina per a la teràpia del càncer. Ciència de la vida. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA i Lin, Z. Metaanàlisi del lliurament de nanopartícules als tumors mitjançant un enfocament de simulació i modelització farmacocinètica de base fisiològica. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Anàlisi del lliurament de nanopartícules als tumors. Nat. Reverent Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Lliurament de fàrmacs contra el càncer mediat per neutròfils per a la supressió de la recurrència del glioma maligne postoperatori. Nat. Nanotecnologia. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Seguiment d'imatges per RM de neutròfils dissenyats activables per la inflamació per a la teràpia dirigida del glioma tractat quirúrgicament. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. i Wang, Z. La fotosensibilització dels microambients tumorals millora el lliurament de nanoterapèutics mitjançant la infiltració de neutròfils. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Teràpia del càncer: tràfic de neutròfils en nanomedicaments contra el càncer. Nat. Nanotecnologia. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Rols dels neutròfils en glioma i metàstasis cerebrals. Davant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarització del fenotip de neutròfils associat al tumor per TGF-beta: "N1" versus "N2" TAN. Cèl·lula cancerígena (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Els neutròfils s'oposen a la carcinogènesi epitelial uterina mitjançant el desbridament de cèl·lules tumorals hipòxiques. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. L'alleujament de la hipòxia tumoral allibera el potencial tumoricida dels neutròfils. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Els neutròfils polimorfonuclears humans reconeixen i maten específicament les cèl·lules canceroses. Oncoimmunologia 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Diversitat i plasticitat de neutròfils en la progressió i teràpia del tumor. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Progrés de la investigació sobre les cèl·lules mare del glioma en el microambient immunitari del glioma. Davant. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD i Kaminska, B. Microambient immune dels gliomes. Laboratori. Investig. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plasticitat, heterogeneïtat i resistència de les cèl·lules tumorals en nínxols microambientals crucials del glioma. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Immunoteràpies emergents per al glioma maligne: de la immunogenòmica a la teràpia cel·lular. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. La ferroptosi induïda per neutròfils promou la necrosi tumoral en la progressió del glioblastoma. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Diversitat fenotípica i plasticitat en subpoblacions de neutròfils circulants en càncer. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS i Kaufman, DS Cèl·lules assassines naturals derivades d'iPSC humans dissenyades amb receptors d'antigen quimèrics milloren l'activitat antitumoral. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Les cèl·lules CAR T amb interleucina-13 mutants d'alta afinitat milloren el lliurament de nanopartícules fluorescents biodegradables clicables al glioblastoma. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Un nou sistema de lliurament de lligands per visualitzar i explotar terapèuticament de manera no invasiva el biomarcador restringit al tumor IL13R 2. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Cèl·lules CAR T dirigides per clorotoxina per a l'orientació específica i eficaç del glioblastoma. Ciència. Trad. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Citòlisi específica de l'antigen per neutròfils i cèl·lules NK que expressen receptors immunes quimèrics que porten dominis de senyalització zeta o gamma. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Enginyeria de neutròfils del receptor d'antigen quimèric de cèl·lules mare pluripotents humanes per a la immunoteràpia contra el càncer dirigida. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Els neutròfils fagociten preferentment partícules allargades oportunitats per a l'orientació selectiva en malalties inflamatòries agudes. Ciència. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Expressió, funció i regulació dels receptors Fc dels neutròfils. Davant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Importància de les tirosinas ITAM de la cadena del receptor fc en l'activació de neutròfils i l'artritis autoimmune in vivo. Davant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Paper de les formes polimòrfiques dels neutròfils Fc RIIa (CD32) i Fc RIIIb (CD16) en la fagocitosi de bacteris i eritròcits IgG1- i IgG3-opsonitzats humans. Transfus. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Els receptors Fc de neutròfils humans inicien i juguen papers especialitzats no redundants en malalties inflamatòries mediades per anticossos. Immunitat. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Generació definida químicament d'endoteli hemogènic humà i cèl·lules progenitores hematopoètiques definitives. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Generació eficaç i ràpida de neutròfils funcionals a partir de cèl·lules mare pluripotents induïdes mitjançant ARNm modificat amb ETV2-. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. El paper de la hipòxia en el microambient tumoral i el desenvolupament de cèl·lules mare del càncer: un nou enfocament per desenvolupar un tractament. Cèl·lula Càncer Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Impacte del microambient del tumor hipòxic i la plasticitat de les cèl·lules tumorals en l'expressió dels punts de control immunitari. Càncer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. i Yamamura, H. El paper de la proteïna-tirosina quinasa Syk en la senyalització de l'estrès oxidatiu a les cèl·lules B. Senyal Redox d'Antioxidants. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. Senyalització cel·lular mediada per ROS i ROS. Oxidat. Med. Cèl·lula. Longevitat. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Una via d'activació de Ras dependent de la fosforilació Syk de la proteïna cinasa C. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ La tirosina quinasa SYK: un jugador crucial en diverses funcions biològiques. Nat. Reverent Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Un nanocompost sensible al microambient tumoral per a gas sulfur d'hidrogen i teràpia dinàmica enzimàtica millorada trimodal. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER i Mecsas, J. Neutròfils al ROScue: Mecanismes d'activació de la NADPH oxidasa i resistència bacteriana. Davant. Cèl·lula. Infectar. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Els neutròfils permeten el lliurament local i no invasiu de liposomes al múscul esquelètic inflamat i al cor isquèmic. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Resum d'aprovació de la FDA: tocilizumab per al tractament de la síndrome d'alliberament de citocines greu o potencialment mortal induïda per cèl·lules T del receptor d'antigen quimèric. Oncòleg 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Síndrome d'alliberament de citocines i neurotoxicitat associada a la immunoteràpia contra el càncer. Nat. Reverent Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Els neutròfils promouen el fenotip del glioma maligne mitjançant S100A4. Clin. Càncer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Regulació específica de la cèl·lula, depenent de l'activació de la funció d'unió al lligand CD32A de neutròfils. Sang https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF i Guyre, PM Citotoxicitat mediada per receptors Fc humans per a IgG. Immunol. Avui. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Regulació de la toxicitat semblant a la síndrome d'alliberament de citocines mediada per cèl·lules T CAR mitjançant adaptadors de baix pes molecular. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Un nou receptor d'antigen quimèric que conté un domini de senyalització JAK-STAT media efectes antitumorals superiors. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Orientar la fibrosi cardíaca amb cèl·lules T dissenyades. Naturalesa. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-cèl·lules NK específiques per a la teràpia dirigida del glioblastoma. J. Natl. Càncer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. Cèl·lules T CAR per a tumors cerebrals: lliçons apreses i el camí a seguir. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Dades de seguretat i supervivència provisional després de l'administració intracranial de M032, un HSV oncolític modificat genèticament que expressa IL-12, en gossos de companyia amb gliomes esporàdics. Neurocirurgia. Focus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC i Maus, MV Avenços i descobriments recents en els mecanismes i funcions de les cèl·lules T CAR. Nat. Rev. Càncer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Generació de cèl·lules T hipoimmunogèniques a partir de cèl·lules mare pluripotents induïdes humanes al·logèniques modificades genèticament. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Els derivats hipoimmunogènics de cèl·lules mare pluripotents induïdes eviten el rebuig immunitari en receptors al·logènics totalment immunocompetents. Nat. Biotecnologia. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Generació de cèl·lules mare pluripotents humanes hipoimmunogèniques. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. L'edició del genoma HLA DR amb TALEN en iPSC humans va produir cèl·lules dendrítiques immunotolerants. Cèl·lules mare Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. La concordança de MHC millora l'empelt de neurones derivades d'iPSC en primats no humans. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Disseny basat en mecanismes d'agents que s'orienten selectivament als gliomas resistents als fàrmacs. Ciència. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. L'orientació a diverses vies de mort cel·lular allarga la vida útil i preserva la funció dels neutròfils humans i del ratolí per a la transfusió. Ciència. Trad. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Indicadors fluorescents per a informes continus i específics de llinatge de les fases del cicle cel·lular en cèl·lules mare pluripotents humanes. Biotecnologia. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Generació definida químicament de cèl·lules mare i progenitores hematopoètiques humanes definitives. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).