Caracterització del risc de rebuig renal pre-trasplantament i post-trasplantament per seqüenciació del repertori immunitari de cèl·lules B

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

L'estudi del repertori immunitari en el context del trasplantament d'òrgans proporciona informació important sobre com la immunitat adaptativa pot contribuir i modular el rebuig de l'empelt. Aquí caracteritzem el repertori immunitari de la sang perifèrica dels individus abans i desprésronyótrasplantament mitjançant la seqüenciació del receptor de cèl·lules B en un estudi clínic longitudinal. Les persones que desenvolupen rebuig després del trasplantament tenen un repertori immunitari més divers abans del trasplantament, cosa que suggereix una predisposició al risc de rebuig després del trasplantament. A més, durant 2 anys de seguiment, els pacients que desenvolupen rebuig demostren un conjunt específic de clons expandits que persisteixen després del rebuig. Tot i que hi ha una reducció global de la diversitat de cèl·lules B perifèriques, probablement a causa de l'augment de l'exposició a la immunosupressió general en aquesta cohort, la detecció de l'ús específic del gen IGHV en tots els pacients que rebutgen admet que un conjunt comú d'antígens immunogènics pot provocar el rebuig posterior al trasplantament. Les nostres troballes poden tenir implicacions clíniques per a la predicció i la gestió clínica del rebuig del trasplantament renal.

Ronyóel trasplantament és el tractament preferit de la malaltia renal terminal (ESRD) i crònicaronyómalaltia. Tot i que hi ha hagut millores significatives en les tecnologies i la concordança de teixits basades en proves d'histocompatibilitat per a antígens de leucòcits humans donant/receptor (HLA)1, predir el resultat de l'empelt encara és un problema sense resoldre. El desajustament dels teixits mesurats en altres loci23 menors, no HLA, també pot provocar lesions aloimmunes amb rebuig agut i crònic, donant lloc a resultats pobres de l'empelt a llarg termini4. A més, al voltant del 50 per centronyóEls al·loempelts, sense desajustos importants de HLA, encara es perden dins dels 10 anys posteriors al trasplantament². Anteriorment hem plantejat la hipòtesi que els loci no HLA poden influir en la resposta immune del receptor contra el seuronyódonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 anticossos diferents0, que els permet reconèixer una gran varietat d'antígens estrangers. Els BCR humans o Ig consisteixen en dues cadenes pesades (I) idèntiques formades per cinc isotips: IgM, IgD, IgA, IgE i IgG, i dues cadenes lleugeres. L'anticòs intacte conté un domini variable i un domini constant. La unió a l'antigen es produeix al domini variable, que es genera mitjançant la recombinació d'un conjunt de segments gènics variable (V), diversitat (D) i unint (J) que formen el repertori immunitari de les cèl·lules B, i la seva diversitat es concentra principalment en el regió determinant complementària 3 (CDR3). Durant el procés de maduració de l'afinitat, es produeix una hipermutació somàtica (SHM) a la regió variable. Una potent resposta immune adaptativa depèn de l'expansió dels clons de cèl·lules B i d'un procés anomenat maduració de l'afinitat, durant el qual s'introdueixen mutacions somàtiques en els reordenaments del gen Ig i se seleccionen cèl·lules B amb més afinitat per a un antigen determinat.

L'estudi del repertori immunitari en el trasplantament d'òrgans és crucial per entendre què desencadena i manté el procés de rebuig i com pot accelerar el camí cap a la fallada de l'empelt. Amb els avenços de la seqüenciació de la propera generació i els enfocaments computacionals robusts, podem estudiar la regió VDJ amb detall,12. Fins ara, l'anàlisi del repertori immunitari de cèl·lules T aronyóel trasplantament s'ha dut a terme en un nombre molt limitat de pacientsl3-15, i tot i que BCRSeq s'ha aplicat a altres malalties i respostes immunitàries humanes, com ara l'eslèrosi múltiple6, la vacuna contra la grip7 o els trastorns d'immunodeficiència8, hi ha una manca d'estudis sobre trasplantaments. rebuig. En aronyótrasplantament, BCRSeq només s'ha realitzat en el context de tolerància, sensibilitzat a HLAronyócandidats a trasplantament sotmesos a teràpia de desensibilització20 i infiltració de cèl·lules B comparant l'expansió clonal en sang i empelt2l. Una altra aplicació sobre BCRSeq en el trasplantament es va publicar prèviament en una petita cohort de 12 receptors de trasplantament cardíac.

Reconeixent la importància del braç humoral de la resposta immune en el rebuig tardà del trasplantament i la fallada crònica de l'al·lograft, caracteritzem el repertori immunitari de la sang perifèrica mitjançant BCRSeq en un estudi prospectiu i longitudinal. Trobem que la diversitat del repertori immunitari abans del trasplantament és més alta en aquells individus que rebutgen elronyómostrant també l'expansió de certs clons i gens IGHV al llarg dels 24 mesos de seguiment. Aquests resultats poden ajudar a predir el risc de rebuig abans de l'empelt i poden tenir implicacions clíniques en la detecció d'antígens particulars que provoquen el rebuig.

Cistanche és bo per a la funció renal

Resultats

Matèries d'estudi. Vam realitzar BCRSeq en 83 mostres de sang perifèrica de 27 pacients únics i vam executar el pipeline analític que es mostra a la Fig.1. En aquest estudi es van considerar tres grups de fenotips clínics, definits per lectures de patologia central cegada de biòpsies d'al·loempelt en sèrie puntuades pels criteris de Banff23,24 i la puntuació de l'índex de dany d'al·lograft crònic (CADI): no progressistes (NP; n=10) tenien una puntuació CADI no incremental baixa sense rebuig agut, els progressistes sense rebuig (PNR; n=10) ​​tenien una puntuació CADI incremental durant 2 anys sense rebuig, i els progressistes amb rebuig (PR; n=7) tenien puntuacions CADI elevades incrementals durant 2 anys amb episodis de rebuig. Demografia, causesronyófracàs, i l'ús de la immunosupressió es proporciona a la taula 1. És important destacar algunes característiques d'aquests pacients. L'estudi dels pares en què es van inscriure aquests pacients va tenir una taxa general baixa (17 per cent) de rebuig agut confirmat per biòpsia (temps de rebuig mitjà de {min, màxim}=12 {6,24} mesos). Tots aquests pacients tenien un baix risc immunològic de rebuig (estat màxim de sensibilització dels anticossos reactius del panell<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Seqüenciació del repertori immunitari de cèl·lules B. BCRSeq es va fer amb mostres d'ADN genòmic (gDNA) extretes de coàguls de sang en 81 mostres de 27ronyóreceptors de trasplantament en tres moments (0, 6, 24 mesos). La seqüenciació va obtenir un nombre total de 327.703 lectures (mitjana 4.045/mostra) després del control de qualitat (vegeu la secció de mètodes). Per a la validació dels resultats i una avaluació addicional de cada isotip, també vam extreure ARN de PBMC coincidents que estaven disponibles per a 55 mostres, recollides al mateix temps que el coàgul de sang i vam realitzar una seqüenciació complementària d'ADN (ADNc) a més profunditat obtenint 1.773.330 lectures. per a IgD (mitjana 31.667/mostra), 1.708.227 lectures per a IgM (mitjana 30.504/mostra), 973.444 lectures per a IgA (mitjana 17.383/mostra), 139.7345 lectures per IgG (mitjana 29/mostra), {973.444 lectures per a IgG (mitjana 29/mostra) }} llegeix per IgE (mitjana 5178/mostra) (figura suplementària 1). Les biblioteques per a cada isotip es van amplificar per separat i després es van agrupar per a la seqüenciació; per tant, l'anàlisi comparativa d'isotips creuats no és factible.

Tal com es mostra a la figura 1b, vam definir un clon com un grup de cèl·lules descendents d'una molècula ancestral comú que té el mateix segment IGHV i IGHJ, la mateixa longitud de CDR3 i una identitat de nucleòtids del 90 per cent entre CDR3 tal com es va definir anteriorment en estudis de B adaptatiu. -respostes cel·lulars'8. Aquesta definició permet estudiar la diversitat, els cons compartits o comuns i l'expansió clonal en el context de l'al·loimmunitat enronyótrasplantaments. El nombre de cons únics per individu en cada moment es mostra com a gràfic de barres al material suplementari (figura suplementària 1). Per a la rigorositat de l'anàlisi de dades, vam descomptar mostres amb<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">ronyótrasplantament, caracteritzat per la proliferació d'Epstein Barr

Fig. 1 Conducció global de l'estudi.a Representació esquemàtica de l'estructura d'anticossos i del procés de recombinació VDJ responsable de la diversitat produïda en el repertori immunitari.b Clon de cèl·lules B definit com a cèl·lules d'un avantpassat comú i canal analític c de l'estudi: cèl·lules B seqüenciació de gDNA i cDNA, anàlisi de diversitat tenint en compte el nombre de clons (riquesa) i la freqüència de cada clon (entropia de Shannon), anàlisi de xarxa i anàlisi clonal i IGHVgen

cèl·lules B infectades amb virus (EBV). Vam observar un augment del nombre de clons en el temps 6 en aquest pacient, amb una diversitat clonal més baixa abansronyótrasplantament i als 24 mesos després del trasplantament de ronyó. Com que les biblioteques es van amplificar a partir d'una quantitat invariant de plantilla, una fracció més alta de cèl·lules B a la sang pot haver donat lloc a un nombre més gran de clonotips representats als productes seqüenciats. A causa del procés patològic diferent i únic en aquest pacient, aquesta mostra es va excloure de les anàlisis futures.

La diversitat de cèl·lules B abans del trasplantament s'associa amb el rebuig. Tal com es mostra a la figura 1c, vam examinar la diversitat del repertori immunitari de les cèl·lules B tenint en compte la riquesa d'espècies (nombre de clons únics) i l'entropia de Shannon (equació (1) dels mètodes) a través dels punts de temps i els resultats clínics mitjançant un model de regressió lineal tenint en compte el nombre. de clons o entropia com a variable dependent i resultat clínic o SHM com a variable de factor independent. El repertori abansronyóel trasplantament a PR va ser significativament més divers que al NP (riquesa: valor P=0,005, entropia: valor P=0,01) amb la mateixa tendència que persisteix als 6 mesos desprésronyótrasplantament (riquesa: valor P=0.02, entropia: valor P=0.02), i sense diferències de grup distingibles als 2 anys després del trasplantament (Fig. 2a). i Fig. 2 suplementària). Les dades de seqüenciació d'ADNc després del trasplantament van mostrar la mateixa tendència en una major diversitat de repertori als 6 mesos després del trasplantament, principalment per als isotips d'IgD (riquesa: valor P=0.02, entropia: valor P=0. 03) (Fig. 2b i Fig. 2 suplementària). No hi va haver cap efecte de confusió sobre les dades de diverses variables demogràfiques i clíniques, com ara l'edat del receptor, el gènere, la raça, la font del donant, el tipus d'immunosupressió, el desajust HLA i la causa de la insuficiència renal. Com que la resposta de les cèl·lules B d'un nen d'1-anys (l'edat mínima de les dades) i d'{23}}anys (l'edat màxima de les dades) pot ser molt diferent, vam realitzar una sensibilitat anàlisi excloent aquests dos pacients i els resultats es van mantenir significatius (NP vs. PR en el temps 0: riquesa: valor P=0,01, entropia: valor P=0,03). En una altra mesura de la diversitat del repertori immunitari, vam avaluar l'SHM, definit com la freqüència de mutacions a cada segment del gen V, i vam trobar una tendència a un nombre més elevat de SHM per a PR abans del trasplantament i una tendència a un SHM més alt en l'isotip IgD. en PR als 6 mesos després del trasplantament (valor P=0,06).

La diversitat de cèl·lules B canvia al llarg del temps segons el resultat clínic. Per esbrinar si la diversitat del repertori immunitari canvia al llarg del temps pel resultat clínic, vam modelar les dades longitudinals mitjançant models d'efectes mixtos lineals tenint en compte la interacció entre el resultat clínic i el temps. Vam trobar que NP i PR es van comportar de manera diferent al llarg del temps després del trasplantament, mostrant un augment de la diversitat en NP i una disminució de la diversitat en PR, mentre que per a PNR la diversitat es va mantenir invariable al llarg del temps. Això es va observar per a l'ADNg (riquesa: valor P=0.007, entropia: valor P=0.001, figura 3a) i tots els isotips per a l'ADNc, sent les diferències més significatives en entropia. per als isotips IgM i IgD (IgA: valor P=0,07, IgD: valor P=0,02, IgG: valor P=0,05, IgM: valor P=0.04, Fig. 3b). Els diagrames de riquesa amb els valors P corresponents es mostren a la figura suplementària 3. Tal com s'observa a les parcel·les, un individu té una mostra addicional en un moment de 32 mesos, cosa que podria distorsionar els resultats, per la qual cosa es va realitzar una anàlisi de sensibilitat excloent aquesta mostra de l'anàlisi i l'observació de resultats similars excepte per als isotips IgG i IgM on es perd la significació (entropia d'ADNg: valor P=0.004. Entropia d'ADNc: IgA: valor P=0.1 , IgD: valor P=0,05, IgG: valor P=0,08, IgM: valor P=0,1).

Les mesures de diversitat poden veure's afectades pel mostreig biològic i tècnic. La diversitat d'una mostra pot diferir notablement de la diversitat global d'un repertori, ja que només es representa una fracció de milers de milions de cèl·lules, que es coneix com el problema de les espècies desaparegudes. El mostreig tècnic pot existir perquè cada mostra pot variar en profunditat de seqüenciació i cert grau d'errors experimentals. Per fer front al problema de les espècies desaparegudes, hem utilitzat l'eina Recon (reconstrucció de clons estimats a partir de nombres observats)29, que estima la distribució global de la mida del clon. Recon produeix estimacions precises i robustes d'un conjunt de mesures de diversitat, incloses la riquesa i l'entropia, que permeten comparacions sòlides de la diversitat entre individus. Per fer front a la profunditat de seqüenciació i cert grau d'errors experimentals, vam realitzar una estratègia de mostreig inferior; una estratègia molt ben utilitzada en l'anàlisi del repertori immunitari11,17,30. A l'anàlisi de Recon (figura suplementària S4: A–E), es van replicar tant la riquesa com la diversitat per a les dades d'ADNg. A les dades de l'ADNc, l'isotip d'IgD de temps 6 mostra la tendència, però no va assolir significativitat tot i que es van replicar els resultats longitudinals dels isotips IgA, IgD i IgG. A l'anàlisi de mostreig inferior (figura suplementària S4: F–J), tot es replica, però el temps és 0 per a les dades d'ADNg. Això podria ser una conseqüència de la restricció de la reducció de mostres

Fig. 2 Gràfics de violí que mostren el nombre de clons (riquesa) en els tres resultats clínics. una sèrie de clons a vegades 0, 6 i 24 de mostres d'ADNg. b Nombre de clons en el temps 6 per a l'isotip IgD de mostres d'ADNc. Els valors P s'obtenen a partir de l'ajust d'un model de regressió lineal considerant el nombre de clons com a variable dependent i el resultat clínic com a variable de factor independent (n=27 mostres). Els diagrames de violí representen la densitat de probabilitat de les dades a cada valor. El marcador de punts representa el valor mitjà amb l'interval interquartil. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font

Fig. 3 Dades longitudinals representades amb la línia ajustada per a cada resultat clínic. una Diversitat mesurada per l'entropia de Shannon representada a través de punts de temps pels tres resultats clínics (NP, PNR, PR) en gDNA. b Diversitat mesurada per entropia de Shannon representada a través de punts de temps pels tres resultats clínics (NP, PNR, PR) per isotips a l'ADNc. Els valors P corresponen al terme d'interacció definit per temps × resultat clínic ajustant un model d'efecte mixt lineal (n=27 mostres). Cada punt representa l'entropia per mostra al llarg del temps amb la seva línia ajustada i l'interval de confiança. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font

estratègies implicades, especialment en les dades d'ADNg on el nombre de seqüències és molt inferior al de les dades d'ADNc. A l'ADNg, vam restringir l'anàlisi a individus amb almenys 1000 clons per conservar prou seqüències. Es va fer un mostreig inferior a un mínim de 1062 clons en comparació amb els 62.173 clons de l'ADNc. Malgrat aquesta limitació, vam observar la tendència del temps 0, vam conservar la importància de l'anàlisi longitudinal en l'ADNg i vam replicar totes les associacions en l'ADNc. En ambdues anàlisis (reconservació i mostreig inferior), vam replicar els resultats, malgrat algunes limitacions destacades aquí, mostrant la validesa dels resultats reportats anteriorment.

Les xarxes de cèl·lules B mostren diferències en l'expansió clonal. El repertori de cèl·lules B es pot representar de manera natural com una xarxa basada en la diversitat de seqüències31. A les nostres dades, vam desenvolupar una xarxa visual per a cada mostra (figura 4 i figures suplementàries 5-7) on cada vèrtex representava un BCR únic i el nombre de BCR idèntics basats en les seves seqüències de nucleòtids definia la mida del vèrtex. Hi ha una vora entre vèrtexs quan pertanyen al mateix clon, de manera que els grups de cèl·lules B es poden mostrar com a grups de vèrtexs interconnectats que formen un clon. Per quantificar la xarxa, hem utilitzat l'índex de Gini, que és una mesura de desigualtat que es va aplicar a les distribucions de vèrtex i clúster. Quan s'aplica a la mida del vèrtex, Gini(V), es representa la naturalesa clonal global. Si Gini(V) és més proper a 1, els vèrtexs són desiguals mostrant l'expansió d'alguns d'ells, i més a prop de 0 en cas contrari. Quan s'aplica a la mida del clúster, Gini(C), es representa la dominància clonal. Si més a prop d'1, els clústers són desiguals i, per tant, representen clons dominants, si més a prop de 0, tots els clústers són de la mateixa mida.

A la figura 4 mostrem un exemple de les diferències visuals i quantitatives marcades entre els repertoris representatius de cèl·lules B de cadascun dels tres grups de resultats clínics, en els tres moments diferents (pre-trasplantament i post-trasplantament 6 i 24 mesos). . Al repertori de PR, hi ha una gran quantitat de seqüències de cèl·lules B que formen grups de clons més i més grans en comparació amb NP, mentre que el PNR es troba entremig. Al llarg del temps, el grup PR mostra una disminució del nombre de BCR i clons únics en comparació amb NP. Les xarxes detallades de cèl·lules B de cada individu de l'estudi es proporcionen a les figures suplementàries. 5–7. És interessant observar el patró molt divers de la xarxa de cèl·lules B en l'individu que va desenvolupar PTLD al grup NP (figura suplementària 5), ​​sense expansió de cèl·lules B abans del trasplantament, seguit d'un augment de cèl·lules B després dels 6 anys. mesos i una clara expansió clonal acompanyada d'una disminució de la diversitat als 24 mesos després del trasplantament.

En una avaluació posterior de la mesura de l'índex de Gini (Fig. 5), el grup PR va mostrar constantment mesures significativament més altes tant per al vèrtex com per al clúster respecte al grup NP, cosa que suggereix que els pacients del grup PR tenien una expansió clonal més gran a la línia de base,

Fig. 4 Xarxes de repertori de cèl·lules B de tres individus que representen els tres resultats clínics a través de punts de temps. Cada vèrtex representa un BCR únic, sent la mida del vèrtex definida pel nombre de BCR idèntics tenint en compte les seqüències de nucleòtids. Hi ha una vora entre vèrtexs quan pertanyen al mateix clon que s'ha definit abans, de manera que els clústers són grups de vèrtexs interconnectats que formen un clon. Cada mostra mostra l'índex de gini obtingut per a la mida del vèrtex (Gini(V)) i la mida del clúster (Gini(C)). BCR reflecteix el total de receptors de cèl·lules B per a aquesta mostra específica i els clons reflecteixen el nombre total de clons únics. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font

i una expansió posterior posterior al trasplantament d'un subconjunt de clons dominants (valor P [regressió lineal] <0.05, figura="" 5).="" el="" grup="" pnr="" es="" troba="" entre="" np="" i="" pr="" com="" es="" va="" mostrar="" anteriorment,="" tot="" i="" que="" aquest="" temps="" és="" significativament="" diferent="" respecte="" al="" grup="" np="" en="" el="" moment="" 24="" (valor="" p="" [regressió="" lineal]=""><0, 05).="" tot="" i="" que="" les="" dades="" de="" la="" figura="" 5="" es="" van="" generar="" a="" partir="" de="" les="" dades="" de="" l'adng,="" l'isotip="" igm="" per="" a="" l'adnc="" va="" mostrar="" les="" mateixes="" diferències="" (valor="" p="" [regressió="" lineal]="0.05)" (figura="" suplementària="">

Determinats clons i gens IGHV estan implicats en el rebuig.

Tot i que el nostre objectiu principal era caracteritzar el repertori de cèl·lules B per grups de resultats clínics, proporcionant una imatge global de la resposta immune abans i després del trasplantament, les nostres dades també ens van permetre realitzar anàlisis específiques de la seqüència d'Ig al clon i a l'IGHV. nivell genètic.

Per a l'anàlisi clonal, es va avaluar l'associació de la presència o absència de cada clon en particular (118.223 clons totals) amb el resultat clínic (PR, PNR, NR) en cada moment. Aplicant la prova exacta de Fisher, vam trobar 8, 4 i 21 clons nominalment associats amb resultats clínics a cadascun dels 0, 6 i 24 mesos, respectivament (taula suplementària 1). Tot i que cap va superar la correcció de múltiples proves, principalment a causa de la manca de potència, ja que tenim una mida limitada de mostra en anàlisi amb milers de paràmetres (clons), vam poder observar que els pocs clons que s'acostaven a la significació (valor P < {{="" 11}}.05)="" es="" van="" compartir="" entre="" pacients="" només="" del="" grup="" pr="" i="" es="" van="" enriquir="" als="" 24="" mesos="" després="" del="">

També vam considerar si alguns clons van persistir durant el temps de mostreig, més que altres, dins de cada resultat clínic (figura suplementària 9). Tenim en compte dues mesures diferents: (1) el nombre de clons persistents i (2) l'expansió clonal. Vam observar que els clons que eren persistents al PR estaven significativament més expandits (valor P [regressió lineal]=0.01, PR vs. NP) i van mostrar una tendència d'un nombre més elevat de clons persistents (P- valor [regressió lineal]=0.09). També vam examinar si aquests clons persistents també es van compartir entre diferents individus dins de cada resultat clínic. Dels 263 clons persistents detectats, 23 es van compartir entre individus. Cinc es van compartir dins del mateix PNR i sis dins del grup PR i no es va compartir cap clon entre el grup NP. En total, 12 clons compartits eren comuns entre ambdós grups de pacients amb lesió crònica progressiva de trasplantament i fibrosi al llarg del temps (PR i PNR). La llista de clons compartits entre individus es proporciona al material suplementari (taula suplementària 2).

A continuació, vam realitzar l'anàlisi del gen IGHV, mirant l'ús del gen IGHV per mostra, definit com el nombre de vegades que s'ha utilitzat cada gen IGHV, normalitzat pel nombre de clons (per evitar el biaix de mostreig de certs gens IGHV), filtrant els continguts poc expressats.

Fig. 5 Índex de Gini del vèrtex representat contra l'índex de Gini del clúster. El diagrama de dispersió representa cada mostra en els temps 0, 6 i 24. Els diagrames de caixa mostren les diferències de Gini(V) i Gini(C) en el temps 24. Els valors P s'obtenen a partir de l'ajust d'un model de regressió lineal considerant el Gini(V) i el Gini(C) com a variable dependent i el resultat clínic com a variable factor independent per a cada punt temporal (n=27 mostres). A la gràfica de caixa només es mostra el temps 24, però el temps 0 i el 6 també són significatius per a NP vs. PR: temps 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0,05; temps 6 P (Gini(V))=0,02, P (Gini(C))=0,01; temps 24: P (Gini(V))=0,003, P (Gini(C))=0,01. La banda dins del quadre representa el valor mitjà, el quadre defineix el rang interquartil (IQR) i els bigotis defineixen el primer i tercer quartil ± 1,5 × IQR. Les dades font es proporcionen com a fitxer de dades font

gens (ús del gen IGHV > {{0}}.05 en almenys l'10 per cent de les mostres) i aplicar un model de regressió lineal per trobar aquells gens que estaven associats amb cada resultat clínic, en cada moment. Dels 27 gens IGHV que van passar el filtre de baixa expressió, vam trobar gens significatius entre el grup PR i NP (valor P <0.05) amb="" tres="" gens="" en="" el="" temps="" 0,="" 7="" en="" el="" temps="" 6="" i="" 16="" en="" el="" temps="" 16.="" temps="" 24="" (fig.="" 6a–c).="" a="" partir="" d'aquests="" gens,="" 1="" (ighv3-11)="" en="" el="" temps="" 0,="" 5="" gens="" (ighv{3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" en="" els="" temps="" 6="" i="" 16="" gens="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv{4-61,="" ighv5-51)="" en="" el="" moment="" 24="" van="" superar="" la="" correcció="" de="" proves="" múltiples="" de="" la="" taxa="" de="" descoberta="" falsa="" (fdr).="" curiosament,="" vam="" trobar="" que="" ighv3-23="" era="" el="" gen="" més="" significatiu="" i="" abundant="" en="" els="" tres="" moments="" de="" la="" comparació="" np="" vs.="" pr="" (temps="" 0:="" valor="" p="0.04," temps="" 6:="" p-="" valor="0,003," temps="" 24:="" valor="" p="0,02)" (fig.="" 6d).="" a="" més,="" vam="" avaluar="" si="" les="" seqüències="" ighv3-23="" estaven="" sobrerepresentades="" entre="" les="" seqüències="" compartides="" de="" l'anàlisi="" clonal="" anterior.="" vam="" trobar,="" mitjançant="" una="" anàlisi="" d'enriquiment="" amb="" la="" prova="" exacta="" de="" fisher,="" que="" les="" seqüències="" ighv3-23="" estaven="" significativament="" sobrerepresentades="" en="" ambdues,="" els="" clons="" persistents="" compartits="" entre="" individus="" (taula="" suplementària="" 2)="" (valor="" p="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16).="" ),="" i="" els="" clons="" associats="" amb="" el="" resultat="" clínic="" en="" el="" moment="" 24="" (taula="" suplementària="" 1)="" (valor="" p=""><2,2 ×="" 10−16).="" vam="" observar="" que="" l'individu="" 9="" del="" grup="" nr,="" que="" s'havia="" trobat="" que="" compartia="" alguns="" clons="" persistents="" amb="" els="" progressors="" en="" les="" anàlisis="" anteriors,="" es="" va="" classificar="" amb="" el="" grup="" pr="" en="" tots="" els="" moments.="" no="" hi="" va="" haver="" cap="" efecte="" de="" confusió="" sobre="" les="" dades="" de="" diverses="" variables="" demogràfiques="" i="" clíniques,="" com="" ara="" l'edat="" del="" receptor,="" el="" gènere,="" la="" raça,="" la="" font="" del="" donant,="" el="" tipus="" d'immunosupressió,="" el="" desajust="" hla="" i="" la="" causa="" de="" la="" insuficiència="" renal.="" a="" més,="" també="" es="" va="" trobar="" que="" aquest="" gen="" era="" significatiu="" tant="" en="" els="" isotips="" igm="" (valor="" p="" [regressió="" lineal]="0.008)" com="" igd="" (valor="" p="" [regressió="" lineal]="0.05)" basat="" en="" l'adnc="" als="" 24="" mesos="" posteriors="" al="" trasplantament,="" d'acord="" amb="" els="" resultats="" anteriors="" que="" mostren="" coherència="" amb="" aquests="" dos="" isotips="" més="" enriquits="" en="" el="" grup="" pr.="" només="" es="" van="" trobar="" altres="" tres="" gens="" significatius="" en="" l'anàlisi="" de="" l'adnc,="" i="" tots="" es="" van="" trobar="" als="" 24="" mesos="" després="" del="" trasplantament="" en="" els="" isotips="" igd="" i="" igm="" (ighv3-15="" i="" ighv4-="" 61="" en="" igd="" i="" ighv4-39="" en="">

Discussió

La diversitat és una característica essencial del sistema immunitari i, en humans sans, és fonamental contra els patògens per fer front a les malalties. En el trasplantament d'òrgans, la manipulació terapèutica deliberada s'institueix clínicament per permetre que l'òrgan estranger sigui activament ignorat o acceptat pel sistema immunitari del propi pacient per no generar una resposta aloimmune, donant lloc al rebuig. Les cèl·lules B són un component important d'aquest procés i el nostre grup i altres han demostrat que són fonamentals tant en la presentació d'antigen32,33 com en la producció d'alloanticossos34,35. En aquest treball, hem utilitzat la seqüenciació de cèl·lules B d'alt rendiment per entendre millor la diversitat i la clonalitat de les cèl·lules B a laronyócirculació del receptor del trasplantament, tant abans de l'empelt com després de 24 mesos de seguiment, amb una valoració longitudinal del repertori immunitari de les cèl·lules B. En general, la nostra anàlisi mostra una major diversitat de cèl·lules B abans de l'empelt, diferències longitudinalment amb una disminució de la diversitat acompanyada d'expansió clonal i un augment de cert ús del gen IGHV entre els que rebutgen els empelts.

Una necessitat clínica clau no satisfeta d'un trasplantament d'òrgans és la manca de predicció no invasiva, sensible i precisa de la lesió del trasplantament i els mals resultats. Aquesta tasca es veu complicada pel fet que hi ha diversos factors que influeixen en la supervivència de l'empelt36. En aquest estudi, vam trobar que els individus estables tenien una diversitat reduïda del repertori immunitari de les cèl·lules B abans del trasplantament en comparació amb els que van rebutjar l'òrgan. El següent pas hauria de ser demostrar el valor predictiu de la diversitat del repertori de cèl·lules B, proporcionant millors biomarcadors potencials per a la predicció del rebuig abans de l'empelt i la possibilitat d'implementar-se en les opcions d'atenció clínica i immunosupressió abans i després.ronyótrasplantament. Si aquesta característica és el resultat de qualsevol factor que contribueixi a la disminució de la diversitat en individus estables, com ara factors ambientals o genètics, no només podríem predir el rebuig sinó també prevenir-lo. De fet, troballes molt recents van mostrar que la variació en el sistema immunitari està impulsada per factors ambientals i genètics37,38. En el nostre estudi, no hem pogut trobar cap associació amb cap característiques demogràfiques i altres característiques clíniques del pacient (edat, gènere, raça, immunosupressió, font d'òrgans, desajustos HLA i ESRD). En aquest sentit, necessitem una nova anàlisi per corroborar si factors específics afecten la diversitat del repertori de cèl·lules B i els resultats dels trasplantaments.

Una altra troballa interessant del nostre estudi mostra que el repertori immunitari es comporta de manera diferent al llarg del temps depenent del grup de resultats clínics. Per a aquells que mostren rebuig de l'òrgan després del trasplantament, la diversitat de cèl·lules B és inicialment més gran i després disminueix amb el temps, mentre que la tendència de diversitat inversa s'observa en pacients que no desenvolupen rebuig o lesió crònica de l'empelt. Tot i que tots els individus van rebre la mateixa càrrega d'immunosupressió després del trasplantament, algunes possibles explicacions per a la disminució de la diversitat en els pacients que desenvolupen rebuig poden estar relacionades amb el fet que aquests pacients reben una càrrega d'immunosupressió temporalment molt augmentada per al tractament del rebuig i després es mantenen a la línia de base més alta. Tot i que això podria explicar la reducció de la diversitat de cèl·lules B al llarg del temps i explicar la diferència als 24 mesos després del trasplantament, és poc probable que aquesta sigui la causa, ja que la diversitat reduïda en el grup PR és

Fig. 6 Mapa de calor i diagrama de caixa per a l'anàlisi de l'ús dels gens IGHV. Mapa de calor que mostra els gens IGHV seleccionats com a significatius nominalment (valor P <{2}}.05) en="" el="" temps="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" i="" 24="" (c)="" per="" a="" np="" vs="" pr.="" l'escala="" de="" color="" vermell="" representa="" l'expressió="" de="" cada="" gen="" a="" través="" de="" les="" mostres.="" les="" bandes="" de="" la="" part="" superior="" mostren="" el="" resultat="" clínic="" i="" la="" causa="" de="" l'esrd.="" gràfic="" de="" caixa="" que="" mostra="" l'expressió="" ighv3-23="" a="" través="" de="" punts="" de="" temps="" per="" a="" np="" vs.="" pr="" (temps="" 0:="" valor="" p="0,04," temps="" 6:="" valor="" p="0,003," temps="" 24:="" p="" -valor="0.02)" (d).="" la="" banda="" dins="" del="" quadre="" representa="" el="" valor="" mitjà,="" el="" quadre="" defineix="" el="" rang="" interquartil="" (iqr)="" i="" els="" bigotis="" defineixen="" el="" primer="" i="" tercer="" quartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" els="" valors="" p="" s'obtenen="" a="" partir="" de="" l'ajust="" d'un="" model="" de="" regressió="" lineal="" considerant="" els="" gens="" v="" com="" a="" variable="" dependent="" i="" el="" resultat="" clínic="" com="" a="" variable="" independent.="" (n="12" mostres).="" les="" dades="" font="" es="" proporcionen="" com="" a="" fitxer="" de="" dades="">

també es va observar als 6 mesos després del trasplantament, en un moment en què els pacients encara no han desenvolupat rebuig, cosa que suggereix que és probable que hi hagi altres processos actius. L'observació de l'expansió clonal selectiva amb clons més dominants només en pacients que desenvolupen tant rebuig com/o crònic progressiu.ronyóla lesió per trasplantament, suggereix una selecció, persistència i expansió de determinats clons amb el pas del temps, impulsada per aloantigen, que explica la reducció global de la diversitat temporal. Tot i que podem plantejar la hipòtesi que l'expansió d'aquests clons probablement està relacionada amb una lesió aloimmune a l'empelt, l'evidència directa que l'expansió d'aquests clons és aloimmune requereix estudis addicionals in vitro i en animals.

El rebuig agut continua sent el factor negatiu més fort per a la supervivència a llarg termini de l'empelt malgrat les ràpides millores en les teràpies d'immunosupressió39,40. Aquest estudi també troba una associació de l'ús d'alguns gens IGHV amb el rebuig, tot i que el vincle causal s'hauria d'explorar en estudis futurs. L'IGHV3-23 és el gen més interessant en l'anàlisi de l'ADNg, ja que s'utilitza significativament més en pacients que desenvolupen rebuig en tots els punts de temps mesurats i està sobrerepresentat en els clons persistents compartits entre individus i els clons enriquits entre els individus. pacients rebutjats als 24 mesos després del trasplantament. Aquest gen també es valida als 24 mesos després del trasplantament tant en els isotips IgD com en IgM en l'anàlisi de l'ADNc. IGHV3-23 s'ha associat àmpliament amb un mal pronòstic en la leucèmia limfocítica crònica41 i s'ha demostrat que la gran majoria de seqüències de IGHV3-23 conservaven la capacitat de mediar les interaccions de superantigen42. Els superantígens de cèl·lules B són produïts per virus i bacteris, coneguts per unir-se a immunoglobulines fora dels llocs d'unió d'antigens convencionals43. S'ha demostrat que les trobades de cèl·lules B amb un superantígen indueixen la proliferació, l'activació, la migració i la supressió44. En el trasplantatronyó, hi ha la possibilitat d'una exposició contínua al virus i als antígens bacterians, ja sigui relacionat amb una etiologia del reflux vesicoureter primari com a causa de l'ESRD o el reflux urinari secundari després de la reimplantació de l'urètre trasplantat, o el reflux després d'una infecció del tracte urinari, el risc de que augmenta amb l'exposició a la immunosupressió crònica després del trasplantament. Hem ajustat els resultats de les anàlisis per la causa de la insuficiència renal, entre altres factors clínics i demogràfics; els resultats comentats anteriorment segueixen sent significatius tot i que ens vam adonar que el pacient malclassificat de NP a l'anàlisi (Fig. 6) tenia una malaltia de reflux. Cheng et al. També han trobat anteriorment que els clons del teixit de biòpsia de receptors de trasplantament de ronyó infiltrats per cèl·lules B tenien un predomini del gen IGHV3-23 entre d'altres45. Grover et al.46 van demostrar que els anticossos d'aquest gen en particular no reconeixien els antígens HLA del donant sinó que eren específics per a E. coli i Modena et al.47 van demostrar que la càrrega del nombre de bacteris a l'orina era molt més gran en pacients amb fibrosi intersticial i atròfia tubular que aquells amb empelts que funcionaven bé. Ampliem aquestes troballes demostrant que l'ús del gen IGHV3-23 és significativament més gran en pacients de rebuig múltiples de sang perifèrica i pot implicar antígens comuns particulars en la conducció del rebuig. En el futur, l'expressió de IGHV3-23 es podria utilitzar per controlar la resposta immune cap al trasplantat.ronyó.

Ampliant el nostre estudi mitjançant la seqüenciació d'ADNc, podríem replicar la majoria dels nostres resultats en dos dels isotips (IgM i IgD), mostrant una menor diversitat pre-trasplantament a la NP, sent els dos més significatius en l'anàlisi longitudinal amb més expansió i dominant. clons a l'anàlisi de la xarxa i també replicant el gen IGHV3-23. Els primers anticossos que es produeixen en una resposta immune humoral són sempre IgM i progressen ràpidament cap a la producció de tots els diferents isotips, IgD, IgA, IgG i IgE, però un interès especial requereix l'isotip IgD48. La IgD s'expressa conjuntament amb la IgM i la IgD secretada existeix i té una funció a la sang, les secrecions mucoses i a la superfície de les cèl·lules efectores immunitàries innates com els basòfils49. Els basòfils són glòbuls blancs que lluiten contra virus, bacteris, paràsits i fongs, i estan implicats en les malalties renals i el rebuig del trasplantament50. Així, una altra evidència que relaciona les respostes de les cèl·lules B amb el procés de rebuig amb virus i bacteris.

Es necessiten estudis futurs per demostrar que aquesta activació es deu a diferències en el microbioma receptor amb implicacions en el diagnòstic i la terapèutica.

Aquest estudi ens va permetre identificar la rellevància d'alguns d'aquests clons BCR, identificar els clons BCR de rellevància clínica amb rebuig d'al·loempelt i demostrar que hi ha una probable rellevància d'aquests clons amb immunitat heteròloga, donat l'enriquiment d'aquests clons en pacients amb vies urinaries colonitzades abans del trasplantament i la seva rellevància biològica per a les respostes dels patògens. Una millor comprensió del comportament del repertori immunitari enronyóels trasplantaments no haurien estat possibles sense l'aplicació de BCRSeq en combinació amb una implementació robusta de canonades computacionals i estadístiques. No obstant això, hi ha diverses limitacions del nostre enfocament que cal reconèixer: en primer lloc, la nostra mida de la mostra és altament seleccionada i relativament petita en un conjunt de pacients pediàtrics i, tot i que hem assolit significació estadística en la nostra anàlisi i validada en dues fonts de dades diferents, caldrà més anàlisis per corroborar els nostres resultats. En segon lloc, els nostres resultats no estan exempts de la influència que el mostreig biològic i tècnic pot tenir en la nostra anàlisi. Les mesures de diversitat depenen de diverses qüestions: el fet que només una fracció de milers de milions de cèl·lules d'un repertori estigui representada en una mostra, diferències en la profunditat de seqüenciació i possibles errors experimentals. Hem controlat àmpliament tots aquests problemes, primer al laboratori, executant la mateixa quantitat de sang per a cada mostra en el mateix lot i segon, computacionalment i estadísticament, aplicant l'eina de reconegut per estimar el repertori global i realitzant un mostreig inferior per controlar la profunditat de seqüenciació. i errors experimentals. En tercer lloc, hem realitzat BCRSeq utilitzant dues fonts diferents, gDNA i cDNA. La seqüenciació de l'ADNg facilita l'estimació de la clonalitat d'una seqüència d'Ig donada, ja que el nombre de lectures de la seqüència serà proporcional al nombre de molècules d'ADNg. La seqüenciació de l'ADNc proporciona una estimació del nivell d'expressió relatiu de diverses seqüències d'Ig del repertori. S'ha demostrat que per als receptors de cèl·lules T, la caracterització del clonotip realitzada a l'ADNc no és tan bona com a l'ADNg, demostrant que la proporció relativa de clons individuals difereix molt15 o que el seguiment de clons específics del VIH només té èxit amb l'ADNg, però no mRNA51. En quart lloc, la influència de la immunosupressió pot ser un factor de confusió en aquest tipus d'anàlisi. En aquest estudi, totes les mostres provenen d'un assaig clínic on tots els pacients van rebre la mateixa càrrega d'immunosupressió després del trasplantament. No obstant això, vam controlar els dos tipus d'esteroides basats en esteroides i sense esteroides per assegurar-nos que això no era un problema, sense observar diferències en els resultats. Finalment, la cohort que presentem aquí és la dels trasplantaments pediàtrics. La majoria dels aspectes clínics trasplantats són similars en nens i adults. La immunosupressió i els règims utilitzats són similars, la creatinina és el principal biomarcador sèric, el rebuig agut es determina principalment mitjançant la biòpsia amb l'ús dels criteris de Banff i els mecanismes de rebuig delronyól'empelt són generalment similars52, per tant, la majoria de la investigació feta en adults o nens pot aplicar-se a tots dos. No obstant això, altres aspectes com l'incompliment/no adherència a la immunosupressió, aspectes immunològics, les malalties renals primàries, que condueixen a insuficiència renal, sovint associades a problemes urològics, i les immunitzacions que es requereixen abans del trasplantament poden diferir, per tant, anàlisis posteriors en caldrà una població adulta per generalitzar aquestes troballes.

Malgrat aquestes limitacions, les nostres dades revelen que s'observa una major diversitat abans del trasplantament en individus que rebutgen l'òrgan, cosa que suggereix una predisposició al rebuig, que pot tenir implicacions futures per predir el risc de rebuig abans de l'empelt, les opcions d'immunosupressió i l'atenció clínica. pràctiques. Després de 24 mesos de seguiment, s'observa una reducció global de la diversitat al llarg del temps acompanyada de la persistència i expansió de certs clons i un ús més elevat de diversos gens IGHV en el grup de rebuig, que pot implicar antígens comuns particulars en la conducció del rebuig. S'observa un interès especial per l'augment de l'ús del gen IGHV3-23 entre els pacients amb rebuig, ja que anteriorment s'ha associat ambronyótrasplantament i podria ser un component clau per impulsar el procés de rebuig. Aquest treball presenta una anàlisi longitudinal del repertori immune de cèl·lules B en trasplantaments d'òrgans que promou més estudis per confirmar aquestes troballes, ja que poden tenir implicacions clíniques en la predicció, el control, el seguiment i el tractament.ronyórebuig.

Mètodes

Estudiar disseny. Hem estudiat 81 mostres per a l'ADNg i 56 mostres coincidents per a l'ADNc de forma longitudinal a vegades 0, 6 i 24 mesos d'un nombre total de 27 receptors pediàtrics que van rebre un tractament primari.ronyótrasplantament. Els subjectes d'aquest estudi provenen d'un assaig clínic (estudi multicèntric SNSO1) on els subjectes van ser aleatoritzats (1:1) a un règim tradicional d'immunosupressió basat en dosis baixes d'esteroides (esteroides, inducció estàndard de daclizumab fins al segon mes posterior al trasplantament, i immunosupressió de manteniment amb tacrolimus (Prograf, Astellas Pharma) i MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) o un règim d'immunosupressió sense esteroides (inducció prolongada de daclizumab fins al sisè mes posterior al trasplantament, tacrolimus i MMF). En aquest estudi, 14 pacients van rebre un règim d'evitació d'esteroides, mentre que 13 van rebre un règim immunosupressor basat en esteroides53 i cap d'aquests pacients va rebre immunosupressió abans del trasplantament, ja que aquest era un dels criteris d'exclusió. consistia en tres polsos de corticosteroide intravenós (10 mg/kg) i intensificació de la immunosupressió inicial.

Totes les mostres utilitzades en l'estudi tenien una biòpsia d'al·loempelt en sèrie associada, que va ser llegida per un patòleg central, mitjançant puntuacions histològiques semicuantitatives. El rebuig agut clínic es va definir com un episodi de rebuig agut, associat a una disfunció de l'empelt, basat en un augment superior al 10% de la creatinina sèrica respecte dels valors inicials, i es va confirmar mitjançant una lectura patològica central de les biòpsies segons la classificació actualitzada de Banff23,24. La lesió crònica de l'al·lograft es va definir mitjançant la puntuació de l'índex de dany d'al·lograft crònic (CADI). Els pacients es van classificar en tres resultats clínics definits per la puntuació CADI i els episodis de rebuig. Els no progressistes (NP) tenien una puntuació CADI no incremental baixa en tres biòpsies en sèrie durant 2 anys, sense rebuig agut, els progressistes sense rebuig (PNR) tenien un CADI més alt. puntuació a les seves biòpsies en sèrie durant 2 anys i incremental en els punts de temps sense rebuig i els progressistes amb rebuig (PR) van tenir puntuacions CADI elevades incrementals a les seves biòpsies en sèrie durant 2 anys amb episodis de rebuig. Aquests pacients van ser seleccionats amb molta cura d'una cohort més gran de 120 pacients, coincidint per a variables demogràfiques i per a tots els NP i PNR per no tenir evidència d'inflamació a la biòpsia o lesió subclínica mesurada per anticossos específics del donant absents. Cap tenia HLA o empelt haploidèntic, ja que aquest era un criteri d'exclusió per a la inscripció54. Totes les mostres es van recollir de 12 programes de trasplantament pediàtric diferents dels EUA entre 2004 i 2006, segons protocols aprovats per l'IRB. L'estudi també va ser aprovat pel Human Research Protection Program (HRPP) de la Universitat de Califòrnia, San Francisco i la Universitat de Stanford per permetre una anàlisi de mostres de biobanc. Tots els pacients/tutors van donar el seu consentiment informat per participar en la investigació, en total adhesió a la Declaració d'Hèlsinki. Les activitats clíniques i d'investigació que s'estan informant són coherents amb els Principis de la Declaració d'Istanbul tal com es descriu a la Declaració d'Istanbul sobre el tràfic d'òrgans i el turisme de trasplantaments.

Aïllament de gDNA i ARN. Es van recollir mostres de sang (4, 5 ml) en un tub superior vermell de 5 ml i es van incubar a temperatura ambient durant 30 minuts fins que es va formar el coàgul. A continuació, es va centrifugar la mostra a 2000 × g durant 5 min mitjançant un rotor de galleda oscil·lant. La capa superior de sèrum es va transferir a un altre criotub i el coàgul es va emmagatzemar al mateix tub a -80 graus fins al seu ús. L'ADN genòmic de coàguls de sang sencera es va extreure mitjançant Clotspin Baskets i el Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, València, CA).

Per a l'extracció d'ARN deronyóbiòpsia amb agulla (Qiagen, València, CA) i emmagatzemada a -80 graus; L'ARN total es va extreure mitjançant una barreja mestra de 790 µl de TRIzol i 10 µl de glicogen. Les mostres de teixit es van homogeneïtzar, es van incubar entre 15 i 25 graus durant 5 minuts i es van afegir 160 µl de cloroform per a la separació de fases. La barreja es va incubar de nou a 25 graus durant 2 minuts seguit de centrifugació a 4 graus i es va utilitzar per a l'extracció d'ARN mitjançant el kit RNeasy Micro (Catàleg Qiagen núm. 4004). La quantitat i la integritat de l'ARN es van determinar amb l'espectrofotòmetre UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 i el bioanalitzador Agilent, respectivament.

Seqüenciació de cèl·lules B. Es van preparar reaccions de PCR amb plantilla d'ADN genòmic

a partir d'100 ng alíquotes d'ADNg per generar sis biblioteques de codi de barres independents per mostra. Es van utilitzar cebadors multiplexats a les regions marc IgH J o FR1 o FR2 segons el disseny BIOMED-255. Es van utilitzar "seqüències de codi de barres" de deu nucleòtids als cebadors per indicar la identitat de la mostra i replicar la identitat de la biblioteca per a cada reacció de PCR. La PCR es va realitzar amb polimerasa AmpliTaq Gold (Roche) amb el programa següent: 94 graus durant 5 min; 35 cicles de (94 graus durant 30 s, 60 graus durant 45 s, 72 graus durant 90 s); i extensió final a 72 graus durant 10 min. Es va dur a terme una segona reacció de PCR per garantir que les biblioteques no s'amplifiquessin fins a la saturació abans de la purificació i seqüenciació del gel. En total, 0,4 ul de cada primer producte de PCR van modelar la segona reacció de PCR utilitzant cebadors externs específics per a les 454 seqüències d'enllaç; l'amplificació es va dur a terme amb el programa: 94 graus durant 15 min, 12 cicles de (94 graus durant 30 s, 60 graus durant 45 s, 72 graus durant 90 s) i extensió final a 72 graus durant 10 min. La taxa d'error de l'AmpliTaq Gold hauria de tenir un efecte mínim sobre la identificació de seqüències relacionades clonalment o l'estimació de les taxes de mutació somàtica en seqüències, tal com s'ha comentat en un altre lloc56. L'ADNc es va sintetitzar a partir d'un total de 300 ng d'ARN amb cebament per hexàmers aleatoris. Les plantilles es van amplificar mitjançant PCR utilitzant cebadors Biomed IGHV al marc 1 (FR1) i cebadors específics d'isotip situats al primer exó de les regions constants. Aquests primers18,57 també codificaven aproximadament la meitat de les seqüències d'enllaços Illumina necessàries per a la generació i seqüenciació de clúster a l'instrument MiSeq. La identitat de la mostra es va codificar mitjançant codis de barres identificadors multiplex de vuit nucleòtids a cada imprimació. Per al reconeixement del clúster Illumina, es van codificar quatre nucleòtids aleatoris als cebadors immediatament després de la seqüència d'enllaç d'Illumina als cebadors de la regió constant. Cada isotip d'anticossos per a cada mostra es va amplificar en una reacció de PCR separada, per evitar la formació de productes de PCR quimèrics d'isotip creuat. La PCR es va dur a terme amb AmpliTaq Gold (Roche) seguint les instruccions del fabricant i va utilitzar un programa de 94 graus durant 7 min, 35 cicles de (94 graus durant 30 s, 58 graus durant 45 s, 72 graus durant 120 s) i final. extensió a 72 graus durant 10 min. Es va utilitzar un segon pas de PCR per afegir la part restant dels enllaços Illumina als amplicons i es va realitzar amb el kit Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) segons les instruccions del fabricant, utilitzant 0,4 microlitres del primer producte de PCR com a plantilla en un Reacció de 30 microlitres. El programa de PCR per al segon pas de PCR va ser de 94 graus durant 15 min, 12 cicles de (94 graus durant 30 s, 60 graus durant 45 s, 72 graus durant 90 s) i l'extensió final a 72 graus durant 10 min. Els productes de cada reacció de PCR es van agrupar en quantitats equimolars estimades, es van electroforitzar en gels d'agarosa i es van extreure gel amb kits QIAquick (Qiagen). La seqüenciació d'alt rendiment de biblioteques amb plantilles d'ADN genòmic es va realitzar a la plataforma 454 (Roche) mitjançant la química del titani. La seqüenciació de la biblioteca d'ADNc es va realitzar en un instrument Illumina MiSeq mitjançant 600-kits de seqüenciació de cicle. A les dades suplementàries 1 s'inclou una llista completa dels primers utilitzats amb MiSeq (M154 i M155) i 454 Titanium (T7).

Les lectures de seqüenciació es van processar de la següent manera: les lectures d'extrem aparellat es van fusionar mitjançant FLASH58 on després es van desmultiplexar les seqüències i es van retallar els codis de barres i les seqüències d'imprimació IGHV. Les regions V, D i J i les unions V–D (N1), D–J (N2) es van identificar mitjançant el programa d'alineació IgBLAST59. Les seqüències es van filtrar per eliminar artefactes no IGH, seqüències amb inserció o supressió del gen V, seqüències quimèriques i seqüències no funcionals. A nivell de mostra, vam excloure aquells amb<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Anàlisi de la diversitat. La diversitat es mesura per la riquesa d'espècies tenint en compte el nombre de clons per mostra. Aquesta mesura no té en compte la freqüència de cada espècie, de manera que també hem utilitzat l'entropia de Shannon (H) per mesurar la diversitat que ofereix

informació sobre la distribució de mida de les espècies a la població. H es defineix com:

on N és el nombre de clons únics i pi és la freqüència del clon i. H oscil·la entre 0 (mostra amb només un clon) a Hmax ¼ log2N (mostra amb una distribució uniforme de clons).

A continuació, vam utilitzar un model lineal general per trobar l'associació entre riquesa i entropia amb el resultat clínic en els diferents moments. Hem ajustat aquest model per totes les variables clíniques disponibles que es mostren a la taula 1 per assegurar-nos que qualsevol de les característiques del pacient era un factor de confusió.

Per modelar el component longitudinal de les dades, hem aplicat un model d'efectes mixtes lineals tenint en compte un model de creixement condicional tal com es mostra a la figura 10 suplementària. Per aplicar aquest model, hem utilitzat el paquet lme4 a R tenint en compte la interacció entre el resultat clínic i el temps per trobar associació amb la riquesa i la diversitat amb el temps sent un efecte aleatori.

Per fer front al fet que les mesures de diversitat es poden veure afectades pel problema de les espècies desaparegudes (només es representen una fracció de milers de milions de cèl·lules en un repertori) i els errors de seqüenciació i experimentals, vam realitzar dues estratègies a més de l'anàlisi de dades completa. En primer lloc, hem utilitzat l'eina Recon (reconstrucció de clons estimats a partir de nombres observats)29 per tractar el problema de les espècies desaparegudes. Recon és un mètode de màxima verosimilitud modificat que genera la diversitat global d'un repertori a partir de mesures en una mostra. Recon produeix estimacions precises i robustes d'un conjunt de mesures de diversitat, incloses la riquesa i l'entropia, que permeten comparacions sòlides de la diversitat entre individus. En segon lloc, vam realitzar una estratègia de mostreig inferior prenent un subconjunt aleatori de lectures per a cada mostra igual a la mida de seqüenciació més petita, seguit del recàlcul dels clons de cèl·lules B per ajustar-los per la profunditat de seqüenciació i fer front a possibles errors experimentals. Per a l'ADNg, hi ha mostres amb lectures molt baixes (< 1000),="" i="" per="" evitar="" perdre="" moltes="" seqüències="" i="" la="" realitat="" de="" les="" dades,="" vam="" excloure="" un="" total="" de="" nou="" mostres="" que=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Anàlisi de la xarxa. L'algoritme de generació de xarxa és molt semblant al definit abans31. Breument, cada vèrtex representa una seqüència de cèl·lules B on la mida està definida per totes les seqüències idèntiques. Les vores es calculen mitjançant la definició del clon (els mateixos segments V i J, la mateixa longitud de CDR3 i el 90 per cent d'identitat de nucleòtids entre els CDR3) i els clústers representen cada clon del repertori. L'anàlisi es va fer utilitzant el paquet de gràfics a R mitjançant l'opció layout_amb_graphopt per generar la trama.

Per quantificar la xarxa, hem calculat l'índex de Gini per a la mida del vèrtex i la mida del clúster. L'índex de Gini és una mesura de desigualtat que s'utilitza àmpliament per mesurar la distribució de la riquesa. Mesura la desigualtat entre els valors de la distribució de freqüències. Hem utilitzat la funció de Gini d'un paquet a R per calcular el coeficient de Gini per a la mida del vèrtex i la distribució de la mida del clúster. Un coeficient de Gini de zero expressa la igualtat perfecta i un coeficient de Gini d'1 expressa la desigualtat màxima.

Anàlisi clonal. Per estudiar els clons específics associats amb els resultats clínics, vam construir una matriu amb tots els clons que estan presents en més d'una mostra (nombre total=118, 223) per totes les mostres en cada moment. A continuació, vam estudiar l'associació amb el resultat clínic de cada clon en particular definint una variable per clon com a present/no present. Finalment, vam aplicar la prova exacta de Fisher per tenir en compte la significació de les taules 2 × 3 per a cada clon en cada punt temporal. També vam estudiar els clons de persistència definits per aquells clons que es troben en més d'un punt temporal en cada individu. Aleshores, per tenir en compte les diferències pel resultat clínic, vam aplicar un model lineal que definia com a variable dependent el nombre de clons (per mesurar les diferències de persistència) i el nombre de recomptes de cada clon (per mesurar l'expansió clonal) i el resultat clínic com a un predictor independent.

Anàlisi de l'ús del gen IGHV. Per estudiar els gens IGHV, es va avaluar l'ús del gen IGHV per mostra ja que el nombre de vegades que s'utilitza cada gen normalitzat pel nombre de clons per evitar la sobrerepresentació de determinats gens IGHV. Per a l'anàlisi estadística, vam filtrar aquells gens amb una expressió molt baixa (ús d'IGHV/clons <{{0}},05) en="" almenys="" el="" 10="" per="" cent="" de="" les="" mostres.="" en="" total,="" vam="" analitzar="" 27="" gens="" ighv="" corresponents="" a="" 63="" mostres.="" a="" continuació,="" vam="" aplicar="" un="" model="" lineal="" per="" trobar="" aquells="" gens="" que="" estaven="" associats="" amb="" el="" resultat="" clínic="" en="" cada="" moment="" i="" vam="" corregir="" aquests="" resultats="" mitjançant="" proves="" múltiples="" utilitzant="" benjamini="" i="" hochberg="" fdr=""><0, 05.="" hem="" ajustat="" aquest="" model="" per="" totes="" les="" variables="" clíniques="" disponibles="" que="" es="" mostren="" a="" la="" taula="" 1="" per="" assegurar-nos="" que="" qualsevol="" de="" les="" característiques="" del="" pacient="" era="" un="" factor="" de="">

Resum de l'informe. Hi ha més informació sobre el disseny de la investigació disponible al Resum d'informes de recerca sobre la natura enllaçat amb aquest article.

Referències

1.Cai, J. & Terasaki, PI Monitorització d'anticossos post-trasplantament i HLA 1. (identificació d'epítops d'anticossos. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al.Anticossos no HLA contra epítops immunogènics prediuen l'evolució de la lesió crònica de l'al·loempelt renal.J. Am. Soc. Nephrol.23,750-763 (2012).

3. Li, L. et al. Localització compartimental i rellevància clínica dels anticossos MICA després del trasplantament renal. Transplantation 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U.Long-term renal allograft supervivència als Estats Units: una reavaluació crítica. Am.J. Trasplantament. 11, 450-462(2011).

5. El Registre científic de receptors de trasplantaments.Disponible a: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Consulta: 24 de maig de 2018)Pineda, S. et al. Noves variants no coincidents d'antigen no histocompatibilitat

6. Millorar la capacitat de predir el risc de rebuig mediat per anticossos en els trasplantaments de ronyó. Davant. Immunol. 8.1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM & Fairchild, RLProgrés recents i noves perspectives en l'estudi de les respostes de cèl·lules T als al·lografts. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM El yin i el yang de les cèl·lules B en el rebuig i la tolerància de l'empelt. Trasplantament. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. La promesa i el repte de la seqüenciació d'alt rendiment del repertori d'anticossos plus. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Similitud i divergència en el desenvolupament i expressió dels repertoris d'anticossos humans i de ratolí. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Guies pràctiques per a l'anàlisi de la seqüenciació del repertori de receptors de cèl·lules B. Genoma Med.7,121(2015).

12. Shugay, M. et al. VDJtools: Postanàlisi unificant dels repertoris de receptors de cèl·lules T. Informàtica PLOS. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Caracterització quantitativa del repertori de cèl·lules T i biomarcadors en el rebuig del trasplantament renal. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. et al. Seguiment de cèl·lules T reactives del donant: evidència de la supressió clonal en pacients amb trasplantament de ronyó tolerants. Ciència. Trad. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M.et al. L'anàlisi del repertori de TCR mitjançant la seqüenciació de nova generació permet un diagnòstic diferencial complex de la patologia relacionada amb les cèl·lules T. Am. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A.et al. Les cèl·lules B canviades de classe d'immunoglobulines formen un eix immunitari actiu entre el SNC i la perifèria en l'esclerosi múltiple. Ciència. Trad. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB i Hernández, RD Inferència estadística d'una resposta de repertori d'anticossos convergents a la vacuna contra la grip. Genoma Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM et al. Les seqüències d'IgH en la deficiència immune variable comuna revelen un desenvolupament i selecció de cèl·lules B alterats. Ciència. Trad. Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M. & Abramowicz,D.Tolerància operativa en el trasplantament renal i biomarcadors associats. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al.B repertoris de cèl·lules en candidats a trasplantament de ronyó sensibilitzats amb HLA sotmesos a teràpia de desensibilització.J. Trad. Med.15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. et al. Expansió i hipermutació somàtica de clons de cèl·lules B en empelts de ronyó humà rebutjats. Trasplantament 98,766-772(2014).

22. Vollmers, C. et al. Monitorització de la immunosupressió induïda farmacològicament mitjançant la seqüenciació del repertori immune per detectar el rebuig agut d'al·loempelt en pacients amb trasplantament cardíac: un estudi de precisió diagnòstica de prova de concepte.PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Informe de la reunió de Banff'05: diagnòstic diferencial de lesió crònica d'al·loempelt i eliminació de la nefropatia crònica d'al·lograft (CAN). Am. J. Transplant.7,518-526(2007). immunosupressió en el trasplantament de ronyó: és hora de considerar-lo com a teràpia estàndard? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. et al. Resultats de tres anys en pacients amb trasplantament de ronyó aleatoritzats a immunosupressió sense esteroides o retirada d'esteroides, amb micofenolat de sodi i ciclosporina amb recobriment entèric: l'estudi infinit. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Estimacions sòlides de la diversitat global del repertori immune a partir de mesures d'alt rendiment en mostres. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNHet al. Les cèl·lules B que poblen el cervell de l'esclerosi múltiple maduren als ganglis limfàtics cervicals que drenen. Ciència. Trad. Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Les propietats de xarxa derivades de la seqüenciació profunda dels repertoris de receptors de cèl·lules B humans delimiten les poblacions de cèl·lules B. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Heterogeneïtat molecular en el rebuig agut d'al·loempelt renal

identificades mitjançant el perfil de microarrays d'ADN. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPhenotypic Avaluació de subconjunts de cèl·lules b després de rituximab per al tractament del rebuig agut d'al·loempelt renal en receptors pediàtrics. Trasplantament 91,1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Cèl·lules i anticossos en trasplantament.Amm. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. Trasplantament de pulmó cardíac.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ & Kuypers, DR Diagnòstic i prevenció de la pèrdua crònica d'al·loempelt renal. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. La variació natural en els paràmetres de la cèl·lula immune innata està impulsada preferentment per factors genètics. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Els orígens de la diversitat en la immunitat humana.Nat. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Manca de millora en la supervivència de l'al·loempelt renal malgrat una disminució marcada de les taxes de rebuig agut durant l'època més recent.Am.J. Transplant.4,378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. i Nishio-Lucar, A. La funció de l'empelt i els resultats a mitjà termini dels trasplantaments de ronyó van millorar en l'última dècada: anàlisi de la base de dades de trasplantaments renals dels Estats Units. Trasplantament. directe 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. et al. L'expressió dels gens IGHV3-23 mutats en la leucèmia limfocítica crònica identifica un subconjunt de malalties amb característiques clíniques i biològiques peculiars. Clin. Càncer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. Superantígens de cèl·lules B: definició i impacte potencial en la resposta immune.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ & Goodyear, superantígen de cèl·lules B model CSA i immunobiologia dels limfòcits B. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ & Goodyear, CSConfounding de les defenses de cèl·lules B: lliçons d'un superantigen estafilocòcic. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Els cúmuls de cèl·lules B ectòpiques que s'infiltren als ronyons humans trasplantats són clonals. Proc. Natl Acad. Ciència. 108,5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. L'immunogen coestimulador LPS indueix els clons de cèl·lules B que s'infiltren als ronyons humans trasplantats. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 109, 6036-6041(2012).

47,Mòdena,BDet al. Els canvis en les poblacions del microbioma urinari es correlacionen en els trasplantaments de ronyó amb la fibrosi intersticial i l'atròfia tubular documentada en biòpsies de vigilància primerenca. Am. J. Transpl.17,712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. New insights into the enigma of immunoglobulina D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, K. et al. La immunoglobulina D millora la vigilància immune activant programes antimicrobians, proinflamatoris i estimulants de cèl·lules B en basòfils. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basophils and masto cells in renal injury.KidneyInt.76,1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Seguiment molecular d'un virus de la immunodeficiència humana

El clon de cèl·lules T citotòxiques específiques nef mostra la persistència de l'ADN del receptor de les cèl·lules T específiques del clon però no l'ARNm després de la teràpia antiretroviral combinada precoç. Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina,P.& Harmon, WEKidney transplantation in children.N.Engl. J. Med. 371,549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. L'evitació completa dels esteroides és eficaç i segura en nens amb trasplantament renal: un assaig aleatori multicèntric amb un seguiment de tres anys. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 classificació de la patologia de l'al·lograft renal: actualitzacions i direccions futures. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L et al. Immunosupressió sense esteroides des de 1999:129 trasplantaments renals pediàtrics amb empelt sostingut i beneficis per al pacient. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A. et al. L'impacte clínic de la immunitat humoral en el trasplantament renal pediàtric.J. Am. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).