Efecte de la teràpia de protons sobre la mort de cèl·lules tumorals i el microentorn immune per al carcinoma hepatocel·lular

Resum: La radioteràpia amb protonteràpia (TP) té avantatges dosimètrics respecte a la teràpia fotogràfica, que ajuda a ampliar la finestra terapèutica de la radioteràpia per al carcinoma hepatocel·lular (HCC). Vam avaluar la resposta de l'HCC a la PT i vam examinar els mecanismes subjacents. Les línies cel·lulars de càncer de fetge humà HepG2 i HuH7 i la línia de cèl·lules de càncer de fetge murí Hepa1–6 es van seleccionar per a experiments amb cèl·lules i animals per examinar la resposta induïda per la irradiació PT. Es van examinar els canvis biològics i la resposta immunològica després de la irradiació PT. Els experiments in vitro no van mostrar cap diferència significativa en la supervivència cel·lular després de la PT en comparació amb la radioteràpia amb fotons. En un model de tumor murí, els tumors eren de mida més petita 12 dies després de la irradiació PT. Els canvis subjacents incloïen un augment del dany a l'ADN, nivells de IL-6 regulats i un microentorn tumoral immune regulat. L'anàlisi de proteïnes in vitro i in vivo va demostrar que el PT va augmentar el nivell de lligand de mort cel·lular programada 1 (PD-L1) expressat a les cèl·lules tumorals i va reclutar cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC). L'augment de PD-L1 es va correlacionar positivament amb la dosi d'irradiació. En els models de ratolins singènics Hepa1–6, la combinació de PT amb anti-PD-L1 va augmentar el retard del creixement del tumor en comparació amb la PT sola, que es va associar amb un augment de les cèl·lules T que infiltraven el tumor i un reclutament atenuat de MDSC al microambient. A més, quan es va aplicar PT al tumor primari d'HCC, els ratolins tractats amb anticossos anti-PD-L1 van mostrar tumors sincrònics no irradiats més petits. En conclusió, la resposta de l'HCC a la PT es va determinar per la mort de cèl·lules tumorals i la resposta immunològica al microambient del tumor. La combinació amb l'anticòs anti-PD-L1 per millorar la immunitat antitumoral va ser responsable de la sinergia terapèutica per a l'HCC tractat amb PT. A partir dels nostres resultats, suggerim que la PT combinada amb anti-PD-L1 pot ser una política terapèutica prometedora per a l'HCC.

Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor

Paraules clau: HCC; teràpia de protons; PD-L1; immune

1. Introducció

El carcinoma hepatocel·lular (HCC) és un càncer que es produeix a nivell mundial amb una incidència relativament alta al sud-est asiàtic [1]. La majoria dels pacients tenen un mal pronòstic a causa de tumors avançats i/o funció hepàtica deficient. Tradicionalment, la radioteràpia (RT) amb una dosi definida per al tractament del càncer de fetge s'ha associat amb un alt risc d'hepatitis induïda per radiació. Les millores en les tècniques de lliurament de radioteràpia han ajudat a ampliar la finestra terapèutica de la RT per al CHC. El desenvolupament de la RT amb teràpia de protons (PT) ha portat l'ús de la RT per a HCC en el punt de mira [2, 3]. El PT té avantatges dosimètrics respecte a la teràpia de fotons convencional per al tractament del càncer, especialment per al HCC, el càncer de cap i coll i el càncer de mama. Estudis recents van suggerir que hi pot haver diferències en els canvis biològics induïts per RT, inclosa la inducció de danys a l'ADN, l'estrès oxidatiu i la regulació de les cèl·lules immunitàries, entre PT i fotons a dosis d'eficàcia biològica relativa equivalents [4-7]. Una investigació addicional de l'efecte radiobiològic de la PT facilitarà l'oportunitat de proporcionar el desenvolupament d'estratègies prometedores de PT per al tractament del càncer. La combinació de RT i immunoteràpia en entorns clínics és prometedora per a moltes indicacions [8,9]. Com que la inflamació crònica provoca una predisposició al desenvolupament d'HCC, l'HCC és un objectiu potencial per a la immunoteràpia [10]. La RT té efectes tant proimmunogènics com immunosupressors sobre el microambient tumoral [9]. Tot i que s'ha demostrat que la RT provoca la mort de cèl·lules immunogèniques i millora la infiltració de cèl·lules immunitàries antitumorals [11, 12], diversos estudis van demostrar que la RT pot induir citocines i cèl·lules reguladores immunes, donant lloc a un microambient tumoral més immunosupressor. Es va demostrar que la combinació d'immunoteràpia i RT millora la resposta del tumor en comparació amb qualsevol de les dues modalitats sola i anul·la els efectes immunosupressors induïts per RT [13,14]. Diversos estudis preclínics i clínics van demostrar que el tractament amb foton RT i immunoteràpia té un efecte positiu en el control del tumor en HCC [15,16]. Segons el nostre coneixement, gairebé tots els informes sobre respostes immunes induïdes per ràdio s'han obtingut amb irradiació basada en fotons. Una millor comprensió dels mecanismes responsables de la resposta a la PT podria conduir a enfocaments terapèutics més potents per a l'HCC. Els efectes biològics de la PT responsables del control del tumor i la resposta immune necessiten més investigacions. Per tant, hem volgut avaluar l'efecte de la radiació amb PT i la resposta immune en el microambient tumoral. També vam investigar si la combinació de PT i el bloqueig de PD-L1 té un efecte sinèrgic en el control del tumor HCC.

2. Materials i Mètodes

2.1. Cultiu cel·lular 

La línia cel·lular de càncer de fetge humà HepG2 i la línia de cèl·lules de càncer de fetge murí Hepa1–6 es van obtenir del Centre de Recerca i Col·lecció de Biorecursos. A més, les cèl·lules HuH7, una línia cel·lular d'hepatoma humà, van ser amablement proporcionades pel Dr. Yen-Hao, Chen (Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan). L'ús de les línies cel·lulars va ser aprovat pel nostre comitè d'ètica de recerca institucional (núm. 00464-2021120952922). Les línies cel·lulars es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS). A més, es van mantenir cèl·lules THP-1 monocítiques humanes al medi de cultiu RPMI 1640. Els monòcits THP-1 es poden diferenciar en macròfags M1 o M2 quan s'incuben en un medi condicionat [17, 18]. Per determinar els efectes de la PT sobre la capacitat de les cèl·lules canceroses per induir la diferenciació dels macròfags M2, les cèl·lules HuH7 amb o sense irradiació de PT es van sembrar en plaques de 6-pou 24 h abans del final de la polarització dels macròfags M2. Després de 24 h de cocultiu, es va analitzar l'expressió de CD163, un marcador de macròfags M2, amb macròfags. L'anàlisi de cèl·lules activades per fluorescència multicolor (FACS) es va realitzar mitjançant un citòmetre de flux de calibre FACS (BD Biosciences) en suspensions unicel·lulars preparades a partir dels macròfags diferenciats i es va dur a terme la immunocoloració per CD163 mitjançant un anticòs monoclonal marcat amb fluorescència. Els experiments in vitro es van realitzar al Laboratori Conjunt de l'Hospital Memorial Chang Gung, que va proporcionar les plataformes de servei que inclouen el classificador de cèl·lules, l'analitzador de cèl·lules multicolors i la microscòpia confocal.

Beneficis de cistanche tubulosa-Antitumor

2.2. Irradiació

L'eficàcia biològica relativa dels protons es va establir en 1, 1 i la dosi d'eficàcia biològica relativa (RBE) es va calcular multiplicant la dosi de protons per aquest valor [19]. En el present estudi, hem utilitzat la dosi RBE per avaluar l'efecte induït per RT. La dosi en radioteràpia de protons es prescriu com a Gy (RBE) augmentant la dosi física en un 10%, és a dir, la dosi RBE de protons=la dosi física de protons × 1,1. Les cèl·lules i els ratolins van rebre RT local per irradiació de fotons o PT amb la dosi de RBE. La irradiació de fotons es va realitzar mitjançant la planificació del tractament Varian 21EX i Eclipse. In vitro, les cèl·lules en creixement exponencial es van irradiar amb dosis individuals de 0, 3, 6 i 9 Gy mitjançant un feix de 6 MV per a l'anàlisi de la radiació fotogràfica. Per a PT, la irradiació mitjançant exploració de feix de llapis (PBS) es va realitzar a diferents dosis de protons (0, 3, 6, 9 i 12 Gy (RBE)), amb una energia corresponent a 93,6-109,2 MeV i 72-143,2 MeV per a les cèl·lules. i ratolins, respectivament. Les irradiacions de cèl·lules i ratolins es van dur a terme col·locant les cèl·lules al centre del pic de Bragg (SOBP; 1 cm d'amplada per a la PT cel·lular, 6 cm d'amplada per a la irradiació de PT del ratolí) per simular les condicions clíniques (figura 1a, b). La irradiació de protons va ser lliurada pel ciclotró utilitzat al nostre hospital (Sumitomo Heavy Industries, Ltd., Tòquio, Japó), que genera un feix de protons continu i d'alta intensitat. La mida del camp RT era de 20 × 10 cm2 per examinar l'efecte abscopal, 20 × 15 cm2 per examinar l'efecte tumoricida del PT in vivo o 20 × 20 cm2 per examinar l'efecte del PT in vitro. Ray Station va ser el sistema de planificació del tractament utilitzat per al càlcul de la dosi RT (versió 8.1, Ray Search Laboratories, Estocolm, Suècia).

Figura 1. Model preclínic per a PT. Els dissenys experimentals de feix de protons per a models de tumors in vitro (a) i animals (camp RT per a la irradiació del tumor hepàtic, línia blava; camp RT per examinar l'efecte abscopal, línia vermella) (b).

2.3. Assaig de proliferació de cèl·lules T

Per examinar si la PT era capaç de regular l'efecte de les cèl·lules canceroses i les cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC) sobre la proliferació de cèl·lules T CD8+, vam mesurar la proliferació de cèl·lules T CD8+ després de l'estimulació. Les cèl·lules T CD8+ aïllades mitjançant microperles anti-CD8 es van marcar amb carboxifluoresceïna succinimidil èster (CFSE) i es van sembrar en plaques de 96-pous amb cèl·lules CD11b+ en presència o absència de cèl·lules canceroses 48 h després de PT. La proliferació de cèl·lules T CD8+ va ser estimulada per comptes anti-CD3/CD28 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA). La tinció fluorescent CFSE es va analitzar mitjançant citometria de flux 3 dies després de l'estimulació.

2.4. Inducció de CD14+HLA-DR-des de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC)

Es va identificar un nou subconjunt de MDSC a partir de la presència de l'expressió CD14 però l'absència d'expressió d'antigen de leucòcits humans (HLA)-DR (CD14+HLA-DR-) a la sang perifèrica dels pacients amb càncer. L'acumulació anormal de cèl·lules CD14+HLA-DR- en PBMC contribueix a l'evasió immune del tumor i es correlaciona amb el pronòstic del càncer [20–22]. Per avaluar el paper de la irradiació PT en la inducció de MDSC, es va avaluar el percentatge de cèl·lules mieloides CD14+HLA-DR a partir de PBMC incubades amb cèl·lules canceroses irradiades amb PT durant 24 h. La proporció de cèl·lules mieloides CD14+HLA-DR- i el nivell d'expressió de PD-L1 es van analitzar mitjançant FACS (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

2.5. Assaig Clonogènic

Es van utilitzar assajos clonogènics per examinar l'efecte de RT (PT versus foton RT) sobre la pèrdua de supervivència de les cèl·lules reproductives. Els cultius cel·lulars es van irradiar i després es van incubar a 37 ◦ C per a la formació de colònies. Després de 10 dies, les colònies es van fixar i es van tenyir amb cristall violeta per al recompte de colònies. Es van puntuar les colònies per determinar l'eficiència de la placa i les fraccions supervivents a una dosi determinada de RBE. La fracció de supervivència és el nombre de colònies després de l'exposició a RT, amb una correcció per a l'eficiència de la placa.

2.6. Models de tumors singènics (ectòpics i ortotòpics).

Tots els estudis en animals van complir amb totes les normatives ètiques rellevants per a la investigació amb animals i van ser aprovats pel comitè d'animals experimentals del nostre hospital. Els experiments amb animals es van realitzar al Centre d'Animals de Laboratori de l'Hospital Memorial Chang Gung, que té l'acreditació completa de l'Associació per a l'Avaluació i l'Acreditació de la Cura Internacional dels Animals de Laboratori (AAALAC). Hem utilitzat ratolins C57BL/6J com a model d'implantació de tumors hepàtics. En el model de tumor ectòpic i ortotòpic, les cèl·lules tumorals (cèl·lules Hepa 1–6 1 × 106) es van implantar per via subcutània a la regió de la cuixa dreta i/o es van implantar intraoperatòriament a la zona de la cúpula hepàtica. Per examinar la resposta dels tumors hepàtics a la PT in vivo, es va administrar irradiació local de PT per a 12 Gy (RBE) als tumors 14 dies després de la implantació amb cèl·lules canceroses Hepa1–6 (figura 1b). Els ratolins control van ser sotmesos a una irradiació simulada. Per abordar l'efecte abscopal de la PT en hostes immunocompetents portadors de tumors, vam implantar simultàniament cèl·lules canceroses Hepa1–6 a la cuixa dreta (tumor primari) i la part superior de l'esquena (tumor sincrònic secundari). Catorze dies després de la implantació del tumor, es va administrar PT amb 12 Gy (RBE) al tumor primari però no al tumor sincrònic secundari. A continuació, vam observar el creixement del tumor (inclosos els tumors primaris irradiats i sincrònics no irradiats) en els punts de temps indicats. Per investigar els efectes de l'anti-PD-L1 sobre el control local del tumor mediat per PT i l'efecte abscopal, els ratolins portadors de tumors van rebre una dosi intraperitoneal de 250 µg d'anticossos antiPD-L1 immediatament després de la irradiació de PT i cada 2 dies fins al final de els experiments. L'anticòs anti-ratolí PD-L1 (B7-H1, 10F.9G2) es va obtenir de Bio X Cell (Líban, NH, EUA).

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. Anàlisis citomètriques de flux MDSC in vivo

Les MDSC es caracteritzen per la coexpressió dels antígens de diferenciació del llinatge de cèl·lules mieloides Gr1 i CD11b. Per tant, hem utilitzat un anticòs específic anti-Gr1, que reacciona amb un epítop comú a Ly-6G i Ly{-6C, i un anticòs específic per a CD11b (BD Pharmingen) per definir els MDSC de ratolí com a CD11b. + Gr1+ [23]. A més, l'antigen de diferenciació mieloide Gr-1 consta de dos epítops reconeguts pels anticossos anti-Ly-6G i anti-Ly6C. La població de CD11b+Gr-1+ MDSC constava de dos subconjunts principals: cèl·lules amb un fenotip granulocític que expressa Ly{-6G i cèl·lules amb un fenotip monocític que expressa Ly6C. Es va identificar un nou subconjunt de MDSC com a MDSC monocítics, definits com CD11b + Ly6G- en ratolins. Hem realitzat anàlisis FACS i immunofluorescència per examinar l'efecte de la irradiació en el reclutament de MDSC després que els ratolins rebin irradiació. El FACS es va dur a terme en suspensions unicel·lulars preparades a partir de tumors sencers i de melsa després de la digestió i la immunotinció per a CD11b, Gr1 i LY6G amb anticossos monoclonals marcats amb fluorescència (BD PharMingen). El percentatge de MDSC es va mesurar mitjançant citometria de flux multicolor amb els anticossos monoclonals esmentats anteriorment. Els anticossos específics d'isotip es van utilitzar com a controls negatius en FACS.

2.8. Anàlisi estadística

Les mostres es van analitzar mitjançant la prova t de Student. Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard de la mitjana (DE). Tots els experiments cel·lulars comprenien tres rèpliques biològiques per condició [24] i es van realitzar almenys tres vegades de manera independent. Per als experiments in vivo, es van utilitzar sis animals per grup i es van realitzar almenys dos experiments independents. Es va prendre un nivell de probabilitat de p < 0,05 per indicar significació estadística tret que s'indiqui el contrari.

3. Resultats:

3.1. Resposta de HCC a PT Resposta de HCC

Les cèl·lules canceroses humanes i murines es van exposar a una sola dosi de PT de 0, 3, 6 o 9 Gy (RBE) i es va examinar i comparar la mort cel·lular a les 48 h i la fracció de supervivència de les cèl·lules formadores de colònies. amb foton-RT. No hi va haver cap diferència significativa en la supervivència cel·lular a RBE equivalent entre PT i foton-RT (figura 2a, b). La formació de p-H2AX és una resposta cel·lular a les ruptures de doble cadena de l'ADN, i la presència d'exposició a calreticulina i el grup d'alta mobilitat Box 1 (HMGB1) serveixen com a característiques distintives de la mort cel·lular d'immunogenicitat induïda per RT [25–27]. Com es mostra a la figura 2c, PT va millorar l'expressió de calreticulina i HMGB1 associada a un augment del dany a l'ADN 24 h després de la RT. Un estudi anterior [28] va informar que el foton-RT regulava a la IL-6, que estava relacionat amb la resistència de l'HCC a la RT. Les dades (figura 2c, d) revelen que la PT va regular el nivell d'IL-6 a les cèl·lules de càncer de fetge analitzades mitjançant IF i RT PCR en temps real a les 24 i 48 h després de la PT. Per caracteritzar encara més si l'augment d'IL-6 per PT estava relacionat amb l'activitat del promotor d'IL6, vam realitzar assajos d'activitat de la luciferasa mitjançant cèl·lules HepG2 i HuH7 transfectades de manera estable amb un vector que expressava construccions del promotor IL-6 (figura 2e) . Les dades quantitatives suggereixen que PT va augmentar l'activitat del promotor IL-6 a les 48 h després de 6 Gy (RBE) en comparació amb les cèl·lules control.

3.2. Resposta al tractament PT en l'amfitrió immunocompetent

In vivo, els models de tumors animals són eines essencials per predir l'eficàcia de noves estratègies contra el càncer. Hem utilitzat models de tumors de ratolí singènics per investigar els efectes de la PT sobre el control del tumor HCC. A partir de l'observació de l'activitat del tumor mitjançant l'assaig de tomografia molecular de fluorescència (FMT) in situ i la mesura de la mida del tumor, vam trobar que hi havia una disminució significativa de l'activitat de captació de glucosa del tumor i tumors més petits 12 dies després de la PT en comparació amb la RT simulada (Figura 3a, b). Per examinar més el mecanisme responsable de la resposta a la PT, vam realitzar anàlisis FACS i immunofluorescència mitjançant tumors 3 dies després de la PT o la irradiació simulada. S'ha informat que l'exposició a calreticulina és un indicador immunogènic de l'apoptosi induïda per RT a dosis més baixes, i HMGB1 està relacionat amb la mort cel·lular induïda per RT a dosis més altes [29]. A més, s'ha informat que IL-6 té un paper en la modulació immune induïda per RT [30]. Anteriorment, vam informar que l'expressió IL-6 estava regulada a l'alça per la RT del foton i que l'augment d'IL6 es correlacionava amb la resposta a la radiació dels tumors hepàtics [28]. Com es mostra a la figura 3c, d, PT va augmentar la mort de cèl·lules tumorals associada a un augment del dany a l'ADN i l'expressió IL6 i HMGB1 en comparació amb la irradiació simulada.

3.3. Els efectes immunomoduladors induïts per PT

S'ha informat que la inducció de la polarització dels macròfags M2 és el component immunosupressor clau en el microambient del tumor irradiat [17, 18]. Per provar si PT va millorar la diferenciació de monòcits en cèl·lules M2, vam incubar monòcits THP-1 en l'etapa de repòs (M0) al medi condicionat durant 72 h per a la polarització M2. A continuació, es van analitzar els nivells del marcador M2 en macròfags de monòcits mitjançant cocultiu en sobrenedant de cultiu amb o sense cèl·lules HuH7 irradiades amb PT 24 h abans del final de la polarització dels macròfags M2. Com es mostra a la figura 4a, l'addició de cèl·lules canceroses irradiades amb PT al cultiu de macròfags va augmentar l'expressió del marcador M2 CD163 en macròfags in vitro. Vam investigar més el paper del PT en la capacitat de les cèl·lules canceroses per induir MDSC a partir de monòcits a la sang perifèrica dels donants mitjançant el cocultiu amb cèl·lules canceroses amb o sense PT durant 48 h. Es va identificar un nou subconjunt de MDSC per cèl·lules CD14+HLA-DR al PBMC. La figura 4b revela que la irradiació PT es va associar amb una freqüència més alta de cèl·lules mieloides CD14+ HLA-DR en comparació amb el control. A més, hi va haver una expressió més alta d'iNOS, un marcador funcional de la immunosupressió mediada per MDSC, en el subconjunt de cèl·lules que es van cocultivar amb cèl·lules canceroses irradiades amb PT (figura 4c). A més, es confirma que CD163 és un marcador fenotípic dels macròfags M2 que es pot utilitzar per distingir els macròfags M2 i M1. Tal com es mostra a la figura 4d,e, PT va provocar l'augment de cèl·lules CD163+ en tumors irradiats amb PT associats amb la inducció de MDSC monocítics en ratolins portadors de tumors. S'ha informat que la RT provoca la mort de cèl·lules immunogèniques i millora la infiltració de cèl·lules immunitàries. Per provar encara més el paper de la PT en les conseqüències funcionals de les cèl·lules canceroses sobre la supressió de cèl·lules T mediada per MDSC, es va avaluar la proliferació de cèl·lules T CD8+ ordenades en presència de cèl·lules tumorals amb o sense 6 Gy (RBE). ) Irradiació PT. Les dades revelen que les cèl·lules MDSC-CD11b+ van disminuir la proliferació de cèl·lules T i la incubació amb cèl·lules tumorals irradiades amb PT va revertir la proliferació de cèl·lules T CD8+ després de l'estimulació (figura 4f).

Figura 2. Resposta de HCC a PT in vitro. Efectes del tractament amb PT sobre la mort cel·lular de les cèl·lules HuH7. ( a ) Classificació cel·lular activada per fluorescència amb iodur de propidi i tinció d'Annexina V 48 h després de PT per a la dosi indicada (RBE) i (b) fraccions de supervivència cel·lular mitjançant assajos clonogènics presentades amb la proporció normalitzada per la fracció de supervivència en condicions de control. Els números de cèl·lules de xapa per a 0, 3, 6 i 9 Gy (RBE) eren 500, 1000, 1500 i 3000 per pou, respectivament. ( c ) La immunofluorescència per a danys a l'ADN induït per PT i marcadors per a la mort cel·lular d'immunogenicitat es mostra mitjançant diapositives representatives i dades quantitatives (DAPI, blau; pH 2AX i calreticulina, verd; HMGB1 i IL6, vermell). L'eix y representa els canvis relatius de plecs en les expressions de proteïnes diana. ( d ) Els nivells d'IL-6 es van examinar mitjançant RT-PCR en temps real 48 h després de PT. ( e ) Transfecció estable de cèl·lules HepG2 i HuH7 amb plasmidis que contenen construccions promotor-reporter IL-6. Els valors es representen com a activació de plecs de l'activitat luciferasa del plasmidi reporter en la condició indicada. Les dades es presenten com a mitjanes ± errors estàndard de la mitjana. * p < 0,05

Figura 3. Resposta al tractament amb PT en ratolins immunocompetents. Les imatges representatives i les dades quantitatives es van determinar mitjançant l'anàlisi FMT de la captació de glucosa a 0, 3 o 12 dies amb o sense irradiació PT (a). L'eix y representa la relació normalitzada pel valor del tumor a 0 dies amb irradiació simulada. Es mostren imatges representatives i dades quantitatives d'imatges de tumors (b) de ratolins que porten tumors sc 12 dies després de 12 Gy (RBE) PT o irradiació simulada. L'eix y representa el canvi relatiu de plec en la mida del tumor en el moment indicat després de PT. El dany a l'ADN per IF (c) i la mort cel·lular per FACS (d) es van avaluar 3 dies després de PT. L'eix y és el canvi de plec relatiu en les expressions de proteïnes diana i la taxa de mort cel·lular als 3 dies després de la PT. Les dades es presenten com a mitjanes ± errors estàndard de la mitjana. * p < 0.05

3.4. Paper del PT en l'expressió del lligand 1 de la mort cel·lular programada (PD-L1)

PD-L1 és un determinant crític de l'equilibri en el microambient del tumor immune [31]. La PT va augmentar l'expressió de PD-L1 a les cèl·lules tumorals del fetge i el nivell d'expressió es va correlacionar positivament amb la dosi RBE de PT in vitro (figura 5a, b). Per validar encara més els efectes de PT sobre PD-L1 in vivo, es va examinar el nivell d'expressió de PD-L1 en tumors d'HCC murins mitjançant IF i FACS. Les dades de la figura 5c, d revelen una expressió de PD-L1 significativament augmentada en tumors 3 dies després de PT. També vam examinar si PT va regular l'expressió de PD-L1 en MDSC mitjançant cèl·lules mieloides CD11b + ordenades de tumors. Els resultats van indicar que PT va augmentar l'expressió de PD-L1 a les cèl·lules CD11b + ordenades (figura 5e, f).

3.5. Efecte de PD-L1 sobre la resposta de HCC a PT in vivo

Per determinar si PD-L1 té un paper en la radiosensibilitat dels tumors hepàtics a PT en hostes immunocompetents, es va administrar RT local amb PT 12 Gy (RBE) a tumors implantats subcutàniament en ratolins amb o sense tractament anti-PD-L1. Tal com es mostra a la figura 6a-c, l'anti-PD-L1 va augmentar l'efecte d'inhibició del tumor induït per PT associat a la disminució de la proliferació cel·lular i la mort cel·lular augmentada després de la irradiació. A més, per validar els efectes reguladors de l'anti-PD-L1 en el microambient del tumor immune després de la PT, vam examinar la resposta immune mitjançant un model de tumor ortotòpic HCC murí. Les dades mostren que l'anti-PD-L1 va atenuar el reclutament de MDSC i va augmentar els CD3+ TIL associats a tumors més petits en comparació amb PT només (figura 6d-f)

3.6. El bloqueig de PD-L1 millora l'efecte abscopal sobre el càncer de fetge després de la PT

S'ha informat que la radiació indueix efectes abscopals en llocs de càncer llunyans i no tractats que s'amplifican amb l'ús de fàrmacs immunomoduladors [32-34]. En conseqüència, vam examinar més l'efecte abscopal induït per la PT sobre els tumors hepàtics i l'impacte del tractament combinat amb l'anticòs anti-PD-L1. Tal com es mostra a la figura 7a, b i a la figura suplementària S1, l'aplicació de PT local només al tumor va induir tumors més petits amb un metabolisme de glucosa més baix en tumors irradiats sobre la cuixa dreta, però no va mostrar cap inhibició tumoral significativa als tumors secundaris no irradiats a la part superior de l'esquena. , en comparació amb el grup sham-RT. El tractament combinat amb l'anticòs anti-PD-L1 immediatament després de la PT va millorar l'efecte tumoricida en el camp irradiat per PT i va donar lloc a la regressió de tumors secundaris fora del camp irradiat. L'anàlisi de cèl·lules immunitàries que infiltraven tumors va demostrar que l'anti-PD-L1 va atenuar el reclutament de MDSC, va augmentar els CD3+ TIL i va disminuir la proliferació cel·lular en tumors no irradiats (figura 7c, d) de ratolins que van rebre PT local a tumors primaris. Aquests resultats suggereixen que l'anti-PD-L1 va millorar la resposta immune antitumoral i va augmentar l'efecte abscopal en hostes immunocompetents després de la irradiació local de PT.

Figura 4. Resposta immune associada a PT. L'expressió del marcador CD163 a les cèl·lules al final de la polarització dels macròfags M2 es va analitzar mitjançant FACS (a) (I: control; II: + sobrenedant de cultiu de cèl·lules canceroses; III: + cèl·lules canceroses; IV: +6 Gy (RBE) sobrenedant de cultiu de cèl·lules canceroses irradiades amb PT; V: +6 Gy (RBE) cèl·lules canceroses irradiades amb PT). Es va analitzar el percentatge de cèl·lules CD14+HLA-DR- de PBMC incubades amb o sense cèl·lules HuH7 irradiades amb 0, 3 o 6 Gy (RBE) durant 48 h (b) i es va analitzar l'expressió d'iNOS a les cèl·lules CD14+HLA-DR- ordenades es va analitzar mitjançant IF (DAPI, blau; iNOS, vermell) (c). L'extensió de les cèl·lules CD163+ en tumors irradiats 12 dies després de la PT es va examinar mitjançant IF (DAPI, blau; CD163, vermell) (d) i es va avaluar l'efecte de la irradiació de PT sobre el reclutament monocític-MDSC mitjançant FACS ( e). A més, es va examinar la taxa de proliferació de cèl·lules T mitjançant FACS amb o sense incubació amb cèl·lules canceroses irradiades amb PT. Es mostren imatges representatives i dades quantitatives (f). El tractament va indicar cèl·lules T CD8+ amb perles d'estimulació anti-CD3/CD28 en presència de MDSC combinades amb cèl·lules canceroses amb o sense irradiació PT. Les dades es presenten com a mitjanes ± errors estàndard de la mitjana. * p < 0.05.

Figura 5. Efecte del PT sobre l'expressió de PD-L1. Els nivells de PD-L1 es van avaluar mitjançant (a) IF (DAPI, blau; PD-L1, verd), (b) tinció FACS per a cèl·lules canceroses de fetge humans i murí a 48 h després de PT in vitro i (c) FACS, i (d) IF per a tumors hepàtics murins en els moments indicats després de PT per a 12 Gy (RBE) in vivo. L'eix y és el canvi relatiu de plec en l'expressió PD-L1 a les condicions indicades després de PT. Les dades es presenten com a mitjanes ± errors estàndard de la mitjana. * p < 0.05. A més, es va avaluar l'expressió de PD-L1 en cèl·lules CD11b + murines després de la irradiació PT mitjançant (e) IF i (f) anàlisi FACS (cèl·lules CD11b +, taques blaves)

Figura 6. Efecte de PD-L1 sobre la resposta de HCC a PT in vivo. ( a ) L'efecte de la teràpia anti-PD-L1 sobre el retard del creixement del tumor. L'eix y és el canvi relatiu de plec de la mida del tumor subcutani induït per l'anti-PD-L1 després de la PT. Les dades representen les mitjanes dels experiments, * p < {{10}}.05. ( b ) Els efectes in vivo de l'apoptosi induïda pel tractament avaluats mitjançant FACS amb tinció d'Annexina V-PI. L'eix y és el canvi relatiu de plec en la taxa de mort cel·lular després de PT. Les dades es presenten com a mitjanes ± errors estàndard de la mitjana. * p < 0,05. ( c ) Immunohistoquímica per a danys a l'ADN induït per RT i Ki-67 en tumors en els moments indicats després de PT per 12 Gy (RBE). ( d ) L'efecte de la teràpia anti-PD-L1 sobre la inhibició del tumor es va avaluar en un model de tumor ortotòpic. Les imatges representatives i les dades quantitatives es mostren 12 dies després de la irradiació local de PT o la irradiació simulada. L'eix Y és el canvi relatiu del plec en la mida del tumor hepàtic. Les dades representen els mitjans dels experiments, * p < 0,05. (e) L'extensió de les cèl·lules ki67+, CD{3+TIL i CD11b+ en tumors irradiats 12 dies després de la PT es va examinar mitjançant IF (DAPI, blau; ki-67 i CD3, verd) ; CD11b, vermell). (f) L'efecte de l'anti-PD-L1 combinat amb la irradiació PT sobre el reclutament de MDSC es va avaluar mitjançant FACS

Figura 7. L'efecte abscopal sobre el càncer de fetge després de la PT. El creixement de tumors no irradiats a la part superior de l'esquena es va determinar mitjançant l'anàlisi FMT de la captació de glucosa (a) i imatges del tumor (b) en els moments indicats de ratolins que van rebre PT per 12 Gy (RBE) fins al tumor primari només a la cuixa dreta ( PT (+): els ratolins van rebre 12 Gy (RBE) al tumor primari a la cuixa dreta, però no al tumor secundari a la part superior de l'esquena). Les imatges representatives i les dades quantitatives dels tumors no irradiats es mostren a 0, 3 i 12 dies després de la irradiació PT amb o sense teràpia anti-PD-L1. L'eix y representa el canvi relatiu del plec en el valor de FMT i la mida del tumor en el moment indicat després de PT. A més, es mostren imatges representatives del nivell de ki-67 i de la infiltració de cèl·lules CD11b+ i CD3+ en tumors secundaris no irradiats 12 dies després de la PT local mitjançant IF (DAPI, blau; ki{{16} }} i CD3, verd; CD11b, vermell) (c). L'acumulació de MDSC (d) al tumor secundari no irradiat es va analitzar mitjançant citometria de flux. L'eix Y és el canvi relatiu de plec. Les dades representen les mitjanes dels experiments, * p < 0,05

4. Discussió

Els resultats d'aquest estudi mostren que la pèrdua de cèl·lules formadores de colònies induïda per PT depèn de la dosi i és similar a la causada per la irradiació de fotons. El nivell de dany a l'ADN no reparat causat per la radiació és un determinant important de la resposta a la radiació específica del teixit. Les nostres dades revelen que la mort cel·lular induïda per PT es va correlacionar amb l'augment dels nivells de marcadors de dany a l'ADN. S'informa que diverses citocines associades al tumor estan regulades per irradiació i són capaces de reclutar i polaritzar subconjunts immunitaris al microambient del tumor [35,36]. Prèviament, vam informar que l'expressió IL-6 estava regulada per la RT del fotó i que l'augment d'IL6 es correlacionava amb la resposta a la radiació dels tumors hepàtics [28]. Els estudis preclínics han demostrat que hi ha una regulació diferencial dels factors inflamatoris després de la PT versus la radiació fotogràfica, inclosa la IL-6 [6,7,37]. Mostrem mitjançant experiments cel·lulars que la irradiació de PT també va augmentar el nivell d'expressió d'IL-6 de manera dependent de la dosi. La resposta del tumor al tractament està influenciada per la proliferació de cèl·lules tumorals i el microambient del tumor. L'ús de models de ratolí és una estratègia òptima per avaluar la resposta al tractament. Pel que sabem, poques sèries preclíniques han presentat la resposta dels tumors hepàtics a la TP fins ara. En el present estudi es van demostrar les dades in vivo de la mort de cèl·lules tumorals i el retard del creixement del tumor induït per PT en ratolins portadors de tumors hepàtics. A més de la radiosensibilitat cel·lular intrínseca, el recreixement del tumor després de la radioteràpia in vivo es pot veure afectat substancialment per diversos factors inflamatoris i estromals [38,39]. La RT indueix una varietat d'efectes aigües avall relacionats amb el sistema immunitari, inclosos els efectes immunoestimuladors i immunosupressors. La RT estimula la immunitat anticancerígena mitjançant la inducció de la mort de cèl·lules immunogèniques, alliberant nous antígens als components del sistema immunitari, donant lloc posteriorment a una millora de l'amor i l'activació de les cèl·lules T efectores. D'altra banda, la RT condueix a efectes immunosupressors, com ara el reclutament de MDSC al microambient irradiat [39,40]. El reclutament de MDSC és un determinant del microambient tumoral immunosupressor després de la RT. Els MDSC han sorgit com els principals reguladors de les respostes immunes en càncer i altres condicions patològiques. L'evidència dóna suport a les contribucions clau del MDSC a la progressió del tumor. Anteriorment vam informar que l'augment de MDSC podria ser desencadenat per RT i que l'augment estava associat amb la resistència a la RT en un model animal HCC [28]. L'estudi presentat va demostrar que la PT condueix a l'activació del reclutament de MDSC associat a la inducció de MDSC monocítics en ratolins portadors de tumors. Un nou subconjunt de MDSC identificats com a MDSC monocítics es defineix com a monòcits CD14+HLA-DR- de la sang perifèrica dels pacients i CD11b + Ly6G- en ratolins [20,23,41]. L'expressió d'iNOS com a marcador funcional de la inhibició de les cèl·lules T és l'estàndard d'or per a l'avaluació de la funció MDSC [42]. Els experiments amb incubació de PBMC amb cèl·lules canceroses van demostrar que la PT va millorar la capacitat de les cèl·lules canceroses per induir MDSC en monòcits i va augmentar l'expressió d'iNOS al subconjunt de cèl·lules. A més, les nostres dades revelen que el cocultiu amb cèl·lules CD11b + va disminuir la proliferació de cèl·lules T i el càncer irradiat amb PT va atenuar la capacitat supressiva de les cèl·lules CD11b + sobre la proliferació de cèl·lules T en experiments de cocultiu.

S'informa que el llinatge de cèl·lules mieloides constitueix una xarxa de cèl·lules immunosupresores que estan presents en la majoria de pacients amb càncer i que inhibeixen profundament la generació d'immunitat antitumoral. Els macròfags, les cèl·lules immunitàries abundants en el microambient tumoral, són reguladors importants de la inflamació crònica. S'ha suggerit que els macròfags es poden polaritzar cap al fenotip M2, que contribueix al microambient immunosupressor [43]. Les cèl·lules mononuclears dels tumors probablement existeixen en diverses fases de diferenciació des de monòcits/MDSC monocítics fins als macròfags M2 associats al tumor. Aquesta xarxa entre MDSC i macròfags M2 associats al tumor revela que es pot distingir M2 dels MDSC monocítics. L'evidència suggereix que la RT té un paper regulador en els macròfags amb polarització M1/M2 per modular la resposta immune [44,45]. Vam demostrar que el cocultiu amb cèl·lules irradiades amb PT va donar lloc a una major expressió de marcadors M2 in vitro i tumors irradiats amb PT in vivo. L'activació de les respostes immunes anticancerígenes és fonamental per a l'eficàcia de la RT.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Múltiples mecanismes immunitaris són importants en el desenvolupament i la progressió de l'HCC i es correlacionen amb el pronòstic. Els inhibidors de checkpoint dirigits a PD1 i PDL1 són actius, tolerables i clínicament beneficiosos contra l'HCC avançat [46]. PD-L1, un biomarcador cel·lular important, juga un paper en l'evasió immune, inclosa la inhibició de la vigilància immune mediada per cèl·lules T i la regulació de la polarització dels macròfags M2 [13,31,47]. Es va observar una regulació a l'alça de l'eix PD-1/PD-L1 per suprimir l'acció citotòxica de les cèl·lules T, que pot ser la causa de les respostes immunitàries de l'hoste que evita el tumor i la destrucció incompleta de cèl·lules tumorals després de la irradiació. PD-L1 es va localitzar àmpliament a les cèl·lules hematopoètiques, incloses les cèl·lules T, els macròfags i les cèl·lules tumorals. PD-1/PD-L1 és un punt de control immunitari notable que condueix a l'anèrgia de les cèl·lules T. S'han aprovat anticossos contra PD-L1, un bloqueig del punt de control immunitari, per a la teràpia adjuvant d'alguns càncers i com a immunoteràpia prometedora per a pacients amb HCC avançats [48,49]. Els inhibidors de PDL1 són un dels eixos vertebradors de les teràpies sistèmiques en la pràctica clínica o en desenvolupament per a l'HCC. A més, els efectes immunosupressors induïts per RT revelen el potencial de combinar amb èxit la radiació amb diverses formes d'immunoteràpia per eliminar aquests efectes immunosupressors. Els MDSC poden contribuir a la resistència del pacient a la inhibició del punt de control immune. Hem demostrat que la PT va regular l'expressió de PD-L1 en tumors i MDSC de manera dependent de la dosi in vitro i in vivo. Els efectes immunosupressors induïts per RT revelen el potencial de combinar amb èxit la radiació amb diverses formes d'immunoteràpia per eliminar aquests efectes immunosupressors. La investigació preclínica ha demostrat que la combinació de foton RT i immunoteràpia presenta sinergisme terapèutic per millorar el control del tumor [15]. Com sabem, la combinació de RT i immunoteràpia encara es troba en les seves etapes preliminars, i no hi ha especificacions òptimes de dosi de RT, tipus de RT o seqüenciació per a RT i immunoteràpia. Per aclarir aquest problema de la irradiació PT combinada amb la immunoteràpia, vam combinar la teràpia anti-PD-L1 amb la irradiació PT de tumors hepàtics en models de tumors singènics. Vam trobar que la combinació amb l'anticòs anti-PD-L1 va sensibilitzar el càncer de fetge a la irradiació de PT, com ho demostra un tumor més petit associat a la mort de cèl·lules tumorals augmentades. A més, la teràpia anti-PD-L1 va inhibir el reclutament de MDSC i va augmentar la filtració de cèl·lules T CD3+ en tumors irradiats amb PT.

La RT es considera clàssicament com una teràpia local, matant les cèl·lules tumorals mitjançant danys intrínsecs a l'ADN al camp de radiació. A més, la resposta abscopal a la radiació és un fenomen ben establert on els tumors fora d'un camp de radiació també responen al tractament. Es creu que l'efecte abscopal està mediat per la immunitat. Una part de les cèl·lules canceroses d'un tumor morirà per mort de cèl·lules immunogèniques quan la radiació s'utilitza a dosis terapèutiques. La mort de cèl·lules tumorals induïda per RT està associada a la generació de senyals moleculars específics i a la presentació de més antígens als components del sistema immunitari. S'ha informat que la RT pot desencadenar un efecte abscopal relacionat amb la immunitat, la qual cosa implica que la RT no només té un efecte tumoricida sobre el tumor objectiu, sinó que també té un efecte antitumoral en llocs distants i no tractats del càncer [32,50,51]. Entre els factors induïts per RT, la capacitat de la radiació per promoure el reconeixement de cèl·lules canceroses per part de les cèl·lules T és probable que tingui una importància especial per a l'efecte abscopal. Aquest efecte s'associa amb la mort de cèl·lules tumorals per estimular la immunitat antitumoral que es pot amplificar mitjançant l'ús d'agents immunomoduladors. A més, el pembrolizumab produeix una taxa del 15-20% de remissions objectives que s'associen amb una supervivència prolongada en l'HCC [46]. Un punt crític pel que fa als inhibidors dels punts de control és la seva eficàcia i seguretat. És evident que la immunoteràpia no aporta beneficis per a tots els pacients. Com superar la resistència del tumor a la immunoteràpia és un tema important. Les causes potencials de la resistència del tumor inclouen la resistència intrínseca i el desenvolupament d'anticossos anti-fàrmacs que neutralitzen l'activitat de la immunoteràpia. Per obtenir una forta estimulació immune, es poden combinar diferents teràpies locals de manera seqüencial o simultània amb la immunoteràpia sistèmica. És probable que la immunoteràpia faci sinergia amb les intervencions locals en l'HCC. L'HCC sovint és multifocal amb àrees potencials precanceroses que es desenvolupen com a metacròniques. Aquí, vam examinar més si la combinació de PT amb anti-PD-L1 millora l'efecte abscopal de PT per augmentar el control dels tumors hepàtics metacrònics. Les nostres dades revelen que la combinació de PT amb anti-PD-L1 va induir mides tumorals més petites en els tumors secundaris no irradiats en comparació amb els induïts per PT o anti-PD-L1 sols. Les nostres dades també mostren que la combinació amb anti-PD-L1 es va associar amb TIL augmentats i reclutament atenuat de MDSC en tumors llunyans no irradiats de ratolins que van rebre PT local. Aquests resultats suggereixen que l'anti-PD-L1 va augmentar la immunitat antitumoral, que va mediar l'augment de les activitats de matança de tumors primaris i l'efecte abscopal en ratolins portadors de tumors que van rebre irradiació local de PT.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

5. Conclusions

La raó per combinar la radioteràpia i la immunoteràpia és que la radiació podria produir immunitat antitumoral sinèrgica i que la immunoteràpia supera les respostes de supressió immune en el microentorn del tumor irradiat. En resum, suggerim que, a més de l'efecte biològic sobre les cèl·lules canceroses, la PT també té un efecte de modulació immune en el microambient del tumor. Les nostres dades revelen que l'anti-PD-L1 va provocar immunitat contra el càncer i, posteriorment, va augmentar la resposta dels tumors primaris i distants a la irradiació de PT. L'aplicació d'anti-PD-L1 combinada amb PT podria ser una estratègia prometedora per al tractament de l'HCC.

Referències

1. Bray, F.; Ferlay, J.; Soerjomataram, I.; Siegel, R.-L.; Torre, L.-A.; Jemal, A. Global cancer statistics 2018: estimacions GLOBOCAN d'incidència i mortalitat a tot el món per a 36 càncers a 185 països. CA Càncer J. Clin. 2018, 68, 394–424. [Ref creuat]

2. Chuong, M.; Kaiser, A.; Molitoris, J.; Méndez Romero, A.; Apisarnthanarax, S. Teràpia de raig de protons per a càncers de fetge. J. Gastrointest. Oncol. 2020, 11, 157–165. [Ref creuat]

3. Jo, G.-S.; Yu, J.-I.; Parc, H.-C. Teràpia de protons per al carcinoma hepatocel·lular: coneixements actuals i perspectives de futur. Món J. Gastroenterol. 2018, 24, 3090–3100. [Ref creuat]

4. Yuan, T.-Z.; Zhan, Z.-J.; Qian, C.-N. Noves fronteres en la teràpia de protons: aplicacions en càncers. Càncer Commun. 2019, 39, 61. [CrossRef] [PubMed]

5. Deycmar, S.; Faccin, E.; Kazimova, T.; Knobel, P.-A.; Telarovic, I.; Tschanz, F.; Waller, V.; Winkler, R.; Yong, C.; Zingariello, D. L'eficàcia biològica relativa de la irradiació de protons en dependència de la reparació del dany a l'ADN. Br. J. Radiol. 2020, 93, 20190494. [CrossRef] [PubMed]

6. Luhr, A.; von Neubeck, C.; Krause, M.; Troost, EGC Eficàcia biològica relativa en la teràpia amb feixos de protons-Coneixements actuals i reptes futurs. Clin. Trad. Radiat. Oncol. 2018, 9, 35–41. [Ref creuat]

7. Girdhani, S.; Sachs, R.; Hlatky, L. Efectes biològics de la radiació de protons: el que sabem i el que no sabem. Radiat. Res. 2013, 179, 257–272. [Ref creuat]

8. Van Limbergen, E.-J.; De Ruysscher, D.-K.; Olivo Pimentel, V.; Marcus, D.; Berbee, M.; Hoeben, A.; Rekers, N.; Theys, J.; Yaromina, A.; Dubois, L.-J.; et al. Combinant la radioteràpia amb la immunoteràpia: el passat, el present i el futur. Br. J. Radiol. 2017, 90, 20170157. [CrossRef]

9. Shabason, J.-E.; Minn, A.-J. Bloqueig del punt de control immune i de radiació: del banc a la clínica. Semin. Radiat. Oncol. 2017, 27, 289–298. [CrossRef] [PubMed]

10. Lu, C.; Rong, D.; Zhang, B.; Zheng, W.; Wang, X.; Chen, Z.; Tang, W. Perspectives actuals sobre el microambient tumoral immunosupressor en el carcinoma hepatocel·lular: reptes i oportunitats. Mol. Càncer 2019, 18, 130. [CrossRef]

11. Baird, J.-R.; Monjazeb, A.-M.; Shah, O.; McGee, H.; Murphy, W.-J.; Crittenden, M.-R.; Gough, M.-J. Estimular la immunitat innata per millorar el control del tumor induït per la radioteràpia. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2017, 99, 362–373. [Ref creuat]

12. Bernstein, M.-B.; Krishnan, S.; Hodge, J.-W.; Chang, J.-Y. Immunoteràpia i radioteràpia ablativa estereotàctica (ISABR): un enfocament curatiu? Nat. Reverent Clin. Oncol. 2016, 13, 516–524. [CrossRef] [PubMed]

13. Pilones, K.-A.; Vanpouille-Box, C.; Demaria, S. Combinació de radioteràpia i inhibidors del punt de control immunitari. Semin. Radiat. Oncol. 2015, 25, 28–33. [CrossRef] [PubMed]

14. Ishihara, D.; Pop, L.; Takeshima, T.; Iyengar, P.; Hannan, R. Justificació i evidència per combinar la radioteràpia i la immunoteràpia per al tractament del càncer. Càncer Immunol. Immunoaltre. 2017, 66, 281–298. [Ref creuat]

15. Lee, Y.-H.; Tai, D.; Yip, C.; Choo, S.-P.; Chew, V. Immunoteràpia combinada per al carcinoma hepatocel·lular: radioteràpia, bloqueig del punt de control immune i més enllà. Davant. Immunol. 2020, 11, 568759. [CrossRef] [PubMed]

16. Choi, C.; Jo, G.-S.; Cho, W.-K.; Parc, H.-C. Optimització de la radioteràpia amb bloqueig del punt de control immunitari en el carcinoma hepatocel·lular. Món J. Gastroenterol. 25, 2019, 2416–2429. [Ref creuat]

17. Genin, M.; Climent, F.; Fattaccioli, A.; Raes, M.; Els macròfags Michiels, C. M1 i M2 derivats de cèl·lules THP-1 modulen de manera diferent la resposta de les cèl·lules canceroses a l'etopòsid. BMC Cancer 2015, 15, 577. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, F.; Feng, Y.-C.; Zhao, G.; Zhang, R.; Cheng, Z.-Z.; Kong, W.-N.; Wu, H.-L.; Xu, B.; Lv, X.; Ma, XM La infiltració de macròfags CD163(+) M2 associada al tumor està molt associada amb l'expressió PD-L1 en càncer de coll uterí. Gestió del càncer. Res. 2020, 12, 5831–5843. [Ref creuat]

19. Cassetta, L.; No, R.; Swierczak, A.; Sugano, G.; Smith, H.; Wiechmann, L.; Pollard, J.-W. Aïllament de macròfags associats a tumors humans i de ratolí. Adv. Exp. Med. Biol. 2016, 899, 211–229.

20. Chikamatsu, K.; Sakakura, K.; Toyoda, M.; Takahashi, K.; Yamamoto, T.; Masuyama, K. Activitat immunosupressora de les cèl·lules CD14+ HLA-DR- en el carcinoma de cèl·lules escamoses del cap i el coll. Càncer Ciència. 2012, 103, 976–983. [Ref creuat]

21. Chen, M.-F.; Kuan, F.-C.; Yen, T.-C.; Lu, M.-S.; Lin, P.-Y.; Chung, Y.-H.; Chen, W.-C.; Lee, K.-D. Les cèl·lules supressores de CD11b+ estimulades per IL-6-CD14+ HLA-DR- derivades de mieloides s'associen amb progressió i mal pronòstic en el carcinoma de cèl·lules escamoses de l'esòfag. Oncotarget 2014, 5, 8716–8728. [Ref creuat]

22. Paganetti, H. Valors d'efectivitat biològica relativa (RBE) per a la teràpia amb feix de protons. Variacions en funció del punt final biològic, la dosi i la transferència d'energia lineal. Phys. Med. Biol. 2014, 59, R419–R472. [CrossRef] [PubMed]

23. Bronte, V.; Brandau, S.; Chen, S.-H.; Colombo, M.-P.; Frey, A.-B.; Greten, T.-F.; Mandruzzato, S.; Murray, P.-J.; Ochoa, A.; Ostrand Rosenberg, S.; et al. Recomanacions per a la nomenclatura i els estàndards de caracterització de cèl·lules supressores derivades de mieloides. Nat. Commun. 2016, 7, 12150. [CrossRef]

24. Curtis, M.-J.; Bond, R.-A.; Espina, D.; Ahluwalia, A.; Alexander, SPA; Giembycz, M.-A.; Gilchrist, A.; Hoyer, D.; Insel, P.-A.; Izzo, A.-A. Disseny i anàlisi experimentals i els seus informes: nova guia per a la publicació a BJP. Br. J. Pharmacol. 2015, 172, 3461–3471. [Ref creuat]

25. Haikerwal, S.-J.; Hagekyriakou, J.; MacManus, M.; Martín, O.-A.; Haynes, N.-M. Construir la immunitat contra el càncer amb la radioteràpia. Càncer Lett. 2015, 368, 198–208. [CrossRef] [PubMed]

26. Yuan, S.; Liu, Z.; Xu, Z.; Liu, J.; Zhang, J. Caixa de grup d'alta mobilitat 1 (HMGB1): un regulador fonamental de les malalties hematopoètiques. J. Hematol. Oncol. 2020, 13, 91. [CrossRef] [PubMed]

27. Suzuki, Y.; Mimura, K.; Yoshimoto, Y.; Watanabe, M.; Ohkubo, Y.; Izawa, S.; Murata, K.; Fujii, H.; Nakano, T.; Kono, K. Mort de cèl·lules tumorals immunogèniques induïda per quimioradioteràpia en pacients amb carcinoma de cèl·lules escamoses d'esòfag. Càncer. Res. 2012, 72, 3967–3976. [Ref creuat]

28. Chen, M.-F.; Hsieh, C.-C.; Chen, W.-C.; Lai, C.-H. Paper de la interleucina-6 en la resposta a la radiació dels tumors hepàtics. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2012, 84, e621–e630. [CrossRef] [PubMed]

29. Liao, Y.; Liu, S.; Fu, S.; Wu, J. HMGB1 en radioteràpia: un senyal de dos caps que regula la radiosensibilitat i la immunitat del tumor. Oncol. Objectius Allà. 2020, 13, 6859–6871. [Ref creuat]

30. Guo, Y.; Xu, F.; Lu, T.; Duan, Z.; Zhang, Z. Via de senyalització de la interleucina-6 en la teràpia dirigida per al càncer. Tractament contra el càncer. Rev. 2012, 38, 904–910. [Ref creuat]

31. Afreen, S.; Dermime, S. La molècula immunoinhibidora B7-H1 com a objectiu potencial en càncer: matar molts ocells d'un tret. Hematol. Oncol. Tija. Cèl·lula. Allà. 2014, 7, 1–17. [Ref creuat]

32. Formenti, S.-C.; Demaria, S. Radioteràpia per convertir el tumor en una vacuna in situ. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2012, 84, 879–880. [Ref creuat]

33. Rodríguez-Ruiz, M.-E.; Vitale, I.; Harrington, K.-J.; Melero, I.; Galluzzi, L. Impacte immunològic de la senyalització de la mort cel·lular impulsada per la radiació en el microambient tumoral. Nat. Immunol. 2020, 21, 120–134. [Ref creuat]

34. Liu, Y.; Dong, Y.; Kong, L.; Shi, F.; Zhu, H.; Yu, J. Efecte abscopal de la radioteràpia combinada amb inhibidors del punt de control immune. J. Hematol. Oncol. 2018, 11, 104. [CrossRef] [PubMed] 35. Hill, R.-P. El paradigma canviant de la resposta del tumor a la irradiació. Br. J. Radiol. 2017, 90, 20160474. [CrossRef]

36. Mukherjee, S.; Chakraborty, A. Fenomen del espectador induït per radiació: visió i implicacions en radioteràpia. Int. J. Radiat. Biol. 2019, 95, 243–263. [CrossRef] [PubMed]

37. Gameiro, S.-R.; Malamas, A.-S.; Bernstein, M.-B.; Tsang, K.-Y.; Vassantachart, A.; Sahoo, N.; Sastre, R.; Pidikiti, R.; Guha, C.-P.; Hahn, S.-M.; et al. Les cèl·lules tumorals que sobreviuen a l'exposició a la radiació de protons o fotons comparteixen una signatura de modulació immunogènica comuna, fent-les més sensibles a la mort mediada per cèl·lules T. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2016, 95, 120–130. [Ref creuat]

38. Sol, Y.; Nelson, P.-S. Vies moleculars: implicant respostes de dany del microambient en la resistència a la teràpia del càncer. Clin. Càncer Res. 2012, 18, 4019–4025. [CrossRef] [PubMed]

39. Kozin, S.-V.; Kamoun, W.-S.; Huang, Y.; Dawson, M.-R.; Jain, R.-K.; Duda, D.-G. El reclutament de cèl·lules precursores mieloides però no endotelials facilita el recreixement del tumor després de la irradiació local. Càncer Res. 2010, 70, 5679–5685. [CrossRef] [PubMed]

40. Kao, J.; Ko, E.-C.; Eisenstein, S.; Sikora, A.-G.; Fu, S.; Chen, S.-H. Orientació a les cèl·lules supressores derivades de mieloides que suprimeixen el sistema immunitari en oncologia. Crit. Reverent Oncol. Hematol. 2011, 77, 12–19. [Ref creuat]

41. Hoechst, B.; Ormandy, LA; Ballmaier, M.; Lehner, F.; Krüger, C.; Manns, diputat; Greten, TF; Korangy, F. Una nova població de cèl·lules supressores derivades de mieloides en pacients amb carcinoma hepatocel·lular indueix cèl·lules T CD4(+)CD25(+)Foxp3(+). Gastroenterologia 2008, 135, 234–243. [CrossRef] [PubMed]

42. Hsu, C.-Y.; Lin, Y.-C.; Chang, L.-Y.; Huang, S.-K.; Huang, C.-H.; Yang, C.-K.; Huang, C.-T.; Lin, C.-Y. Paper terapèutic de la sintasa d'òxid nítric inducible que expressa cèl·lules supressores derivades de mieloides en la insuficiència hepàtica murina induïda per acetaminofè. Davant. Immunol. 2020, 11, 574839. [CrossRef]

43. Pollard, J.-W. Els macròfags educats en tumors promouen la progressió del tumor i la metàstasi. Nat. Rev. Càncer 2004, 4, 71–78. [CrossRef] [PubMed]

44. Wang, L.-X.; Zhang, S.-X.; Wu, H.-J.; Rong, X.-L.; Guo, J. La polarització dels macròfags M2b i el seu paper en les malalties. J. Leukoc. Biol. 2019, 106, 345–358. [CrossRef] [PubMed]

45. Chiang, C.-S.; Fu, S.-Y.; Wang, S.-C.; Yu, C.-F.; Chen, F.-H.; Lin, C.-M.; Hong, J.-H. La irradiació promou un fenotip de macròfag m2 en la hipòxia tumoral. Davant. Oncol. 2012, 2, 89. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Sangro, B.; Sarobe, P.; Hervás-Stubbs, S.; Melero, I. Avenços en immunoteràpia per al carcinoma hepatocel·lular. Nat. Reverent Gastroenterol. Hepatol. 2021, 18, 525–543. [Ref creuat]

47. Lu, D.; Ni, Z.; Liu, X.; Feng, S.; Dong, X.; Shi, X.; Zhai, J.; Mai, S.; Jiang, J.; Wang, Z.; et al. Més enllà de les cèl·lules T: comprensió del paper de PD-1/PD-L1 en macròfags associats a tumors. J. Immunol. Res. 2019, 2019, 1919082. [CrossRef]

48. Cheng, A.-L.; Hsu, C.; Chan, S.-L.; Choo, S.-P.; Kudo, M. Reptes de la teràpia combinada amb inhibidors del punt de control immune per al carcinoma hepatocel·lular. J. Hepatol. 2020, 72, 307–319. [Ref creuat]

49. Hack, S.-P.; Spahn, J.; Chen, M.; Cheng, A.-L.; Kaseb, A.; Kudo, M.; Lee, HC; Yopp, A.; Chow, P.; Qin, S. IMbrave 050: un assaig de fase III d'atezoli zumab més bevacizumab en carcinoma hepatocel·lular d'alt risc després d'una resecció o ablació curativa. Futur Oncol. 2020, 16, 975–989. [Ref creuat]

50. Parc, S.-S.; Dong, H.; Liu, X.; Harrington, S.-M.; Krco, C.-J.; Grams, M.-P.; Mansfield, A.-S.; Furutani, K.-M.; Olivier, K.-R.; Kwon, E.-D. La PD-1 restringeix l'efecte abscopal induït per la radioteràpia. Càncer Immunol. Res. 2015, 3, 610–619. [Ref creuat]

51. Demaria, S.; Ng, B.; Devitt, M.-L.; Babb, J.-S.; Kawashima, N.; Liebes, L.; Formenti, S.-C. La inhibició de la radiació ionitzant de tumors llunyans no tractats (efecte abscopal) està mediada per la immunitat. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004, 58, 862–870. [CrossRef] [PubMed]