Resum

Introducció: El pròpolis és una substància natural resinosa recollida per les abelles dels brots i exsudats de diversos arbres i plantes; és àmpliament acceptat que la composició del pròpolis depèn de les característiques fitogeogràfiques del lloc de recollida.

El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una forta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures DPPH i pot eliminar espècies reactives d'oxigen, prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures i també té un bon efecte reparador sobre el dany dels anions dels radicals lliures de timina.

Feu clic a Suplement de Cistanche Tubulosa

【Per a més informació: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Objectius: Aquest estudi pretenia determinar la composició fitoquímica dels extractes etanòlics de vuit lots de pròpolis recollits a diferents regions de Benín (nord, centre i sud) i Congo, Àfrica.

Material i mètodes:La caracterització de les mostres de pròpolis es va realitzar mitjançant l'ús de diferents mètodes cromatogràfics amb guionets combinats amb la dereplicació de ressonància magnètica nuclear de carboni-13 (13C RMN) amb el programari MixONat. A continuació, es va avaluar l'activitat del producte final antioxidant o antiglicació avançada (anti-AGE) mitjançant assajos de difenilpicrilhidrazil i d'albúmina sèrica bovina, respectivament.

Resultats: Les anàlisis cromatogràfiques combinades amb la dereplicació de 13C RMN van mostrar que dues mostres del centre de Benín presentaven, a més d'una gran quantitat de triterpens pentacíclics, estilbenoides metoxilats o fenantrens, responsables de l'activitat antioxidant de l'extracte del primer. Entre ells, la combretastatina podria ser citotòxica. Per al segon, les flavanones prenilades conegudes al pròpolis de tipus Macaranga van ser responsables de la seva important activitat anti-AGE. La mostra del Congo estava formada per molts derivats de triterpès pertanyents a l'espècie Mangifera indica.

Conclusió: Per tant, el pròpolis del centre de Benín sembla tenir un interès especial, per les seves propietats antioxidants i anti-AGE. No obstant això, com que l'estandardització del pròpolis és difícil a les zones tropicals a causa de la seva gran diversitat quimiològica, és necessària una anàlisi fitoquímica sistemàtica abans de promoure l'ús del pròpolis en aliments i productes sanitaris a l'Àfrica.

PARAULES CLAU

Desreplicació de 13C RMN, estilbenoides o fenantrens metoxilats, triterpens pentacíclics, flavanones prenilades, pròpolis

1. INTRODUCCIÓ

El pròpolis és una substància resinosa natural recollida per les abelles dels brots i exsudats de diversos arbres i plantes, barrejada amb cera d'abelles i enzims salivals.1 Les abelles l'utilitzen per protegir l'entrada d'intrusos, taponar forats, llisar les parets internes, momificar animals morts. (petits insectes) a l'interior del rusc i equilibren condicions d'humitat extrema o sequera.2,3 El pròpolis s'ha utilitzat àmpliament en la medicina popular des de l'antiguitat a causa de la seva àmplia gamma de propietats terapèutiques.4 El pròpolis es compon generalment de resina (50 per cent) , cera (30 per cent ), olis (10 per cent ), pol·len (5 per cent ) i compostos fenòlics addicionals com els flavonoides.5,6 Se sap que la composició química del pròpolis és complexa i varia segons les espècies vegetals que creixen al voltant del rusc. , de la qual les abelles recullen exsudats.7 S'accepta que diversos factors, com ara la composició florística de la zona, el lloc i el moment de la recollida, l'estació, el tipus de col·lector, la disponibilitat i altitud, i l'activitat alimentària desenvolupada durant l'explotació del pròpolis té un impacte en la composició química del pròpolis.8,9 Hi ha diferents tipus de pròpolis, segons l'àrea geogràfica de producció, la font botànica i la composició química. Els tipus més comuns de pròpolis són temperats, bedolls, tropicals, mediterranis i del Pacífic.10 El pròpolis de zones climàtiques temperades, com Europa, Amèrica del Nord o regions no tropicals d'Àsia, prové principalment d'exsudats de gemmes de l'espècie Populus ( Salicaceae) i per tant és rica en flavonoides i àcids fenòlics i els seus èsters; tanmateix, el pròpolis tropical, originari de regions on no creix ni àlber ni bedoll, és ric en derivats prenilats d'àcids p-cumàrics, benzofenones o terpenoides.11 El pròpolis del Pacífic, típicament ric en flavanones prenilades, és un altre tipus important de pròpolis que es troba a Taiwan. , Japó i les Illes Salomó, i el pròpolis de bedoll es troba específicament a Rússia.12 L'estudi del pròpolis de l'Àsia tropical ha portat al descobriment de Macaranga denarius L. i Mangifera indica L. com a fonts vegetals de pròpolis d'Indonèsia.13 d'altra banda, les espècies de coníferes de la família de les Cupressaceae són la principal font botànica de pròpolis a les regions mediterrànies.14 Les anàlisis químiques van revelar que el pròpolis conté més de 300 productes naturals (NP) diferents, inclosos els derivats de l'àcid fenòlic, cumarines, flavonoides, sesquiterpens, diterpens, etc. triterpens, esteroides, lignans o benzofenones prenilades.15 Els efectes biològics del pròpolis s'han descrit principalment no només sobre el seu antioxidant,16–18 anti-AGE (és a dir, inhibició de la formació de productes finals de glicació avançada [AGE]),19 anti -inflamatoris,20 i efectes antitumorals,21–23, però també les seves activitats antibacterianes,24–26 antifúngiques,15 antivirals,27 i antiparasitàries28. També se sap que el pròpolis estimula la producció d'anticossos, cosa que suggereix el seu ús potencial com a adjuvant en vacunes.29 L'ús creixent d'aquesta substància natural de composició diversificada i, per tant, les diferents activitats biològiques en les indústries farmacèutica, cosmètica i alimentària estan generant un interès especial. en la recerca científica, sobretot a l'hora de definir la seva composició química. La majoria d'estudis s'han realitzat amb mostres d'Europa19,30–33 i d'Amèrica Llatina, més concretament del Brasil,20,23,34–36, mentre que pocs estudis es van fer a l'Àfrica37–41.

Així, aquest estudi pretenia caracteritzar els principals compostos de mostres de pròpolis recollides a diverses zones fitogeogràfiques de Benín i Congo (Àfrica) mitjançant la dereplicació de ressonància magnètica nuclear (RMN) 13C amb el programari MixONat.43,44 Un estudi preliminar utilitzant una base de dades (DB) que conté Els NPs que es van informar anteriorment del pròpolis juntament amb els seus canvis químics predits (δC) 13C no van donar cap dada utilitzable en comparació amb els resultats satisfactoris obtinguts habitualment amb extractes de plantes.43–45 Això es pot explicar per la composició química del pròpolis, que depèn molt. sobre la flora local, cosa que fa impossible construir un DB quimiotaxonòmic. Així, per desxifrar els principals compostos del pròpolis de Benin i Congo, en el present treball hem realitzat cromatografia líquida d'alt rendiment combinada amb espectrometria de masses de detecció de dispersió de llum ultraviolada i evaporativa (HPLC-UV-ELSD-MS) i cromatografia de gasos juntament amb espectrometria de masses ( GC-MS) analitza extractes de pròpolis brut per identificar les seves principals característiques estructurals i construir els corresponents DB de NPs adequats per al programari MixONat.46 Després, després d'un fraccionament gruixut de les mostres de pròpolis seleccionades segons el seu perfil químic, la dereplicació basada en 13C RMN va permetre la identificació dels principals NPs sense més purificació. També es van realitzar assajos d'antioxidants i anti-AGE.

2. PROCEDIMENTS EXPERIMENTALS

2.1 Substàncies químiques

1, 1-Difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), reactiu Folin-Ciocalteu, àcid fòrmic i àcid gàlic, tots de grau analític, es van comprar a Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, França). Àcid 6-hidroxi-2,- 5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílic (Trolox®) i 50 - àcid cafeoilquínic (àcid clorogènic) obtingut d'Acros Organics (Geel, Bèlgica).

2.2 Mostres de pròpolis

Es van recollir vuit mostres de pròpolis de Benin per raspat de ruscs en tres zones fitogeogràfiques (taula 1 i figura SI-1). Es va recollir una mostra de pròpolis congolès al bosc artificial d'acàcies de l'altiplà de Bateke, al centre de la República del Congo (taula 1).

2.3 Extracció de pròpolis

Els extractes etanòlics de pròpolis (EEP) es van preparar inicialment mitjançant el següent protocol d'extracció.19 El pròpolis cru es va polveritzar de manera homogènia en presència de nitrogen líquid. Per a totes les mostres, es va macerar 1 g de pròpolis en pols en 20 ml d'EtOH al 95%. Després d'agitar durant 2 h a temperatura ambient, la barreja es va filtrar mitjançant un filtre d'embut de disc de vidre sinteritzat (16-40 μm de mida de porus). El residu es va reextreure dues vegades seguint els mateixos passos. A continuació, els tres filtrats recollits es van mantenir a 18 C durant la nit, es van filtrar per eliminar les ceres i es van evaporar a pressió reduïda (40 C, 10 bar) per donar els EEP.

Es van extreure de nou quantitats de 8,0 g de pròpolis en pols de BC1 (1) i BC2 (2) o 10,3 g de CG (3) amb EtOH al 95 per cent (UAE, 4 80 ml, 15 min) per a més. cromatografia flash.

2.4 Determinació del contingut fenòlic total

El contingut fenòlic total es va determinar mitjançant el mètode colorimètric Folin-Ciocalteu tal com s'ha descrit anteriorment,19 i recentment adaptat per a l'ús directe en microplaques. Breument, 10 ul de cada extracte de pròpolis en MeOH (3,5 mg/ml per a BC1, 5 mg/ml per a BN2, BC2 i CG, 7,5 mg/ml per a BN1, BS1a, BS1b i BS2, i 10 mg/ml per a BS3) es va barrejar amb 20 ul d'aigua destil·lada i 10 ul de reactiu Folin-Ciocalteu en una microplaca de 96-pou. Després de 3 min, es van afegir 120 ul d'aigua destil·lada i 40 ul de carbonat de sodi aquós al 20 per cent. L'absorbància es va mesurar en un espectrofotòmetre de microplaques TECAN® (V6.5) a 760 nm després de 30 min a la foscor a temperatura ambient. Es va preparar un blanc de la mateixa manera utilitzant MeOH en comptes de la solució d'extracte i es va utilitzar àcid gàl·lic per calcular la corba de calibratge (0,04–0,328 mg/ml; y=2.7241x 0,0039; r2=0 .9982). Cada mostra es va analitzar per triplicat. El contingut fenòlic total es va expressar en termes d'equivalents d'àcid gàlic (mg) per gram d'extracte (mg GAE/g).

2.5 Anàlisis cromatogràfics preliminars

2.5.1 TLC analític

Es va realitzar una cromatografia analítica en capa fina (TLC) en un TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemanya), utilitzant una barreja de ciclohexà: AcOEt com a eluent. Les taques del cromatograma es van visualitzar primer sota llum UV (254 nm) i després ruixant amb reactiu vanillina-àcid sulfúric (2 ml d'àcid sulfúric concentrat en 98 ml d'una solució de vanillina 1:99 p/v: 95% d'etanol) i escalfant els cromatogrames a 110 graus C durant 5 min.

2.5.2 Procediment GC-MS

L'anàlisi GC-MS es va realitzar en mostres no derivatitzades mitjançant un cromatògraf de gasos Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, França) amb una tensió d'ionització de 70 eV (electrònica). Impacte). Les mostres es van preparar en diclorometà (DCM) a 2 mg/ml per als extractes i 1 mg/ml per a les fraccions. Les separacions es van realitzar mitjançant una columna Phenomenex ZB5 (30 m * 0,250 mm de diàmetre intern amb 0,25 mm de gruix de pel·lícula; Phenomenex, Le Pecq, França). La temperatura es va programar de la següent manera: 180 graus C (3 min), 180-280 graus C a una velocitat de 10 C/min i 280 graus C (27 min). L'heli es va utilitzar com a gas portador a un cabal de 2,0 ml/min. Les temperatures de l'injector i del detector es van establir a 250 graus C i 280 graus C, respectivament. Els metabòlits es van identificar comparant els seus temps de retenció (Rt), la massa nominal i/o els patrons de fragmentació amb els de les mostres autèntiques i/o els continguts a les biblioteques de patrons de fragmentació de l'equip (NIST11, NIST11s i FFNSC2).

2.5.3 Procediment HPLC-DAD-ELSD

Les anàlisis cromatogràfiques es van realitzar mitjançant un cromatògraf líquid 3D Shimadzu 2030C (Noisiel, França) equipat amb una matriu de díodes.detector (DAD) i un ELSD (Sedere®) amb una columna Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Alemanya ) protegit amb un cartutx de protecció Lichrocart® 4–4 (4 mm*4 mm id), amb un cabal d'1 ml/min. La fase mòbil constava d'un 0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua (solvent A) i metanol (solvent B), i la separació es va realitzar mitjançant el següent gradient lineal: 25-100 per cent B (0-40 min), 100 per cent (40-45). min). Els espectres UV-vis es van registrar en el rang de 190-600 nm i es van adquirir cromatogrames a 254 i 280 nm. ELSD es va escalfar a 30grauC, i es va aplicar un guany de 4 al senyal. Les mostres es van preparar a una concentració de 10 mg/ml en MeOH i es van centrifugar a 13, 000 g durant 10 min abans de la injecció (10 ul) per eliminar restes de materials en suspensió.

2.5.4 Procediment HPLC-UV-MS

Les anàlisis HPLC-UV-MS es van realitzar mitjançant un mòdul de separació 2795 Waters (Guyancourt, França) equipat amb un detector Dual λ 2487 Waters. La columna, les fases mòbils i el gradient eren els mateixos que es descriuen anteriorment per a HPLC-DAD-ELSD. Els cromatogrames es van adquirir a 254 i 280 nm. Les anàlisis de masses es van dur a terme en un Bruker (Bremen, Alemanya) electrospray ionització/ionització química a pressió atmosfèrica (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 més en els modes positius i negatius de la següent manera: gas de col·lisió, He; amplitud d'energia de col·lisió, 1,3 V; nebulitzador i gas d'assecat, N2, 7 L/min; la pressió del gas del nebulitzador, 30 psi; temperatura seca, 340 C; cabal, 1,0 ml/min; proporció de divisió del dissolvent, 1:9; rang d'exploració, m/z 100–1,000. Les mostres es van preparar a una concentració de 10 mg/ml en MeOH, es van centrifugar a 13.000 g durant 10 min i es van filtrar a través d'un filtre de xeringa de membrana de politetrafluoroetilè (PTFE) de 0,45-μm abans de la injecció (20 ul) per eliminar les restes. de materials en suspensió.

2.6 Fraccionament d'EEP per cromatografia flash

Primer, 3,8 g de BC1 (1), 3,5 g de BC2 (2) o 4,0 g de CG (3) EEPs es van dissoldre en un volum mínim de DCM i acetona i es van barrejar amb gel de sílice (sílice). proporció gel: extracte, 2:1). Per a tots ells, es va deixar evaporar el dissolvent fins a obtenir una pols fina i seca. A continuació, per a cada EEP, es va realitzar el fraccionament mitjançant un aparell CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, EUA) amb una columna de gel de sílice (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, França) a un cabal de 25 ml/min amb ciclohexà (solvent A) i acetat d'etil (EtOAc) (solvent B) utilitzant la següent elució en gradient: (1) per a BC1 EEP, 5 per cent B (0-10 min), 5-20 per cent B (10-30 min), 20-30 per cent B (30-60 min), 30-50 per cent B (60-85 min) i 50-100 per cent B (85–110 min); Es van recollir 160 tubs de 20 ml i es van combinar en 14 fraccions (BC1_F1 a BC{1_F14) sobre la base dels seus perfils cromatogràfics TLC (proporció ciclohexà:EtOAc, 90:10 a 50:50). ); (2) per a BC2 EEP, 5 per cent de B (0-10 min), 5-10 per cent de B (10-20 min), 10-30 per cent de B (20-40 min), 30-40 per cent de B (40-55 min). min), i 40-100 per cent de B (55-70 min); Es van recollir 100 tubs de 20 ml i es van combinar en 8 fraccions (BC2_F1 a BC{2_F8) sobre la base dels seus perfils cromatogràfics TLC (proporció ciclohexà:EtOAc, 90:10 a 60:40). ); (3) per a CG EEP, 5 per cent de B (0-10 min), 5-10 per cent de B (10-30 min), 10-20 per cent de B (30-50 min), 20-40 per cent de B (50-70 min). min), 40-60 per cent de B (70-80 min) i 60-100 per cent de B (80-90 min); Es van recollir 135 tubs de 20 ml i es van combinar en 23 fraccions (CG_F1 a CG{_F23) sobre la base dels seus perfils cromatogràfics TLC (proporció ciclohexà:EtOAc, 80:20 a 60:40). ).

Es va realitzar un pas addicional de fraccionament a la fracció BC{{0}}F7: es van dissoldre 200 mg en un volum mínim de MeOH i es van barrejar amb gel de sílice C{18-(sílice C{18- proporció gel: extracte, 2:1). La separació es va realitzar en una columna C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, França) a un cabal de 15 ml/min amb aigua (solvent A) i MeOH (solvent B) utilitzant la següent elució en gradient: 50– 70 per cent de B (0-30 min) i 70-100 per cent de B (30-40 min); Es van recollir 80 tubs de 8 ml i es van combinar en 5 fraccions (BC2_F{7-1 a BC2_F{7-5) en funció dels seus perfils HPLC-UV (280 nm) .

2. 7 1 Anàlisis de RMN H i 13C

Els espectres de RMN (1D i 2D) de fraccions de pròpolis (7–58 mg) o de vegades NP es van registrar en cloroform deuterat (CDCl3) o metanol deuterat (CD3OD) (500 ul) en un espectròmetre RMN JEOL a 400 MHz durant 1 H i 100 MHz per a 13C. Es van realitzar experiments de RMN (1H RMN, 13C RMN, DEPT-135, DEPT-90 i 2D RMN) sobre fraccions i NP purs a 298 K en un espectròmetre H JEOL de 400 MHz (JEOL Europe, Croissy). -sur-Seine, França) equipat amb una sonda inversa de 5-mm (ROYAL RO5). Els desplaçaments químics (δH i δC) s'expressen en ppm i els valors de J en Hz.

Per als espectres de RMN 13C (100 MHz), es va utilitzar una seqüència de desacoblament WALTZ-16 amb un temps d'adquisició d'1,04 s (32.768 punts de dades complexos) i un retard de relaxació de 2 s. Entre 1.500 i 11, es van recollir000 exploracions per obtenir una relació S/N satisfactòria. Es va aplicar un filtre d'ampliació de línia exponencial d'1 Hz a cada decadència per inducció lliure (FID) abans de la transformació de Fourier. Els espectres es van classificar manualment i es van corregir a la línia de base mitjançant el programari MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Espanya) i es van fer referència a la ressonància central del dissolvent deuterat a δC 77,16 ppm (CDCl3) i δC 49,00 ppm (CD3OD). Per a la millora sense distorsió mitjançant experiments de transferència de polarització (DEPT), es van requerir entre 512 i 5.500 exploracions i es van fer alineacions amb els espectres 13C mitjançant un determinat δC. A continuació, es va utilitzar un llindar d'intensitat mínima per recollir manualment senyals positius de 13C RMN i DEPT-90 i senyals DEPT-135 positius i negatius alhora que s'evitaven possibles artefactes de soroll.

El pròpolis DB1 es va construir per primera vegada cercant els compostos descrits al pròpolis a SciFindern 47 , donant com a resultat un DB de 1.471 NP; Els valors de δC es van predir mitjançant predictors de RMN de desenvolupament químic avançat (ACD) (C, H). A partir d'aquests DB que contenien NPs juntament amb els seus valors δC-SDF, la rutina CTypeGen inclosa a MixONat va crear una DB adequada: va llegir el fitxer de dades espacials (SDF) i va ordenar els desplaçaments químics per tipus de carboni. Aleshores es va crear l'SDF de tipus c necessari, és a dir, Pròpolis de tipus c DB1.43,44

Stilbenoids_Phenantrenoides DB2 es va crear. Una cerca de substàncies utilitzant les paraules clau estilbenoides i fenantrens al LOTUS DB que conté 276.518 NPs48 (LOTUS, 2022) va permetre obtenir un Stilbenoids_Phenantrenoids DB2 de 2.681 NPs com a SDF. Aleshores es va crear Flavanones DB3: una cerca a SciFindern47 utilitzant la subestructura 2-fenilcroman-4-permet seleccionar 56.679 molècules. Es van reduir encara més a 2.893 referits a "Ocurrència de productes naturals" mitjançant una anàlisi de les substàncies amb el filtre "Papel de referència" proposat per SciFindern. Després d'un refinament addicional mitjançant un pas de filtrat basat en el pes molecular esperat (MW) (és a dir, de 340 a 424 Da), totes les flavanones rellevants es van exportar posteriorment com a SDF per obtenir els NP de Flavanones DB3 (684 NP). Per a cada NP de DB2 i DB3, es van predir els valors de δC-SDF mitjançant el programari de predictors de RMN ACD (C, H), així com la metodologia descrita anteriorment per Nuzillard46 per obtenir directament el SDF de tipus c llest per al seu ús per MixONat. Aquest últim conté per a cada compost de la DB els valors de δC previstos organitzats com a carbonis metil, metilè, metina o quaternaris.

Triterpenes DB4 es va crear a partir del PNMRNP3 DB49,50 importat com a SDF al programari de predictors de RMN ACD (C, H) cercant triterpens amb un MW entre 100 i 500 Da (és a dir, Dades de cerca: triterpens; Cerca MW: 100 a 500) per obtenir directament una base de dades de 6.623 triterpens en el format de fitxer de tipus c requerit.

Alk(en)il resorcinol i derivats de fenol DB5 es van construir a partir del PNMRNP3 DB49,50 importat com a SDF al programari de predictors de RMN ACD (C, H) cercant NP amb una bastida de fenol m-alk(en)il i classificat com a fenols (és a dir, 3-(hexadec-8-en{-1-yl)phenol Cerca de subestructura; Cerca classe Classyfire: fenol) per obtenir directament una base de dades de 44 NPs en el format de fitxer de tipus c necessari.

2.8 13Desreplicació basada en RMN C mitjançant el programari MixONat

La llista de pics i les dades d'intensitat obtingudes de cada espectre experimental (13C RMN, DEPT-135 i DEPT-90) es van exportar com a . csv utilitzant el programari Microsoft Excel (Microsoft 16.45) i utilitzat com a fitxer d'entrada al programari MixONat. Aquests fitxers consisteixen en una llista de valors δC ordenats en ordre decreixent associats a les seves intensitats a la mateixa línia, separats per una coma.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Després, es van comparar les dades experimentals dels NP amb les millors puntuacions amb la literatura.

2.9 Purificació

2.9.1 HPLC preparativa

La purificació de les fraccions BC{{0}}F6 i BC1_F8 (4{0 mg en 2 ml de MeOH) es va dur a terme mitjançant un preparatiu Shimadzu LC{-20AP cromatògraf líquid equipat amb un detector UV-vis SPD-40 (Noisiel, França), un bucle d'injecció de 2 ml i un col·lector de fraccions FRC-10A, utilitzant una columna preparativa C18 (25{{39} }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, França) a un cabal de 21,24 ml/min. La fase mòbil constava d'un 0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua (solvent A) i metanol (solvent B) i la separació es va realitzar mitjançant el gradient següent: (1) per a BC1_F6, 40 per cent de B (0–5 min), 40-70 per cent de B (5-20 min) i 70-90 per cent (20-30 min); (2) per a BC1_F8, 40-70 per cent de B (0-15 min) i 70-90 per cent (15-25 min). Els cromatogrames es van adquirir a 254 i 280 nm.

2.9.2 Extracció en fase sòlida (SPE)

Per obtenir la fracció més polar de BC2-EPP (200 mg en 5 ml de MeOH barrejat amb 350 mg de gel de sílice C{18- després de l'evaporació), la purificació es va dur a terme mitjançant una columna d'extracció en fase sòlida C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, França) amb aigua: MeOH 7:3 (10 ml) i aigua: MeOH 6:4 (10 ml). Els tubs 4-10 es van combinar per formar la fracció polar de BC2 (BC2_SPE) en funció dels seus perfils HPLC-UV (330 nm).

2.10 Assajos d'antioxidants i anti-AGE

2.10.1 Eliminació de radicals DPPH

L'avaluació d'eliminació de radicals DPPH dels EEP de Benin es va realitzar tal com es va descriure anteriorment.51 Breument, les mostres provades es van diluir en EtOH absolut a 0.02 mg/ml a partir de solucions stock a 1 mg/ml en dimetilsulfòxid. (DMSO). Es van col·locar alíquotes (100 ul) d'aquestes solucions diluïdes en plaques de 96-pous per triplicat. Es van afegir aproximadament 25 ul de solució de DPPH acabada de preparar (1 mM) a 75 ul d'EtOH absolut mitjançant l'injector del lector de microplaques (Infinite® 200, Tecan, França) per obtenir un volum final de 200 ul per pou. Després de 30 minuts a la foscor a temperatura ambient, es va determinar l'absorbància a 517 nm. Es va utilitzar EtOH com a blanc, mentre que es van utilitzar solucions de 10, 25, 50 i 75 μM de Trolox (un anàleg hidrofílic de tocoferol) per a la corba de calibratge. Es va utilitzar una mostra de solució etanòlica d'àcid clorogènic (0,02 mg/ml) com a estàndard de control de qualitat. Els resultats es van expressar com a equivalents de Trolox (micromols de TE per g d'extracte).

2.10.2 Assaig anti-AGE

Els efectes dels extractes de pròpolis i dels cinc derivats principals de naringenina aïllats sobre la formació d'AGE es van determinar tal com es va descriure anteriorment.51 Breument, es va incubar l'albúmina sèrica bovina (BSA) (10 mg/ml) amb D-ribosa ({{ 13}},5 M) juntament amb el compost provat (3 μM a 3 mM) o extracte (1 ug a 1 mg) en tampó de fosfat 50 mM a pH 7,4 (NaN3, 0,02 per cent). Les solucions es van incubar en plaques de microtitulació de 96-pous a 37 graus C durant 24 h en un sistema tancat abans de la mesura de la fluorescència AGE. La fluorescència de la mostra incubada en condicions idèntiques sense D-ribosa es va restar per a cada mesura. Semblant a pentosidina (excitació a 335 nm, emissió a 385 nm) La fluorescència de l'AGE es va mesurar per fluorometria.52 Els valors IC50 es van definir com la quantitat d'extracte (ug/ml) o control positiu (μM) necessària per reduir la formació d'AGE en un 50 per cent. respecte al control negatiu. Segons l'assaig de validació estadística,53 una única anàlisi és suficient per a una determinació precisa de l'IC50.

3. RESULTATS I DISCUSSIÓ

3.1 Perfil cromatogràfic

El perfil LC general dels vuit EPP de Benin i el Congo mitjançant el detector ELSD quasi universal va mostrar que totes les mostres contenien compostos no polars, eluïts al final dels cromatogrames (figura 1). BC1 també va presentar una gran quantitat de compostos més polars, i BC2 va mostrar alguns compostos polars mitjans en quantitats més petites. Els compostos no polars en CG EEP semblaven ser força diferents dels beninesos.

Així, el perfil ELSD va donar lloc a tres mostres diferents i originals la composició de les quals es va investigar més a fons: BC1, BC2 i CG.

En primer lloc, es van realitzar anàlisis GC-MS, comparant la fragmentació MS amb la DB NIST, per caracteritzar les classes químiques i, quan sigui possible, identificar els constituents. La identificació putativa (basada en el percentatge de la coincidència amb la base de dades NIST) i les classes químiques de compostos es presenten a la taula 2 (les dades de perfils de corrent iònic total [TIC] GC es mostren a la figura SI -2).

Tots els EEP beninesos presentaven els mateixos perfils de compostos no polars, etiquetats com a lletres A a F, però les seves quantitats podrien variar. Es van identificar putativament com a - o -amrinona (A), -amirina (B), lupenona (C), -amirina (D), - o -amirina acetat (E) i acetat de lupeol (F) (cf. Figura SI). -3), ja descrit com a principals NP al pròpolis mexicà.54 Zhang et al. (2014) i Tamfu et al. (2020) també van descriure els triterpenoides com a acetats d'amirina/lupeol i d'amirina/lupeol en diverses mostres de pròpolis africanes.41,55 Només BC1 va presentar NPs addicionals eluïdes entre Rt 10 i 15 min suggerides com estilbenoides o fenantrens metoxilats segons els seus patrons de fragmentació. L'EEP congolesa va mostrar un perfil diferent dels beninesos, amb èsters etílics àcids C16 i C18 com a compostos més volàtils associats amb una bona puntuació de concordança del 94 per cent, un derivat del fenol a Rt 13,1 min, tres derivats de resorcinol en el rang de 14-14. 17 min, i diferents tipus de derivats de triterpès després de Rt 21 min.

A més, es van analitzar els EPP per HPLC-DAD-MS per visualitzar NP no volàtils (vegeu la figura SI-4). Els diferents perfils van mostrar que BC1 EEP mostrava una gran quantitat de compostos polars mitjans amb cromòfors que absorbien a 280 nm, així com BC2 en proporcions més petites, i CG posseïa un perfil UV molt pobre a 280 nm.

3.2 Composició química de BC1 i BC2

Per identificar els seus principals NP mitjançant la dereplicació de 13C RMN basada en MixONat i DB adequats, es va aconseguir un fraccionament gruixut de BC1 i BC2 EEP mitjançant cromatografia flash. De fet, per a BC1, l'anàlisi GC-MS va revelar la presència d'estilbenoides o fenantrens metoxilats, que ens van guiar per construir els estilbenoides_fenantrenoides específics DB2. Per a BC2, excepte els compostos més polars a Rt 3,8 min, tots els compostos mostraven espectres UV de flavanones-dihidroflavonols, cosa que suggeria la creació de Flavanones DB3.

Tal com es mostra a la taula 3, els dihidrofenantrens 1 i 3-5, els fenantrens 2 i 6 i el dihidro estilben 7 (figura 2) es van suggerir a BC1 EEP per MixONat i es van validar per comparació amb dades de la literatura (vegeu informació de suport). Quan calia, es va utilitzar un filtre MW basat en dades HPLC-MS.

Més precisament, entre 9,10-derivats de dihidrofenantrè de 2.681 NP a DB2, MixONat va suggerir 6-metoxicoelonin (2,7-dihidroxi{-3,5-dimetoxi{ {10}},10-dihidrofenantrè; 3, rang 1, puntuació 0,75, figures SI-13 i SI{-14) a BC{{ 18}}F5 i la seva presència es va confirmar en comparació amb les dades de RMN publicades. Encara s'ha identificat a partir d'espècies de Combretaceae56 i a l'orquídia Bulbophyllum vaginatum; 57 i 2,7-dihidroxi-3,4,6-trimetoxi{- 9,10-dihidrofenantrè (4, rang 1, puntuació 0,88, xifres SI{{33} }} i SI-16) es va plantejar la hipòtesi a BC1_F2. El compost 4 ja s'ha descrit al pròpolis senegalès58 i la seva presència es va validar a partir de les dades informades per Pettit et al. de l'arbre africà Combretum caffrum59 i de Lu et al. de Dioscorea nipponica Makino.60

El procés de dereplicació basat en RMN 13C també va predir 2,6-dihidroxi-3,4,7-trimetoxi{-9,10-dihidrofenantrè (5, rang 8, puntuació 0.76, figures SI-15 i SI{-16) a BC1_F2 i 2,6,7-trihidroxi{{20 }},4-dimetoxi-9,10-dihidrofenantrè (1, rang 2, puntuació 0,5, figures SI-5 i SI-6 ) a BC{{30}}F{6-1 quan es va utilitzar un filtre molecular a MW 288 Da. Per a 1, la puntuació va ser força baixa (0,5); per tant, es van fer experiments addicionals de RMN 2D (correlacions quàntiques múltiples heteronuclears [HMQC], connectivitat d'enllaços múltiples heteronuclears [HMBC], espectroscòpia d'efecte Overhauser nuclear [NOESY], vegeu les figures SI-7–SI-10). realitzat per confirmar l'estructura; per a 5, la puntuació era de 0,76, és a dir, superior a 0,70. Aquests dos NP (1 i 5) van ser esmentats per primera vegada per Letcher et al. en espècies de Combretum61,62 i 1 ja s'ha trobat al pròpolis senegalès.58

Entre els derivats del fenantrè, MixONat va plantejar la hipòtesi de 2,6,7-trihidroxi-3,4-dimetoxifenantrè (2, rang 1, puntuació 0,88, xifres SI-11 i SI{{10}}) a BC1_F{8-1, que es va confirmar en comparació amb les seves dades espectrals descrites per Letcher et al. en Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihidroxi-3,4,6-trimetoxifenantrè (6, rang 5, puntuació 0,94, figures SI-17 i SI-18) aïllat anteriorment de Photolida Chinensis63 es va suggerir a BC1_F4.

La combretastatina B{{0}} (7), un dihidro estilbè, va ser suggerida per MixONat en primer lloc (puntuació 1,0, figures SI-17 i SI{-19) a BC1 EPP quan s'utilitza un filtre MW (MW 304 Da) i validat per comparació amb les dades de RMN descrites per Pettit et al. en Combretum caffrum. 59

Els compostos 2, 6 i 7 ja s'han identificat al pròpolis senegalès.58

Les dades de RMN 1 H i 13C d'1-7 estan disponibles a la informació de suport.

Per a BC2, es van identificar set compostos pertanyents a dues classes estructurals de polifenols, derivats de cromona-C-glucòsid i prenilflavanona (8-14), alguns dels quals es van descriure per primera vegada en pròpolis (figura 3).

El procés basat en RMN 13C que utilitza MixONat i DB1 a DB5 no va donar resultats rellevants que suggereixin NPs originals. Dos productes principals (8-9) es van caracteritzar completament com una barreja utilitzant espectres de masses i dades de RMN 1D i 2D (1 H, 13C, HMQC, HMBC, vegeu la figura SI-20–SI-23) i identificats com a florí (8) i isobiflorina (9), dos cromanona-Cglucòsids descrits recentment en pròpolis, descrits anteriorment a Pancratium biflorum64 i clau d'olor d'Eugenia caryophyllata, respectivament.65

Pel que fa als derivats de flavanona, entre 688 NP a DB3, MixONat va proposar 6-prenilnaringenina (10, rang 1, puntuació 0,95, figures SI- 24 i SI{{8 }}) ja es descriu al pròpolis vermell nigerià66 a BC{{10}}F7-1. 6,8-Diprenilaromadendrina (12, rang 1, puntuació 1.0, figures SI{-28 i SI{-29) i 6,8-diprenilnaringenina (lonchocarpol A ) (13, rang 10, puntuació 0,84, figures SI-30 i SI{-31), trobats anteriorment a mostres de pròpolis del Camerun,42 es van validar a BC2_F{ {30}} i BC2_F5, respectivament. 6-Geranylnaringenin (14, rang 1, puntuació 0,84, xifres SI-32 i SI{-33), descrit anteriorment en pròpolis de les Illes Salomó,67 es va plantejar i confirmar a BC{{41} }}F7-5. Finalment, MixONat va suggerir 6-dimetilalil naringenina (11) en segona posició a BC2_F6 (rang 2, puntuació 0,65, figures SI-26 i SI- 27). L'isòmer de la posició 8 es va proposar en la primera posició, però una comparació amb les dades de la literatura 68,69 va mostrar que es tracta de l'isòmer de la posició 6. El compost 11 era nou al pròpolis però ja es descriu en extractes orgànics de Monotes africanus. 70 1 Les dades de RMN H i 13C de 8-14 estan disponibles a la informació de suport.

【Per a més informació: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】