Per què el receptor d'àcid retinoic Responder1 pot promoure el desenvolupament de malalties glomerulars?

Receptor d'àcid retinoic Responder1 promou el desenvolupament de malalties glomerulars mitjançant la via de senyalització del factor nuclear-kB

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Möller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 i Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrated Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet a Karolinska University Hospital, Huddinge, Estocolm, Suècia; 2 Departament de Medicina de Laboratori, Divisió de Patologia, Institut Karolinska de l'Hospital Universitari Karolinska, Huddinge, Estocolm, Suècia; 3 Departament de Medicina Huddinge, Karolinska Institutet de l'Hospital Universitari Karolinska, Huddinge, Estocolm, Suècia; 4 Departament de Ciències Clíniques, Intervenció i Tecnologia, Divisió de Medicina Renal, Karolinska Institutet, Estocolm, Suècia; i 5 Biociència Renal, Recerca i Desenvolupament primerenc Cardiovascular, Renal i Metabolisme (CVRM), R+D Biofarmacèutics, AstraZeneca, Göteborg, Suècia

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Copyright ª 2021, Societat Internacional de Nefrologia. Publicat per Elsevier Inc. Aquest és un article d'accés obert sota la llicència CC BY

Correspondència: Jaakko Patrakka, Departament de Medicina de Laboratori, Divisió de Patologia, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Suècia. Correu electrònic: jaakko.patrakka@ki.se Rebut el 27 de juliol de 2020; revisat l'11 de maig de 2021; acceptat el 20 de maig de 2021; publicat en línia el 18 de juny de 2021

PARAULES CLAU: glomerularcèl·lula endotelial; NF-kB; podòcit; Rarres1

Les vies inflamatòries s'activen en la majoriamalalties glomerularsperò els mecanismes moleculars que els condueixen al teixit renal són poc coneguts. Ens vam identificaràcid retinoicreceptor de resposta 1 (Rarres1) com una proteïna molt enriquida en podòcits en ronyons sans. Els estudis en animals eliminadors específics de podòcits van indicar que Rarres1 no era necessari per al desenvolupament o manteniment normal de la barrera de filtració del glomèrul i no va modular el resultat de la malaltia renal en un model de glomerulonefritis. Curiosament, vam detectar una inducció de l'expressió Rarres1 en cèl·lules endotelials capil·lars glomerulars i peritubulars en IgA i malaltia renal diabètica, així com en vasculitis associada a ANCA. L'anàlisi dels conjunts de dades d'ARN disponibles públicament va mostrar que la inducció de l'expressió de Rarres1 era un mecanisme molecular comú en les malalties renals cròniques. Una línia de ratolí condicional, que sobreexpressava Rarres1 específicament a les cèl·lules endotelials, no va mostrar cap fenotip renal evident. Tanmateix, la sobreexpressió va promoure la progressió del dany renal en un model de glomerulonefritis. D'acord amb això, els ratolins knock-out condicionals, sense Rarres1 a les cèl·lules endotelials, estaven parcialment protegits en el model de malaltia. Mecànicament, Rarres1 va promoure la inflamació i la fibrosi mitjançant la via de senyalització del factor de transcripció Factor Nuclear-kB activant el receptor de tirosina cinasa Axl. Així, la inducció de l'expressió de Rarres1 a les cèl·lules endotelials és un mecanisme molecular prevalent en les glomerulopaties humanes i això sembla tenir un paper patogènic en la conducció de la inflamació i la fibrosi mitjançant la via de senyalització del factor nuclear-kB.

Declaració translacional

Hem identificat la regulació a l'alça deàcid retinoicProteïna responent del receptor 1 (Rarres1) en cèl·lules endotelials (EC) de glomerulopaties humanes comunes. La inducció sembla tenir un paper patogènicmalaltia glomerularja que la progressió de la glomerulonefritis es va (i) agreujar en un ratolí que sobreexpressava Rarres1 específicament en EC, i (ii) es va millorar en una línia eliminatòria específica de Rarres1 d'EC. Rarres1 pot ser un biomarcador per detectar danys microvasculars en malalties renals i potencialment un nou objectiu terapèutic.

Malaltia glomerularEls processos són una de les principals causes de la malaltia renal en fase terminal. La nefropatia diabètica (DN) és a nivell mundial la causa més freqüent de malaltia renal terminal, mentre que la nefropatia IgA (IgAN) és la glomerulonefritis primària (GN) més predominant.1,2 Histològicament, el dany glomerular en aquests trastorns comuns es manifesta de manera molt similar. moda. Això inclou l'activació de les cèl·lules endotelials glomerulars (GEC), l'expansió de la matriu extracel·lular, la proliferació de cèl·lules mesangials, dany dels podòcits i, finalment, la pèrdua de podòcits.3

Els estudis de perfils de transcripcions globals en biòpsies renals humanes han demostrat una forta signatura inflamatòria en els trastorns glomerulars,4–7 i els estudis amb ratolins han demostrat que l'activació del factor nuclear-kB (NF-kB) i el factor de creixement transformador-b (TGF-b) Les vies de senyalització tenen un paper important en la progressió de la malaltia.8,9 És important destacar que l'orientació farmacèutica de la via NF-kB té efectes renoprotectors en models animals, cosa que indica que la via és un objectiu potencial per tractarmalalties glomerulars.10,11 Als podòcits, recentment hem identificat el membre B del grup 5 del receptor acoblat a proteïnes G de classe C com a modulador de la resposta inflamatòria mediada per NF-kB.12 No obstant això, l'activació de les vies inflamatòries en les glomerulopaties és probablement impulsada per múltiples tipus de cèl·lules. . De fet, l'activació de la via de senyalització NF-kB es detecta en els GEC en moltes malalties renals humanes.13,14 Els mecanismes moleculars implicats en l'activació de NF-kB en els GEC són poc coneguts.

Receptor d'àcid retinoic Responder1 pot promoure el desenvolupament deMalalties glomerulars

En aquest estudi, hem analitzat les signatures moleculars dels humansmalalties glomerularsi va identificar la inducció deàcid retinoicexpressió del receptor responent 1 (Rarres1) en GEC com a signatura molecular comuna en DN, IgAN i vasculitis associada a autoanticòs citoplasmàtics anti-neutròfils (ANCA). Els estudis en línies de ratolí amb activació/inactivació de l'expressió Rarres1 en cèl·lules endotelials (EC) demostren que aquesta inducció té un paper patogènic en un model de ratolí de GN. Mecànicament, Rarres1 activa el receptor de tirosina cinasa Axl, donant lloc a l'activació de la via de senyalització NF-kB. Proposem Rarres1 com un nou biomarcador de dany microvascular que pot ser un objectiu terapèutic atractiu per amalaltia glomerularprocessos modulant les respostes inflamatòries.

Figura 1|(Continuació) (c) Anàlisi de BackSPIN que mostra l'expressió de Rarres1 específicament en podòcits (PD) en dades d'RNAseq del teixit renal murí (dades de Woroniecka et al.6). ( d ) Nivells relatius d'ARNm de Rarres1 en Tub i Glom aïllats de mostres humanes. Les dades s'expressen com un canvi de plec de l'expressió Rarres1 al Glom en comparació amb el Tub. *P < 0,05="" versus="" tub.="" (="" e="" )="" imatge="" microscòpica="" fluorescent="" fl="" confocal="" representativa="" de="" l'expressió="" rarres1="" (verd)="" per="" podòcits="" en="" glomèruls="" humans="" de="" subjectes="" normals.="" (f)="" imatges="" microscòpiques="" confocals="" representatives="" que="" mostren="" l'expressió="" de="" rarres1="" en="" podòcits="" de="" subjectes="" humans;="" la="" vimentina="" es="" va="" utilitzar="" com="" a="" marcador="" per="" als="" processos="" principals="" i="" la="" nefrina="" com="" a="" marcador="" per="" als="" processos="" del="" peu="" dels="" podòcits.="" el="" cd31="" es="" va="" utilitzar="" com="" a="" marcador="" de="" cèl·lules="" endotelials="" i="" l'actina="" del="" múscul="" llis="" ⍺="" (⍺sma)="" es="" va="" utilitzar="" com="" a="" marcador="" de="" cèl·lules="" mesangials.="" barres="50/10" mm.="" les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" es="" va="" utilitzar="" la="" prova="" t="" de="" l'estudiant="" per="" a="" comparacions="" entre="" 2="" grups.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

MÈTODES

Extracció d'ARN i reacció en cadena de la polimerasa en temps real

Els glomèruls es van aïllar tal com es va descriure anteriorment.15 L'ARN es va extreure mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen) i el kit RNeasy (Qiagen Inc.). El kit de síntesi d'ADNc iScript es va utilitzar per generar ADNc. La reacció quantitativa en cadena de la polimerasa es va realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real CFX96 Touch amb SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Els primers utilitzats s'enumeren a la taula complementària S1. Els nivells d'expressió relatius es van calcular mitjançant el mètode 2-DDCT.

Cultiu cel·lular

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd - plasmidi (VectorBuilder Inc. Els clons s'han expandit sota selecció de puromicina (Merck KGaA). La transfecció d'ARN d'interferència curta (siRNA) per a Axl/Rarres1 es va realitzar mitjançant siRNA d'Origene. Les cèl·lules es van transfectar amb 30 nM siRNA seguit de complexació amb reactiu de transfecció JetPEI (Polyplus-transfection SA) amb o sense estímuls de TGF-b1 (10 ng/ml en medi de cultiu) L'inhibidor d'Axl R428 (Selleck Chemicals) es va afegir 1 hora abans del tractament (3 mmol/ l).

Per què el receptor d'àcid retinoic Responder1 pot promoure el desenvolupament deMalalties glomerulars?

Western blot

Les cèl·lules es van lisar amb tampó de lisi RIPA complementat amb còctels d'inhibició de proteasa/fosfatasa (Roche). Les proteïnes de les fraccions nuclears es van aïllar mitjançant el kit d'extracte nuclear (Active Motif Europe). Els lisats es van separar en un gel de poliacrilamida-dodecil sulfat de sodi del 4% al 12% de Tris-glicina (Invitrogen) i es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè (Bio-Rad). Les membranes es van bloquejar amb albúmina sèrica bovina al 5% (Merck). La incubació amb anticossos primaris es va dur a terme durant la nit (anticossos a la taula complementària S2). Es van utilitzar anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant i el substrat Clarity Western ECL (Bio-Rad) per detectar senyals. Les anàlisis de Western blot es van realitzar almenys dues vegades.

Hibridació in situ de l'ARN

Les anàlisis de RNAscope es van realitzar en ronyons humans incrustats en parafina segons el protocol del fabricant (ACD). Les sondes utilitzades van ser NPHS1 - Cat No. 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3 i RARRES1 - Sonda personalitzada dirigida a nucleòtids {{8 }}.

Valoració de la lesió renal

La proporció d'albúmina i creatinina urinària es va avaluar mitjançant el kit ELISA d'albumina de ratolí (Allbuwell M; Ethos Biosciences) i el kit d'assaig de creatinina QuantiChrom (BioAssay Systems). Els teixits renals es van fixar en una solució de formalina tamponada neutra al 10 per cent i es van incrustar en parafina, seguit de tall i tinció periòdica d'àcid-Schiff. La microscòpia electrònica es va realitzar en mostres fixades en glutaraldehid al 2,5 per cent.

Immunotincions

Els teixits incrustats en parafina es van fixar durant 24 hores en formalina. Les seccions de cinc micròmetres es van desparafinar i es van tractar amb microones en tampó d'àcid tetraacètic Tris-etilendiamino (10 mM de base Tris, solució tampó d'àcid etilendiaminotetraacètic 1 mM, 0.05 per cent de Tween). 20, pH 9.0) o tampó de citrat de sodi (citrat de sodi 10 mM, 0,05 per cent de Tween 20, pH 6,0), seguit de permeabilització amb 0,3 per cent de Tritó X-100 i bloquejat amb un 10 per cent de sèrum de cabra normal, un 3 per cent de peroxidasa d'hidrogen i el kit de bloqueig de vectors (Vector Laboratories). Les diapositives es van desenvolupar mitjançant el kit de substrats DAB peroxidasa (peroxidasa de rave picant), 3,30 -diaminobenzidina (Vector Laboratories).

Per a les seccions congelades, les seccions fixades amb acetona es van permeabilitzar amb 0,1% Tween 20 i es van bloquejar amb un sèrum de cabra normal al 10%. Els anticossos primaris utilitzats es mostren a la taula complementària S1. Els anticossos secundaris Alexa-Fluor per a la immunofluorescència es van obtenir a partir de Molecular Probes (Life Technologies). Les imatges es van obtenir mitjançant el microscopi confocal Leica SP8 (Leica Microsystems).

Mostres humanes

Les biòpsies renals es van obtenir de l'Hospital Universitari Karolinska (Estocolm, Suècia). Es van obtenir mostres de control dels pols de ronyó sans d'individus sotmesos a nefrectomies tumorals. El comitè d'ètica local va aprovar l'estudi (aprovació núm. 2010/579-31/1, Estocolm, Suècia).

versus control (Ctrl.) o ***P <{{0}}.001 versus="" control="" si-negatiu="" (rebarbament)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (="" c="" )="" documents="" representatius="" de="" western="" blot="" i="" dades="" resumides="" que="" mostren="" els="" nivells="" relatius="" de="" proteïna="" de="" pp65="" en="" fraccions="" nuclears="" aïllades="" de="" podòcits="" tractades="" amb="" 10="" ng/ml="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{4{0}}.001="" enfront="" dels="" podòcits="" de="" control="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (="" d="" )="" documents="" representatius="" de="" western="" blot="" i="" dades="" resumides="" que="" mostren="" els="" nivells="" relatius="" de="" proteïna="" de="" pp65="" en="" fraccions="" nuclears="" aïllades="" de="" podòcits="" tractades="" amb="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±="" 3="" mmol/l="" r428,="" n="2." (="" e="" )="" western="" blot="" representatiu="" que="" mostra="" que="" la="" sobreexpressió="" de="" rarres1="" activa="" axl="" de="" manera="" constitutiva.="" *p=""><0,05 (n="2)." (="" f="" )="" nivells="" relatius="" d'arnm="" de="" gens="" relacionats="" amb="" emt="" en="" podòcits="" que="" sobreexpressen="" rarres1="" (rarres1)="" o="" podòcits="" de="" control="" (ctrl.)="" transfectats="" amb="" sirna="" per="" a="" axl="" (siaxl),="" control="" si-negatiu="" (rebarbament),="" ##p=""><0,01, ##="" #p="">< 0,001="" versus="" revolt,="" n="3," o="" tractat="" amb="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 versus="" ctrl.,="" **p=""><0,01, ***p=""><0,001 versus="" rarres1,="" *p=""><0,05 versus="" rarres1,="" n="4." les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sd.="" es="" va="" utilitzar="" la="" prova="" t="" de="" student="" per="" a="" comparacions="" entre="" 2="" grups.="" ut,="" sense="">

Figura 3|Establiment de ratolins Rarres1 knockout específics per a podòcits (CreD/Rarres1flfl/flfl). ( a ) Generació de ratolins knockout condicionals en què Rarres1 s'elimina específicament en podòcits mitjançant el sistema de recombinació Cre-LoxP. L'exó 3 s'elimina a la recombinació mediada per NPHS2-Cre. ( b ) El genotipat es va confirmar mitjançant la preparació de la cua i la reacció en cadena de la polimerasa a les 4 setmanes d'edat. (continuació)

Figura 3|(Continuació) (c) Western blot representatiu que mostra la disminució de l'expressió de Rarres1 en glomèruls aïllats de ratolins Rarres1 knockout específics de podòcits (Creþ/Rarres1flfl/flfl). ( d ) La pèrdua específica dels podòcits de Rarres1 no afecta els nivells d'albuminúria en ratolins tractats amb sèrum nefrotòxic (NTS) tal com s'analitza per la relació albúmina-creatinina d'orina en diferents grups de ratolins (NTS-ctrl., n {{1{{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). ( e ) Fotomicrografies i quantificacions que mostren els canvis típics de l'estructura glomerular en diferents grups de ratolins. Les lesions glomerulars es van identificar en seccions periòdiques tenyides amb àcid Schiff. #P <0.0{001 versus="" control="" no="" tractat="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (="" f="" )="" fotomicrografies="" i="" quantificacions="" representatives="" del="" gruix="" mitjà="" de="" la="" membrana="" basal="" glomerular="" (gbm)="" i="" el="" nombre="" d'escletxes="" per="" mm="" gbm="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" mitjançant="" anàlisis="" de="" microscòpia="" electrònica="" de="" transmissió.="" ##p=""><0,01, ###p=""><0,001, ####p=""><0,0001 versus="" control="" no="" tractat="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{{="" {33}}cko,="" n="6)." les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" l'anàlisi="" unidireccional="" de="" la="" variància="" seguida="" de="" la="" prova="" posterior="" de="" tukey="" per="" a="" comparacions="" múltiples="" es="" va="" utilitzar="" per="" a="" grups="" de="" 3="" o="" més.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

Línies del ratolí

Els ratolins Floxed Rarres1 amb fons C57Bl/6J (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) eren podocina (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) i ratolins Tie2 cre (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) per generar ratolins eliminadors específics de cèl·lules. Els ratolins GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J es van creuar amb una línia Tie{2-cre per activar l'expressió Rarres1 específicament a les EC.17 La reproducció i el genotipat es van fer segons l'estàndard. procediments. Tots els estudis en animals es van dur a terme al Laboratori Preclínic (Karolinska Institutet) d'acord amb les directrius i regulacions pertinents i es van aprovar pel Comitè Ètic sobre la cura dels animals de recerca (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Nefropatia induïda per sèrum nefrotòxic (NTS) en ratolins

Els ratolins de set a 9-setmanes van rebre 50 ml d'adjuvant complet de Freund (Merck) sc, seguit d'una injecció de NTS (iv; 6 ml/kg de pes corporal; Probetex Inc.) el dia 4.18 Es va recollir orina 3, 7 , 10 i 14 dies després de la injecció, i els ratolins es van matar el dia 14.

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar amb el programari Prism 9.0 (GraphPad).

Les dades es van examinar primer per a la normalitat (test de Shapiro-Wilk). Quan la distribució era gaussiana, les dades es van analitzar mitjançant un test paramètric (test t de Student per a 2 grups i anàlisi de la variància amb el posttest de Tukey per a més de 2 grups). Quan la distribució no era gaussiana, es van utilitzar proves no paramètriques (test de Friedman amb posttest de Dunn per a més de 2 grups i test U de Mann-Whitney per a 2 grups). Les diferències es van considerar significatives quan P <>

RESULTATS

Rarres1 s'expressa pels podòcits

Primer vam avaluar el patró d'expressió de Rarres1 en teixit renal murí i humà. Les anàlisis de la reacció en cadena de la polimerasa van mostrar que Rarres1 s'expressa significativament més alt a la fracció glomerular que a la fracció tubulointersticial de l'escorça renal del ratolí (figura 1a i b6). L'anàlisi de seqüenciació d'ARN unicel·lular del teixit renal murí va revelar que Rarres1 s'expressa exclusivament pels podòcits (figura 1c). En humans, Rarres1 també es va enriquir en teixit glomerular (figura 1d). En la immunofluorescència del teixit renal humà normal, Rarres1 va mostrar un senyal elevat als glomèruls (figura 1e). Les tincions dobles van mostrar que Rarres1 es trobava "fora" de la reactivitat de la nefrina als bucles capil·lars, cosa que suggereix l'expressió de podòcits (figura 1f). La colocalització amb vimentina va indicar la localització als processos principals. No es va observar cap reactivitat superposada per al marcador EC CD31 o el marcador mesangial -actina del múscul llis (figura 1f).

Rarres1 promou la senyalització de NF-kB i TGF-b1 mitjançant el receptor tirosina cinasa Axl

Per dilucidar el paper de Rarres1 en els podòcits, vam manipular els seus nivells d'expressió en podòcits humans immortalitzats.16 Els nivells de Rarres1 es van augmentar significativament en podòcits transfectats de manera estable amb ADNc Rarres1 humà i es van regular a la baixa després de la transfecció amb siRNA dirigit a Rarres{5} (figura 2a). La sobreexpressió de Rarres1 va augmentar l'expressió de gens relacionats amb la transició epitelial-mesenquimal, mentre que la baixada de la Rarres1 endògena va tenir l'efecte contrari (figura 2b). Com que la senyalització NF-kB té un paper important en la transició epitelial-mesenquimal que condueix a la fibrosi i la inflamació a GN, 19 vam mesurar l'activació de la senyalització NF-kB induïda per TGF-b1 in vitro. La sobreexpressió Rarres1 va provocar una major activació de la via NF-kB a la línia de base i després de l'estimulació de TGF-b1 (figura 2c). Com que s'ha informat que Rarres1 activa el receptor de tirosina cinasa Axl i, d'aquesta manera, promou la via de senyalització NF-kB en el càncer de mama inflamatori,20 vam avaluar si Axl és un potencial soci funcional de Rarres1 al teixit renal. L'activació de NF-kB induïda per TGF-b1 podria ser inhibida per R428, un inhibidor selectiu de molècules petites de la cinasa Axl21,22 (figura 2d) i la sobreexpressió de Rarres1 es va correlacionar positivament amb l'activació constitutiva de la cinasa Axl (figura 2e). L'esgotament de l'activitat d'Axl amb R428, però no el silenciament gènic d'Axl per siRNA podria disminuir l'expressió induïda per Rarres1-de gens relacionats amb la transició epitelial-mesenquimal, com ho demostra la reducció dels nivells d'ARNm (figura 2f). Cal destacar que no es va detectar cap activació de vies NF-kB no canòniques (figura suplementària S1). Així, Rarres1 va promoure la senyalització NF-kB en podòcits cultivats mitjançant l'activació de la cinasa Axl.

Per què el receptor d'àcid retinoic Responder1 pot promoure el desenvolupament de malalties glomerulars?

La inactivació de Rarres1 als podòcits no condueix a anomalies glomerulars ni modula el resultat de la nefropatia en un model GN anti-membrana basal glomerular (GBM).

Per analitzar el paper de Rarres1 en podòcits in vivo, vam generar una nova línia de ratolí Rarres1flfl/flfl (floxada) i la vam creuar amb ratolins podocin-Cre per produir ratolins Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl (Creþ/Rarres1flfl/flfl) (Figura 3a) ). Els genotips per als al·lels floxed/Cre es van identificar mitjançant el genotipat de l'oïda (figura 3b). L'anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa de les fraccions tubulointersticials i glomerulars, així com del teixit hepàtic, va confirmar la supressió de l'exó 3 específicament al glomèrul (figura suplementària S2A) i els nivells de proteïna Rarres1 es van reduir als glomèruls dels ratolins Creþ / Rarres1flfl / flll (figura). 3c).

Figura 4|Regulació de Rarres1 en cèl·lules endotelials capil·lars glomerulars i peritubulars en pacients amb malaltia renal crònica. ( a ) Anàlisi de l'expressió gènica de Rarres1, col·lagen1a2 (COL1A2) i nefrina (NPHS1) en dades de microarrays de glomèruls aïllats de pacients amb nefropatia diabètica (DN), vasculitis, nefropatia IgA (IgAN) i subjectes control (Ctrl.). 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" enfront="" de="" subjectes="" de="" control.="" (="" b="" )="" anàlisi="" quantitativa="" de="" la="" reacció="" en="" cadena="" de="" la="" polimerasa="" per="" als="" gens="" rarres1,="" col1a2="" i="" nphs1="" en="" glomèruls="" aïllats="" de="" pacients="" amb="" dn="" (n="5)" i="" controls="" (n="5)." **p=""><0,01, ***p=""><0,001 versus="" subjectes="" control.="" (="" c="" )="" anàlisi="" de="" l'expressió="" gènica="" rarres1="" i="" col1a2="" en="" dades="" de="" microarrays="" de="" fracció="" tubular="" aïllada="" de="" pacients="" amb="" dn,="" vasculitis,="" igan="" i="" control.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 versus="" subjectes="" control.="" (="" d="" )="" fotomicrografies="" representatives="" de="" la="" tinció="" immunohistoquímica="" de="" rarres1="" en="" teixit="" cortical="" renal="" humà="" de="" controls="" i="" pacients="" amb="" dn="" (n="5)," vasculitis="" d'autoanticòs="" citoplasmàtics="" anti-neutròfils="" (anca)="" (n="4)" i="" igan="" (="" n="5)." les="" fletxes="" indiquen="" podòcits="" rarres1-positius="" (control)="" i="" cèl·lules="" endotelials="" (ec)="" (dn,="" igan="" i="" vasculitis).="">

Figura 4|(Continuació) (e) Imatges microscòpiques confocals representatives que mostren l'expressió de Rarres1 en glomèruls de pacients amb DN. El CD31 es va utilitzar com a marcador per a EC. Barres=50/10 mm. ( f ) Imatges fluorescents FL confocals representatives de l'RNAscope que mostren l'expressió del gen Rarres1 en cèl·lules que coexpressen PECAM1- a la fracció tubular de pacients amb DN. Les dades s'expressen com a mitjanes ± SEM. Es va utilitzar la prova t de l'estudiant per a comparacions entre 2 grups. Barres=50/10 mm. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.kidney-international.org.

Els ratolins Creþ/Rarres1flfl/flfl van néixer amb una proporció d'herència mendeliana esperada i eren viables i fèrtils (dades no mostrades). Els ronyons eren indistinguibles dels companys de control (Cre-/Rarres1flfl/flfl) tal com es va analitzar mitjançant un examen rutinari de llum i microscòpia electrònica (figura suplementària S2B i C). A més, la distribució de les proteïnes podòcits nefrina i sinaptopodina no es va veure afectada en els ratolins Creþ/ Rarres1flfl/flfl (figura suplementària S2D)

Per dilucidar el paper de Rarres1 en la lesió renal in vivo, Creþ/Rarres1flfl/flfl es va tractar amb NTS que condueix a dipòsits d'IgG al GBM, albuminúria i GN progressiu.23 Els nivells d'albuminúria eren similars tant en Creþ/Rarres1flfl/flfl com en el control. ratolins (figura 3d). L'examen microscòpic lleuger no va revelar diferències significatives en la proporció de glomèruls afectats (figura 3e). La microscòpia electrònica no va mostrar cap diferència en el gruix del GBM o l'esborrament del procés del peu, i els GEC semblaven estar afectats de manera similar en ambdós grups (figura 3f). Els marcadors de podòcits nefrina, Wt1 i sinaptopodina es van veure afectats de manera similar en ambdós grups (figura suplementària S3A). A més, la tinció d'EC mitjançant CD31 no va mostrar diferències en els glomèruls o capil·lars peritubulars entre els grups (figura suplementària S3B i C). A més, l'expressió de la fibrosi i els gens relacionats amb la inflamació es van elevar de manera similar en ambdós grups tractats amb NTS (figura suplementària S4).

L'expressió Rarres1 s'indueix en EC capil·lars glomerulars i peritubulars en malaltia renal crònica (ERC)

Per explorar el paper de Rarres1 en la CKD, vam analitzar la seva expressió en conjunts de dades d'ARN disponibles públicament. Vam observar nivells de Rarres1 significativament elevats en glomèruls aïllats de pacients amb DN, vasculitis associada a ANCA i IgAN (figura 4a),4,6,24-26, mentre que altres gens associats a podòcits, per exemple, la nefrina, estaven significativament regulats o sense canvis. . La nostra anàlisi quantitativa de la reacció en cadena de la polimerasa de glomèruls aïllats de pacients amb DN (n=5) va validar la inducció de l'expressió Rarres1 (figura 4b). A causa de la pèrdua de podòcits, l'expressió dels gens podòcits sol disminuir progressivamentmalalties glomerulars,6 i la proporció de Rarres1 glomerular a l'expressió de nefrina es va augmentar aproximadament 20- vegades en DN versus glomèruls sans (figura 4b). L'expressió de Rarres1 també es va regular en conjunts de dades de teixit tubulointersticial en DN, vasculitis associada a ANCA i IgAN (figura 4c).8-11.

A continuació, es va analitzar l'expressió de Rarres1 immunohistoquímicament en biòpsies renals de pacients amb DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5) i vasculitis associada a ANCA (n ¼ 4). En els glomèruls malalts, la tinció de Rarres1 semblava estar localitzada als GEC, tal com mostra la immunoreactivitat a la cara interna de les parets capil·lars (figura 4d, insercions), mentre que el senyal dels podòcits semblava més feble. A l'espai tubulointersticial, la tinció es va detectar als capil·lars peritubulars (figura 4d, insercions), cosa que suggereix l'expressió EC. La doble immunomarcació amb CD31 va validar la localització als EC tant als glomèruls com als capil·lars peritubulars (figura 4e). De la mateixa manera, els experiments de doble RNAscope van mostrar la colocalització de l'ARNm de Rarres1 amb l'ARNm de PECAM1 a DN (figura 4f). En conjunt, la inducció de l'expressió de Rarres1 en EC capil·lars glomerulars i peritubulars era un fenomen comú en la CKD.

Generació i caracterització d'una línia de ratolí que sobreexpressa Rarres1 en EC

Com que Rarres1 s'indueix a la CKD humana, vam generar una nova línia de ratolí transgènic en què es va introduir l'ADNc de Rarres1 al locus Rosa26 sota el promotor CAG,27 amb un casset lox-STOP-lox entre els llocs acceptors d'empalmament (figura 5a). La línia es va creuar amb una línia Tie2-cre per generar ratolins Rarres{1_Tie{2_KI, i els ratolins es van identificar mitjançant el genotip de l'oïda per als al·lels knockin i Cre (figura 5a). Els ratolins Rarres1_Tie{2_KI van mostrar nivells significativament augmentats de proteïna Rarres1 al teixit renal (figura 5b) i l'estratègia de knockin reeixida es va validar encara més mitjançant l'anàlisi de l'expressió d'ARNm de Rarres1 en GFP-positiu ordenat per FACS GEC (figura 5c).

Hem fenotipat ronyons de ratolins Rarres1_Tie2_KI i ratolins de control en grups d'edat. Mitjançant un examen microscòpic lleuger, la morfologia renal no es va distingir en els ratolins Rarres1_Tie{2_KI dels companys de control (figura 5d). De la mateixa manera, la microscòpia electrònica va mostrar un gruix GBM sense canvis i una amplada del procés del peu del podòcit (figura 5e). A més, l'expressió dels marcadors de podòcits nefrina i sinaptopodina no semblava afectada en els glomèruls que sobreexpressen Rarres1 (figura 5f). Cal destacar que altres òrgans principals no van mostrar macroscòpicament ni microscòpicament cap anomalia òbvia (dades no mostrades).

Figura 5|Establiment de ratolins Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) específics de cèl·lules endotelials. ( a ) Una generació de ratolins knockin condicionals en què l'expressió de Rarres1 s'indueix específicament a les cèl·lules endotelials (EC) mitjançant el sistema de recombinació Cre-LoxP. Els ratolins Tie2-Cre es van creuar amb ratolins que expressaven el vector d'orientació (Rarres1_casetteþ), que contenia un casset lox-STOP-lox entre l'empalmament (continuació)

Figura 5|(continuació) els llocs acceptors i l'ADNc de Rarres1 sota el promotor CAG, que es va introduir al locus Rosa26, es van identificar mitjançant el genotipat de l'oïda. El genotipat es va confirmar mitjançant la preparació de l'oïda i la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) a les 4 setmanes d'edat. ( b ) Western blot representatiu que mostra l'augment de l'expressió de Rarres1 a l'escorça renal de ratolins Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) específics d'EC. **P <0.01 versus="" control="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" prova).="" (="" c="" )="" pcr="" quantitativa="" per="" a="" rarres1="" en="" ec="" aïllades.="" **p="">< 0,01="" versus="" control="" (cre-/rarres1_tie{2_ki,="" n="3," prova="" t="" de="" student).="" (="" d="" )="" fotomicrografies="" representatives="" de="" seccions="" tenyides="" d'àcid="" periòdic="" amb="" schiff="" que="" mostren="" estructures="" glomerulars="" típiques="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins.="" (="" e="" )="" fotomicrografies="" i="" quantificacions="" representatives="" del="" gruix="" mitjà="" de="" la="" membrana="" basal="" glomerular="" (gbm)="" i="" el="" nombre="" de="" ranures="" per="" mm="" gbm="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" mitjançant="" anàlisis="" de="" microscòpia="" electrònica="" de="" transmissió="" (test="" t="" de="" student).="" (f)="" imatges="" microscòpiques="" confocals="" representatives="" que="" mostren="" l'expressió="" del="" marcador="" específic="" del="" podòcit="" sinaptopodina="" i="" nefrina="" en="" ratolins="" rarres1="" específics="" d'ec="" (rarre1_tie{2_ki)="" i="" ctrl.="" ratolins.="" barres="10" mm.="" les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

La inducció de Rarres1 en EC modula la via de senyalització NF-kB i el resultat de la nefropatia mitjançant la regulació de l'activació d'Axl

Per avaluar si l'expressió de Rarres1 en EC modula la progressió de la malaltia, vam induir GN en ratolins transgènics i els seus companys amb una única injecció de NTS. Els ratolins Rarres1_- Tie2_KI van desenvolupar nivells significativament més alts d'albuminúria que els controls després de 3 dies, mentre que no es va observar cap diferència significativa en l'albuminúria als 7, 10 i 14 dies (figura 6a). L'anàlisi histològica 14 dies després de la inducció va mostrar que els ratolins Rarres1_Tie2_KI no tenien més alteracions glomerulars, com ara lesions escleròtiques i creixents (figura 6b). L'avaluació microscòpica electrònica va mostrar, però, un GBM significativament més gruixut i més esborrament del procés del peu en els ratolins Rarres1_Tie{2_KI (figura 6c). A més, els ratolins Rarres1_Tie{2_KI van mostrar un augment dels nivells d'actina del múscul llis a l'escorça renal (figura 6d). L'anàlisi dels marcadors de podòcits nefrina, sinaptopodina i WT1 va mostrar una reducció profunda que suggereix una desdiferenciació i una pèrdua significativa de podòcits (figura 6d). És important destacar que els glomèruls de Rarres1_Tie2_KI van mostrar menys podòcits WT1-positius en comparació amb els animals de control, cosa que indica que Rarres1 expressat per EC estava promovent el dany dels podòcits. A més, es van detectar més trombos de fibrina als glomèruls de Rarres1_Tie2_KI (figura 6e). D'acord amb això, l'expressió de diferents gens relacionats amb la inflamació, la fibrosi i les lesions tubulars renals es va incrementar significativament en els ratolins Rarres1_- Tie{2_KI, tal com mostra l'anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa en temps real per a Il. -1beta, Col1a1, TGF-b1 i molècula de lesió renal-128 al teixit de l'escorça renal (figura 6f). Tanmateix, no es van detectar diferències en els valors de nitrogen ureic i S-creatinina en sang entre els grups (figura 6g). A més, la tinció d'EC mitjançant CD31 no va mostrar diferències en els glomèruls o capil·lars peritubulars entre els grups (figura suplementària S5A i B). En conjunt, la inducció específica de l'EC de l'expressió Rarres1 va agreujar la patologia glomerular en la nefropatia induïda per NTS.

Mecànicament, vam analitzar si la sobreexpressió de Rarres1 en EC va promoure l'activació de la senyalització Axl i NF-kB in vivo, de manera similar a les nostres observacions in vitro (figura 2). Tant els ratolins Rarres1_Tie{2_KI com els controls tractats amb NTS van mostrar una activació de la via de senyalització Axl tal com es mostra per l'augment de la fosforilació d'Axl (figura 6h). Tanmateix, aquesta activació va ser més significativa en els ratolins Rarres1_- Tie2_KI (figura 6h). En conseqüència, es va promoure l'activació de la via NF-kB en aquests ratolins, tal com mostra el nombre de nuclis positius pP65- als glomèruls (figura 6i). Quan es van mesurar els nivells de pP65 mitjançant Western blotting, vam detectar una tendència similar per a l'activació de la via NF-kB, tot i que això no va ser significatiu, possiblement a causa d'un valor atípic (figura suplementària S5C).

La inactivació de Rarres1 en EC disminueix el dany glomerular en el model de glomerulonefritis anti-GBM

Per validar el paper patogènic de Rarres1 derivat de l'EC a la CKD, vam generar una línia de ratolí en la qual es va suprimir Rarres1 als EC mitjançant Tie2-Cre (figura 7a). Els genotips per als al·lels floxed i Cre es van identificar mitjançant el genotipat de l'oïda (figura 7b). Hi va haver una tendència a la regulació a l'alça de Rarres1 en ratolins tractats amb NTS, que es va abolir als ratolins Rarres1_Tie2_KO (figura 7c). Els ratolins no van mostrar cap anomalia renal evident (dades no mostrades). La injecció de NTS va induir una albuminúria similar a Rarres1_Tie2_KO i controls (figura 7d). Tanmateix, l'anàlisi histològica 14 dies després de la inducció va mostrar menys alteracions glomerulars en els ratolins Rarres1_- Tie2_KO (figura 7e). En microscòpia electrònica, els ratolins Rarres1_Tie2_KO van mostrar menys esborrament del procés del peu i engrossiment del GBM (figura 7f). La immunotinció no va mostrar diferències significatives per a aSMA, nefrina o sinaptopodina (figura 7g). Tanmateix, el nombre de podòcits WT1-positius va ser significativament més gran en els ratolins Rarres{1_Tie{2_KO (figura 7g). La tinció de pP65 va mostrar una disminució del nombre de nuclis positius als glomèruls Rarres1_Tie{2_KO que suggereix la implicació de la via de senyalització NF-kB (figura 7h).

Figura 6|(continuació) quantificació del gruix mitjà de la membrana basal glomerular (GBM) i el nombre d'escletxes per mm GBM en diferents grups de ratolins mitjançant seccions d'anàlisi de microscòpia electrònica de transmissió (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=12). ( d ) Imatges microscòpiques confocals representatives que mostren les expressions de nefrina, sinaptopodina, actina del múscul llis ⍺ (⍺ Sma) i WT1 al ronyó de diferents grups de ratolins. Barres de {{10}}/10 mm. L'àrea ⍺Sma positiva es va comptar per secció transversal cortical i WT1 es va comptar per glomèrul (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Empat2_KI, n {{2{0}}). (e) Presència de trombi de fibrina als glomèruls detectats per tinció de tricoma (comptats per secció transversal glomerular) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Empat2_KI, n=5). (f) Nivells relatius d'ARNm de diferents gens relacionats amb la inflamació, la fibrosi i la lesió tubular renal a l'escorça renal de ratolins tractats amb NTS (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=6–10). (g) Nivells de creatinina sèrica i nitrogen d'urea en sang (BUN) a NTS-ctrl. (n=3) i NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3). (h) Documents representatius de Western blot i dades resumides que mostren els nivells relatius de proteïna de Paxil a l'escorça renal en diferents grups de ratolins tractats amb NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Empate2_KI, n=5). (i) Fotomicrografies representatives de la tinció immunohistoquímica pP65 en teixit cortical renal de diferents grups de ratolins tractats amb NTS. Els nuclis positius pP65-per glomèruls es van quantificar en els diferents grups de ratolins (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). Ratolins Rarres1 específics d'EC (ratolins Rarres1_Tie{2_KI); Es van utilitzar ratolins amb casset Rarres1 i sense expressió Cre (Ctrl.) com a control. #P <0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 versus="" control="" no="" tractat="" (ctrl.),="" *="" p=""><0,05 versus="" control="" tractat="" amb="" nts="" (nts-ctrl.).="" les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" es="" va="" utilitzar="" la="" prova="" t="" de="" l'estudiant="" per="" a="" comparacions="" entre="" 2="" grups.="" l'anàlisi="" unidireccional="" de="" la="" variància="" seguida="" de="" la="" prova="" posterior="" de="" tukey="" per="" a="" comparacions="" múltiples="" es="" va="" utilitzar="" per="" a="" grups="" de="" 3="" o="" més.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

DISCUSSIÓ

Rarres1 es va identificar per primera vegada en cultius de bassa de pell tractats amb tazarotè29 i s'ha demostrat que actua com a repressor d'invasió en línies cel·lulars de càncer de pròstata.30 En el càncer de mama inflamatori, Rarres1 regula in vitro la invasió de cèl·lules canceroses mitjançant la mediació de la via de senyalització Axl. . En detall, Rarres1 estabilitza Axl mitjançant la inhibició de la degradació d'Axl dependent del proteasoma. A més, l'esgotament de Rarres1 a les cèl·lules SUM149 regula a la baixa l'expressió d'Axl i inactiva NF-kB, donant lloc a una invasió reduïda de cèl·lules inflamatòries de càncer de mama. suggerit en un model de fibrosi pulmonar de rata i durant l'activació fibrogènica de cèl·lules estelades hepàtiques.31 En conjunt, estudis anteriors in vitro suggereixen un paper de Rarres1 en la fibrosi, la inflamació i la invasió del càncer.

Inicialment, Rarres1 va despertar el nostre interès ja que estava molt enriquit en cèl·lules podòcits. Podríem demostrar que Rarres1 va promoure la senyalització inflamatòria i profibròtica als podòcits mitjançant l'activació de la via NF-kB mediada per Axl. D'altra banda, els animals eliminatoris específics de podòcits no van mostrar cap diferència òbvia en comparació amb els controls en condicions saludables, així com en un model de ratolí de GN. Això podria ser degut a mecanismes compensatoris, ja que la via de senyalització NF-kB està regulada per una sèrie de molècules i processos biològics.

El perfil molecular de pacients amb diabetis va indicar que Rarres1 es va induir en EC capil·lars glomerulars i peritubulars a DN. És important destacar que l'expressió Rarres1 no es va detectar en EC en pacients diabètics sense nefropatia. Per tant, especulem que Rarres1 podria ser un nou marcador de la malaltia microvascular diabètica, i s'indiquen estudis en mostres de plasma i orina per explorar la viabilitat de Rarres1 com a biomarcador no invasiu. També vam identificar la inducció de Rarres1 en pacients amb IgAN i vasculitis. És temptador especular que Rarres1 té un paper patogènic en aquestes glomerulopaties i contribueix a la progressió de la malaltia. Funcionalment, vam demostrar que la inducció de Rarres1 a les EC va augmentar la lesió renal en un model murí de GN, mentre que la inactivació de Rarres1 a les EC va millorar la lesió. L'anàlisi fenotípica va mostrar que els podòcits es van veure afectats en ratolins que sobreexpressaven Rarres1 en EC. Aquest pot ser un efecte directe de Rarres1 sobre els podòcits, ja que s'ha descrit una forma soluble de Rares.32 Alternativament, la lesió dels podòcits pot ser secundària al dany de la barrera de filtració del glomèrul.

Anteriorment, s'ha demostrat que l'activació endotelial de NF-kB té un paper patogènic en el desenvolupament de la malaltia renal en la vasculitis. S'ha demostrat que els inhibidors d'Axl són beneficiosos en la nefritis experimental anti-GBM. Els ratolins tractats amb l'inhibidor de molècules petites més selectiu, R428, van mostrar una preservació significativa de la funció renal i una disminució de la producció de citocines inflamatòries.33 Això indica que la via podria ser una opció terapèutica per amalaltia glomerularprocessos. Tanmateix, com que tant Axl com NF-kB estan modulant una sèrie de processos cel·lulars diferents a tot el cos, és poc probable que sigui un bon candidat per a l'orientació farmacèutica en la CKD. Rarres1 pot proporcionar un objectiu més associat als ronyons.

S'ha demostrat que Tie2-Cre impulsa l'expressió en una subpoblació de cèl·lules hematopoètiques.34 Algunes d'aquestes cèl·lules poden modular la resposta inflamatòria en el model induït per NTS i, per tant, no podem excloure que Rarres1 derivada de cèl·lules hematopoètiques contribueixi a progressió de la malaltia a les línies Tie2-Cre. Tanmateix, com que no vam detectar cap expressió òbvia de Rarres1 en cèl·lules immunitàries infiltrades, creiem que això és menys probable.

Mentre aquest manuscrit estava en preparació, Chen et al.32 van informar d'una forma soluble de Rarres1 que promoumalaltia glomerularprogressió. Van identificar, de la mateixa manera que nosaltres, la regulació de Rarres1 en malalties glomerulars humanes comunes. L'estudi dóna suport a la nostra troballa que una expressió augmentada de Rarres1 es correlaciona amb la disminució de la funció renalmalaltia glomerular humana. Tanmateix, a diferència dels nostres resultats, van concloure que la regulació de Rarres1 es devia a la sobreexpressió en podòcits. No podem excloure aquesta possibilitat, però vam detectar en malalties humanes una inducció diferent de l'expressió de Rarres1 a les CE. Un mecanisme que explica les nostres troballes podria ser que la forma soluble de Rarres1 produïda pels podòcits és absorbida pels GEC. Tanmateix, els resultats que vam detectar l'ARNm de Rarres1 en EC mitjançant hibridació in situ i que Rarres1 també es va induir en EC capil·lars peritubulars donen suport a la idea que l'expressió de Rarres1 en malalties renals és principalment d'origen endotelial.

Figura 7|L'ablació endotelial específica de Rarres1 atenua la lesió renal en ratolins tractats amb sèrum nefrotòxic (NTS). ( a ) Generació de ratolins knockout condicionals en què Rarres1 s'elimina específicament a les cèl·lules endotelials mitjançant el sistema de recombinació Cre-LoxP. L'exó 3 s'elimina a la recombinació mediada per Tie2-Cre. (b) El genotipat es va confirmar mitjançant la preparació de la cua i la reacció en cadena de la polimerasa a (continuació)

Figura 7|(continuació) 4 setmanes d'edat. (c) Documents representatius de Western blot i dades resumides que mostren els nivells relatius de proteïnes de Rarres1 a l'escorça renal en diferents grups de ratolins tractats amb NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Empate2_KO, n=4) i ratolins no tractats (Control [Ctrl.], n {{10}}). **P <0.01. (="" d="" )="" uacr="" (proporció="" d'albúmina="" d'orina="" a="" creatinina)="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" amb="" tractament="" nts="" (ctrl.,="" n="7-11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (="" e="" )="" fotomicrografies="" i="" quantificacions="" que="" mostren="" els="" canvis="" típics="" de="" l'estructura="" glomerular="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins.="" les="" lesions="" glomerulars="" es="" van="" identificar="" en="" seccions="" periòdiques="" tenyides="" amb="" àcid="" schiff="" (ctrl.,="" n="3;" control="" tractat="" amb="" nts="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (="" f="" )="" fotomicrografies="" i="" quantificacions="" representatives="" del="" gruix="" mitjà="" de="" la="" membrana="" basal="" glomerular="" (gbm)="" i="" el="" nombre="" d'escletxes="" per="" mm="" gbm="" en="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" mitjançant="" seccions="" d'anàlisi="" de="" microscòpia="" electrònica="" de="" transmissió="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_empat{2_ko,="" n="16)." (="" g="" )="" imatges="" microscòpiques="" confocals="" representatives="" que="" mostren="" les="" expressions="" de="" nefrina,="" sinaptopodina,="" actina="" del="" múscul="" llis="" (sma)="" i="" wt1="" al="" ronyó="" de="" diferents="" grups="" de="" ratolins.="" barres="50/10" mm.="" l'àrea="" positiva="" sma="" es="" va="" comptar="" per="" secció="" transversal="" cortical="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie{2_ko,="" n="4)." (="" h="" )="" fotomicrografies="" representatives="" de="" la="" tinció="" immunohistoquímica="" pp65="" en="" teixit="" cortical="" renal="" de="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" tractats="" amb="" nts.="" els="" nuclis="" positius="" pp65-per="" glomèruls="" es="" van="" quantificar="" en="" els="" diferents="" grups="" de="" ratolins="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres{1_tie{2_ko,="" n="" {65-="" 56}}).="" ####p=""><0,001 versus="" ctrl.="" no="" tractat,="" *p=""><0,05 versus="" nts-ctrl.="" les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" es="" va="" utilitzar="" la="" prova="" t="" de="" l'estudiant="" per="" a="" comparacions="" entre="" 2="" grups.="" l'anàlisi="" unidireccional="" de="" la="" variància="" seguida="" de="" la="" prova="" posterior="" de="" tukey="" per="" a="" comparacions="" múltiples="" es="" va="" utilitzar="" per="" a="" grups="" de="" 3="" o="" més.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

Hi ha algunes limitacions en aquest estudi que cal reconèixer. En primer lloc, s'han realitzat estudis in vitro en podòcits, mentre que in vivo vam manipular l'expressió en EC. Per tant, no podem enllaçar directament Rarres1 amb l'activació d'Axl als EC. En segon lloc, mentre que podríem identificar una activació induïda per Rarres1- (depenent d'Axl) de la senyalització de NF-kB als podòcits, no vam investigar el mecanisme molecular d'aquest procés. Es necessiten més estudis per explorar la troballa anterior que Rarres1 promou l'activació d'Axl inhibint la seva degradació dependent del proteasoma. Finalment, vam desafiar els nostres animals eliminatoris /-en només amb el model de nefropatia induïda per NTS. Per tant, s'indiquen més estudis en models animals per veure si Rarres1 té un paper patogènic també en altres processos de malaltia.

En resum, el nostre estudi demostra que en les glomerulopaties humanes comunes, la proteïna Rarres1 enriquida amb podòcits s'indueix en EC, donant lloc a inflamació, lesió dels podòcits i fibrosi. Això està potencialment mediat per la millora de la via de senyalització NF-kB mitjançant l'activació del receptor tirosina cinasa Axl (figura 7). Rarres1 és un nou biomarcador de lesió microvascular i podria ser un nou objectiu terapèutic per reprimir la inflamació i la fibrosi en la ERC.

DIVULGACIÓ

ML és un empleat d'AstraZeneca, Göteborg, Suècia. La investigació de JP compta amb el suport d'AstraZeneca. Tots els altres autors no van declarar interessos en competència.

AGRAÏMENTS

Aquest estudi va comptar amb el suport de KM-H de la Diabetes Wellness Sverige i de JP de KI/AZ Integrated Metabolic Center, Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, Swedish Diabetes Foundation, Swedish Kidney Foundation i Center for Innovative Medicine.

APORTACIONS DE L'AUTOR

KM-H, ML i JP van dissenyar la investigació; KM-H, DD, EC, SZ i GG van realitzar la investigació; KM-H i XL van analitzar les dades; AW va proporcionar mostres humanes; i KM-H i JP van escriure el document.

Per què el receptor d'àcid retinoic Responder1 pot promoure el desenvolupament de malalties glomerulars?

MATERIAL COMPLEMENTARI

Fitxer suplementari (PDF)

Taula S1. En aquest estudi es van utilitzar parells de primers de gens objectiu per a RT-PCR en temps real.

Taula S2. En aquest estudi es van utilitzar anticossos. Fitxer suplementari (PowerPoint)

Figura S1. La sobreexpressió Rarres1 no activa la via de senyalització NF-kB no canònica. Document de Western blot representatiu i dades resumides que mostren que la sobreexpressió de Rarres1 no activa p100/p52 en podòcits tractats amb 10 ng/ml TGF-b1 (n=2). Les dades s'expressen com a mitjanes ± SD. Es va utilitzar la prova t de l'estudiant per a comparacions entre dos grups. UT, sense tractar.

Figura S2. Establiment de ratolins Rarres1 knockout específics per a podòcits (Creþ/Rarres1flfl/flfl). (A) Anàlisi de PCR convencional en fraccions tubulars i glomerulars, així com en teixit hepàtic. (B) Examen histològic (tinció de PAS) de la patologia renal en ratolins Cre–/Rarres1flfl/flfl i Creþ/Rarres1flfl/flfl. ( C ) Micrografies d'electrons de transmissió representatives (TEM) i quantificació del gruix mitjà de la membrana basal glomerular (GBM) i el nombre de ranures per mm GBM en diferents grups de ratolins (n ​​= 3). (D) Imatges microscòpiques confocals representatives que mostren l'expressió de marcadors específics de podòcits, sinaptopodina i nefrina, en ratolins Rarres1 (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i control (Cre–/Rarres1flfl/flfl) específics del podòcit. Barra=10 mm.

Figura S3. Els nivells d'expressió dels marcadors de podòcits i CD31 als ronyons de ratolins tractats amb NTS. (A) Imatges microscòpiques confocals representatives que mostren l'expressió de nefrina, WT-1 i sinaptopodina en podòcits de ratolins eliminadors específics de podòcits Rarres1 tractats amb NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i companys de control (Cre–/Rarres1/Rarres1). flfl). Barra=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Proporció de capil·lars CD31-positius a les zones peritubulars. Es van avaluar trenta àrees peritubulars per ratolí. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl, n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Prova t de l'estudiant. (C) Puntuació semicuantitativa del senyal CD31 als glomèruls: 0=cap senyal, 1=senyal feble, 2=senyal moderat, 3=senyal fort. Deu glomèruls avaluats de cada ratolí (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Prova t de l'estudiant.

Figura S4. Els nivells d'expressió dels marcadors de fibrosi, inflamació i lesions tubulars als ronyons de ratolins tractats amb NTS. (A) Imatges microscòpiques confocals representatives que mostren les expressions de -Sma al ronyó de ratolins eliminadors específics de podòcits Rarres1 tractats amb NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i companys de control (Cre–/Rarres1flfl/flfl). Barra=100 mm. (B) Nivells relatius d'ARNm de diferents gens relacionats amb la inflamació, la fibrosi i les lesions tubulars renals a l'escorça renal de ratolins tractats amb NTS. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" versus="" control="" (ctrl.);="" les="" dades="" s'expressen="" com="" a="" mitjanes="" ±="" sem.="" la="" prova="" t="" de="" student="" es="" va="" utilitzar="" per="" a="" comparacions="" entre="" 2="" grups="" (sham="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl,="" n="3">

Figura S5. L'expressió de C31 i P65 activat en ronyons tractats amb NTS. (A) La proporció de capil·lars CD31-positius a les zones peritubulars. Es van avaluar trenta àrees peritubulars per ratolí (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Prova t de l'estudiant. (B) Puntuació semicuantitativa del senyal CD31 als glomèruls: 0=cap senyal, 1=senyal feble, 2=senyal moderat, 3 =senyal fort. Es van avaluar deu glomèruls de cada ratolí (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Prova t de l'estudiant. (C) Documents representatius de Western blot i dades resumides que mostren els nivells relatius de proteïna de pP65 a l'escorça renal en diferents grups de ratolins tractats amb NTS i controls no tractats (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Tie{2_KI, n=10). Les dades s'expressen com a mitjanes ± SEM. Es va utilitzar la prova t de l'estudiant per a comparacions entre 2 grups.

REFERÈNCIES

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Mecanismes moleculars de la malaltia renal diabètica. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. Nefropatia IgA. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Comprensió de la biologia dels podòcits per desenvolupar noves terapèutiques renals. Front Endocrinol (Lausana). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. Definició de l'especificitat del tipus cel·lular a nivell transcripcional en la malaltia humana. Res del genoma 2013;23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S, et al. Identificació impulsada pel transcriptoma de teixits del factor de creixement epidèrmic com a biomarcador de malaltia renal crònica. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. Anàlisi del transcriptoma de la malaltia renal diabètica humana. Diabetis. 2011;60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K, et al. NFkappaB promou la inflamació, la coagulació i la fibrosi en el glomèrul de l'envelliment. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587–597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. La periostina induïda per NFkappaB activa la senyalització de la integrina-beta3 per promoure la lesió renal a la GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transforming growth factor-beta1 and diabetic nefropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Activació del factor nuclear-kappa B per podòcits en la fase autòloga de la nefritis de Heymann passiva. Ronyó Int. 2001;59:923–931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. El factor de transcripció per a NFkappaB inhibeix les expressions de citocines i molècules d'adhesió a les cèl·lules sinovials derivades de l'artritis reumatoide. Reumatologia (Oxford). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X, et al. GPRC5b modula la resposta inflamatòriamalalties glomerularsmitjançant la via NF-kappaB. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C, et al. El bloqueig endotelial de NF-kappaB deroga la GN induïda per ANCA. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3191–3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. Expressió glomerular in situ de NF-kappaB activat en la nefritis lúpica humana i una altra glomerulopatia proteinúrica no proliferativa. Arc de Virchows. 2006;448:172–183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Identificació a gran escala de gens implicats en el desenvolupament i la funció del glomèrul renal. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. Una línia cel·lular de podòcits humans immortalitzada condicionalment que demostra l'expressió de nefrina i podocina. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Baixa pressió arterial en ratolins knockout d'endotelina 1 específica de cèl·lules endotelials. Hipertensió. 2010;56:121–128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Malaltia anti-membrana basal glomerular. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. FK506 redueix l'albuminúria mitjançant la millora de l'expressió de la nefrina i la podocina dels podòcits en rates diabétiques. Inflflamm Res. 2016;65:103–114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T, et al. TIG1 promou el desenvolupament i la progressió del càncer de mama inflamatori mitjançant l'activació de la cinasa Axl. Càncer Res. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. R428, un inhibidor selectiu de molècules petites de la cinasa Axl, bloqueja la propagació del tumor i allarga la supervivència en models de càncer de mama metastàtic. Càncer Res. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. Inhibidors AXL en càncer: una perspectiva de química medicinal. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Glomerulonefritis membranosa experimental en rates. Estudis quantitatius de la formació de dipòsits immunitaris glomerulars en glomèruls aïllats i animals sencers. J Clin Invest. 1980;66:71–81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. L'anàlisi de xarxes transcripcionals entre espècies defineix respostes inflamatòries compartides en la nefritis lúpica murina i humana. J Immunol. 2012;189:988–1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J, et al. Vies metabòliques i immunometabolisme en malalties renals rares. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V, et al. El perfil transcriptòmic i proteòmic proporciona informació sobre la funció de les cèl·lules mesangials en la nefropatia IgA. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Selecció eficient per a transfectants d'alta expressió amb un nou vector eucariota. Gen. 1991;108:193–199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Transició epitelial-mesenquimal en la nefropatia diabètica: realitat o ficció? Cèl · lules. 2015;4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A, et al. Gen 1 induït pel tazarotè (TIG1), una novel·laàcid retinoicgen sensible al receptor a la pell. J Invest Dermatol. 1996;106:269–274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C, et al. Expressió del gen 1 (TIG1) induïda per tazarotè en carcinomes de pròstata i la seva relació amb la tumorigenicitat. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482–490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN, et al. Identificació de RARRES1 com a regulador bàsic de la fibrosi hepàtica. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H, et al. RARRES1 soluble indueix l'apoptosi dels podòcits per promouremalaltia glomerularprogressió. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. La inhibició dirigida de la tirosina cinasa del receptor Axl millora la nefritis semblant al lupus induïda per anti-GBM. J Autoimmune. 2018;93:37–44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X, et al. La contribució del llinatge Tie2þ a les cèl·lules hematopoètiques primitives i definitives. Gènesi. 2010;48:563–567