Efecte apoptòtic dels polisacàrids de Cistanche sobre la leucèmia

Autor:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Mongòlia Interior, Xina

Investigar l'efecte apoptòtic dePolisacàrids de Cistanche( CDP) sobre humàleucèmia agudalínia cel·lular cèl·lules Jurkat.MètodesEs va aplicar l'assaig MTT per detectar l'efecte del CDP sobre la proliferació cel·lular, El Western blotting es va utilitzar per detectar l'activació de la caspasa-9 i la caspasa-3, i també es van provar les molècules senyal apoptòtiques.Ｒ resultatsLa proliferació de cèl·lules T es va inhibir amb 1 mg / ml i 2 mg / ml CDP, L'apoptosi de les cèl·lules T va ser induïda per 5 mg / ml de CDP, iles expressions de pro-caspasa-9 i pro-caspasa-3 es van reduir significativament. Les expressions dels receptors de la superfície cel·lular CD45 i CD71 es van inhibir significativament per 5 mg / ml de CDP, Es va induir la fosforilació EＲK, i la fosforilació de JNK es va inhibir.

Conclusions

【Paraules clau】Polisacàrids de Cistanche; apoptosi; Ｒeceptor; caspasa-9; caspasa-3

La leucèmia limfoblàstica aguda (LLA) és una malaltia clonal maligna del sistema limfàtic amb un alt grau d'heterogeneïtat immunofenotípica. , fàcil de recaure, etc. Actualment, els mètodes de tractament més utilitzats inclouen el trasplantament de medul·la òssia, la teràpia d'inducció, la immunoteràpia, la quimioteràpia combinada, etc. A causa de la capacitat limitada de la majoria de fàrmacs de quimioteràpia per atacar i matar tumors, poden causar danys greus al sistema digestiu, al sistema sanguini, cardiovascular i cerebrovascular, etc. Durant el tractament, sovint s'acompanya de reaccions adverses importants, algunes de les quals fins i tot són mortals. A mesura que avança la quimioteràpia, el cos tendeix a desenvolupar tolerància als fàrmacs de quimioteràpia, augmentant el risc de recurrència de la malaltia.

Per tant, la recerca d'una teràpia de leucèmia o adjuvant altament eficaç, de baixa toxicitat i altament dirigida s'ha convertit en el focus d'atenció actual.Cistanches'anomena Chagangaoya en mongol. Pertany a la família Ledangaceae i al gènere Cistanche. És paràsit de les arrels dels arbres del desert i té la reputació de "ginseng del desert".

Els principals ingredients actius de Cistanche inclouen glicòsids feniletanoides, lignans, betaïnes, esterols, aminoàcids i polisacàrids. Antiinflamatori, antiviral, antioxidant, regulació immune i altres efectes.

Els estudis ho han trobatpolisacàrid de Cistanche (CDP),com un dels seus principals components actius,té efectes antitumorals i immunomoduladors.Els investigadors van trobar que el CDP té un efecte mortal important sobre les cèl·lules de leucèmia K562 i THP-1, i van suggerir que el CDP té un cert paper en elprevenció o tractament de la leucèmia. A més, en el compost de la medicina tradicional xinesa, cistanche, per al tractament dels agutsleucèmia, Cistanchetambé juga un paper com un dels components importants. No obstant això, el mecanisme d'acció específic deCistancheno es coneix. En aquest article, l'aïllament i la purificació deCistanche CDPes van estudiar i es va investigar l'efecte mortal i el mecanisme relacionat del CDP a la línia cel·lular de leucèmia aguda humana Jurkat.

1.1 Principals reactius i instruments

La pols de Cistanche es va comprar a Sichuan WecistancheGroup Co, Ltd., la línia cel·lular de leucèmia aguda humana Jurkat es va comprar al banc de cèl·lules de l'Institut de Biologia Cel·lular de Xangai, el blau de tiazol (MTT) i el dodecil sulfat de sodi (SDS) es van comprar a Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., El sèrum boví fetal (FBS) es va comprar a Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., caspasa que contenia cisteïna-3, caspasa-9, CD71, CD45, cinasa aminoterminal fosforilada c-Jun (p. -JNK) i anticossos fosforilats de cinasa regulada per senyal extracel·lular (p-ERK) es van comprar a Cell Signaling Technology, EUA, i anticossos d'actina es van comprar a Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Electroquímic El substrat de luminescència (ECL) es va comprar a Thermo La companyia científica dels Estats Units i altres reactius eren de grau analític nacional. Estació de treball d'imatge intel·ligent Gel-View 6000 plus (producte de Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), microscopi de fluorescència invertit Revolve FL (producte d'Echo Laboratories, EUA), lector de microplaques EPOCH (producte de Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Separació i purificació de CDP Prendre 500 g deExtracte de Cistanche en pols, remullar-lo en etanol al 95 per cent durant la nit, filtrar-lo amb gasa, recollir el residu del filtre, bullir-lo amb aigua calenta a 60 graus durant 2 h/temps, un total de 3 vegades. Després del final, els filtrats es van combinar tres vegades, es van concentrar a pressió reduïda a 2/3 del volum original, es van afegir 3 vegades el volum d'etanol al 95 per cent i es van deixar reposar a 4 graus durant la nit. L'endemà, centrifugar a 4 000 r/min durant 10 min, recollir el precipitat, eliminar la proteïna pel mètode Sevag, precipitar amb etanol absolut, liofilitzar per obtenir CDP.

1.3 Cultiu cel·lular La línia cel·lular de leucèmia aguda humana es va emmagatzemar en nitrogen líquid al laboratori Jurkat. Quan es van utilitzar, les cèl·lules es van recuperar ràpidament en un bany d'aigua de 37 graus i es van cultivar en medi RPMI1640 (que conté 100 U/ml de penicil·lina i 100 U/ml d'estreptomicines) amb un 10% de FBS. Les cèl·lules es van cultivar en una incubadora de cèl·lules de 37 graus, 5 per cent de CO2, passat cada 2 o 3 dies, i els experiments es van dur a terme quan les cèl·lules entraven en la fase de creixement logarítmic.

1.4 Experiment MTT Es van prendre cèl·lules Jurkat en la fase de creixement logarítmic, es van centrifugar per obtenir el pellet cel·lular i es van comptar a 5 × 105 cèl·lules/ml. Agafeu una placa de cultiu cel·lular 96-pou, inoculeu 100 ul de cèl·lules a cada pou i, a continuació, afegiu-hi 100 ul de medi complet RP-MI1640 com a grup control; el grup experimental es va dividir en 3 grups, primer utilitzant el medi RPMI1640 per preparar diferents concentracions de CDP i després afegint 100 ul de medi RP-MI1640 a cada pou. Es van utilitzar cèl·lules ul Jurkat i 100 ul de solució de CDP per fer la concentració final de CDP a 1, 2 i 5 mg/ml, respectivament. Cada grup es va configurar amb 5 pous duplicats i es va incubar en una incubadora cel·lular de 37 graus durant 48 h. Després de la incubació, afegiu 20 ul de MTT (la concentració de la solució d'emmagatzematge és de 5 mg/ml) a cada pou, torneu-la a posar a la incubadora cel·lular i continueu incubant durant 4 h i, finalment, afegiu-hi 100 ul de 20 per cent. SDS per dissoldre formazan a 37 graus durant la nit i utilitzar-lo l'endemà. L'absorbància a 570 nm de cada grup va ser detectada per un lector de microplaques i es va calcular la taxa d'inhibició de diferents concentracions de CDP sobre la proliferació de cèl·lules Jurkat per fórmula.

Es van prendre 1,5 cèl·lules Jurkat de Western Blotting en la fase de creixement logarítmic i es van sembrar en una placa de 6-pou a una densitat de 2 × 105 cèl·lules/ml, 500 ul/pou i es van afegir 500 ul de medi complet RPMI1640 al control grup. Configureu 3 grups experimentals, grups de tractament de polisacàrids d'1, 2 i 5 mg/ml, CDP

Dissolt en un medi complet RPMI1640 per endavant, es van afegir 500 ul de cèl·lules i 500 ul de solucions de CDP de diferents concentracions a la placa del pou 6- i es van incubar a 37 graus durant 48 h. Després del cultiu, es van recollir les suspensions cel·lulars de cada grup, es van centrifugar a 1 500 r/min durant 5 min per obtenir pellets cel·lulars i es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) prèviament refredada. Després del rentat, es van afegir 20 ul de tampó de lisi cel·lular a cada grup i les cèl·lules es van lisar en gel durant 30 min. Es va extreure la proteïna total i es va ajustar la concentració cel·lular mitjançant el mètode de Bradford. Es van prendre 20 ug de proteïna de cada grup per a l'electroforesi en gel de poliacrilamida SDS (PAGE) i la proteïna es va transferir a la membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF) per electroporació. Bloquejat amb llet en pols sense greix a temperatura ambient durant 1 h, s'afegeix anticossos anti-caspasa-3 i caspasa-9 de conill en una proporció de dilució d'1:1 000, incubat a temperatura ambient durant 1 h, esbandida 3 vegades amb un agitador de tampó fosfat Tween (PBST) (10 min/temps), afegiu anticossos secundaris marcats amb peroxidasa de rave picant (HRP) (1:1 000), incubar durant 1 h a temperatura ambient, esbandida 3 vegades amb PBST, esbandida 1 vegada amb PBS, afegir substrat ECL i utilitzar L'estació de treball d'imatge intel·ligent es va utilitzar per a la imatge i es van comparar els canvis de banda de cada grup per estudiar l'apoptosi de les cèl·lules Jurkat induïda per CDP. Per a la detecció de proteïnes relacionades amb la via de l'apoptosi, el cultiu cel·lular i les condicions de tractament amb CDP eren les mateixes que les anteriors. Després de la reacció, les cèl·lules es van lisar per quantificar proteïnes. La proteïna es va transferir a la membrana PVDF mitjançant SDS-PAGE i electroporació. Després de bloquejar amb llet desnatada en pols durant 1 h, es van afegir anticossos anti-CD71, CD45, p-JNK i p-ERK (1:1 000) i es van incubar a temperatura ambient durant 1 h. L'anticòs secundari marcat amb HRP (1:1 000) es va incubar durant 1 h i, finalment, es va utilitzar l'estació de treball d'imatge intel·ligent per a la imatge per estudiar les molècules de senyalització relacionades de l'apoptosi de cèl·lules Jurkat induïda per CDP. Les bandes experimentals resultants van ser en escala de grisos amb la imatge J (1.8.0).

Feu clic aquí per conèixer l'efecte Cistanche sobre l'efecte antitumoral i anticancerígen

1.6 Anàlisi estadística SPSS21. El programari 0 es va utilitzar per a la prova t i l'anàlisi de la variància

2 resultats de la funció Cistanche activadaleucèmia

2.1 Nivell de proliferació cel·lular

El CDP es va aïllar amb èxit, amb més del 9{{20}} per cent de contingut de sucre i menys del 5 per cent de contingut de proteïnes. La taxa d'inhibició de la proliferació cel·lular en el grup CDP d'1 mg/ml va ser (19,1 ± 2,1) per cent, mentre que en els grups CDP de 2 mg/ml i 5 mg/ml va ser (44,2 ± 5,2). ) ) per cent i ( 47, 8 ± 4, 4) per cent , cosa que indica que el CDP pot inhibir significativament la proliferació de cèl·lules Jurkat d'una manera dependent de la dosi. 2.2 En comparació amb el grup de control (0,62±0.04, 0,56±{{{0}}.{{49} }}7), el nivell d'apoptosi a les cèl·lules Jurkat tractades amb 5 mg/ml de CDP va donar lloc als enzims de caspasa-9 i caspasa{{30}}. Proforma pro-caspasa-9 ( 0. 09 ± 0. 02) i pro-caspasa-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) es van reduir significativament i els grups CDP d'1 mg/ml i 2 mg/ml van ser significativament menys efectius per a la pro-caspasa-3 a les cèl·lules. El contingut de caspasa-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) i pro-caspasa-3 (0,48±0,04, 0,44±0,05) no va tenir cap efecte significatiu, és a dir, baixa La concentració de CDP no va induir l'apoptosi de les cèl·lules Jurkat, però principalment va inhibir la proliferació cel·lular, tal com es mostra a la figura 1.

1-4: grup de referència,

1 mg/ml grup CDP, 2 mg/ml grup CDP, 5 mg/ml grup CDP; igual que la figura següent

Figura 1 L'efecte del CDP sobre la caspasa-9 i la caspasa-3 a les cèl·lules Jurkat

Influència dels polisacàrids Cistanche Efecte sobre la leucèmia

2.3 Els nivells d'expressió relatius de CD71 i CD45 al grup control del receptor d'apoptosi eren 1.00±0.04, {{10}},54± 0.{{20}}2. El grup CDP de 5 mg/ml podria inhibir significativament el CD71 (0.05±0.02). 01) i CD45 (0. 13 ± {{4{0}}. 03); Els grups CDP d'1 mg/ml i 2 mg/ml podrien inhibir l'expressió de CD71 (0, 52 ± 0, 06, 0, 43 ± 0, 07) fins a cert punt No hi va haver cap efecte significatiu sobre l'expressió de CD45 (0, 51). ±0,01, 0,48±0,02). Vegeu la figura 2.

Figura 2 L'efecte del CDP sobre l'expressió dels receptors a la superfície de la membrana cel·lular

2.4 Vies relacionades amb l'apoptosi

Els nivells d'expressió relatius de p-JNK i p-ERK al grup de referència eren 1,20±0.08 i 0,21±{0 .03, respectivament. El grup CDP de 5 mg/ml va induir l'apoptosi i va reduir significativament el nivell de fosforilació de JNK. (0. 32 ± 0. 04) , va augmentar significativament el nivell de fosforilació d'ERK ( 1, 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP va augmentar el nivell de fosforilació de JNK (1. 12 ± 0. 06, 1. 06 ± 0. 06) no va tenir cap efecte significatiu, però encara va augmentar el nivell de fosforilació d'ERK (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Vegeu la figura 3.

Figura 3 L'efecte del CDP en la fosforilació de JNK i ERK

3 Discussió

En els darrers anys, els estudis han trobat que el CDP té un cert efecte inhibidor sobre les línies cel·lulars de leucèmia, però encara no es coneix el mecanisme d'acció específic.

En el procés d'apoptosi, la caspasa-9 és una de les molècules de senyalització aigües amunt del procés d'apoptosi dependent de la caspasa. Després de l'estimulació del senyal, la pro-caspasa-9 s'hidrolitza massivament per produir una forma activada de caspasa escindida-9, que continua transmetent senyals apoptòtiques cap avall per promoure el procés d'apoptosi. La caspasa-3 és una molècula de caspasa de tipus efector i és una molècula de senyalització clau en el procés d'apoptosi depenent de la caspasa cel·lular. També existeix en forma de proenzim (pro-caspasa-3) en condicions normals. Un cop activada per hidròlisi, es produeix una gran quantitat de caspasa escindida. -3, lisarà una varietat de molècules de proteïnes clau a les cèl·lules i, finalment, induirà l'apoptosi. El CDP pertany als polisacàrids actius de les macromolècules biològiques i no pot entrar lliurement a les cèl·lules a través de la membrana cel·lular. Per tant, la CDP indueix l'apoptosi afectant l'expressió i la distribució dels receptors a la superfície de les membranes cel·lulars de Jurkat, transmetent així senyals a l'interior de les cèl·lules i, finalment, activant la família de les caspases. proteïna, que condueix a l'apoptosi cel·lular. Aquest estudi mostra que la baixa concentració de CDP no indueix l'apoptosi de les cèl·lules Jurkat, sinó que principalment inhibeix la proliferació cel·lular. CD71, també conegut com a receptor de transferrina, és un receptor de glicoproteïna transmembrana de tipus II implicat en l'absorció de ferro i la regulació del creixement i desenvolupament cel·lular. El CD71 està molt expressat en pacients amb leucèmia aguda i s'associa amb la resistència primària als fàrmacs, és a dir, l'expressió de CD71. Com més alt sigui el valor, pitjor serà l'efecte de la primera quimioteràpia. Per tant, CD71 és un dels marcadors per al diagnòstic auxiliar. CD45 s'expressa a la superfície de tot tipus de leucòcits, també conegut com a antigen comú de leucòcits. Pertany a la glicoproteïna transmembrana tipus I i està estretament relacionada amb el desenvolupament i la diferenciació de les cèl·lules T. El CD45 té diferents nivells d'expressió i tipus al·lostèrics en diferents tipus de leucèmia, per la qual cosa es pot utilitzar com un dels marcadors per al diagnòstic diferencial i immunofenotipat de la leucèmia. L'anticòs monoclonal CD45 s'ha utilitzat àmpliament en el tractament de la leucèmia, especialment la leucèmia resistent als fàrmacs. Friesen et al. va trobar que els radionúclids

L'mAb CD45 etiquetat pot induir l'apoptosi en línies cel·lulars de leucèmia resistents als fàrmacs activant proteïnes de la família de les caspases (incloses la caspasa-3, la caspasa-8 i la caspasa-9). El CDP indueix l'apoptosi de les cèl·lules Jurkat, en primer lloc actuant sobre els receptors de superfície de la membrana cel·lular CD45 i CD71, afectant l'expressió i distribució dels dos, transmetent senyals d'apoptosi a les cèl·lules i, finalment, activant la caspasa-9 i la caspasa{{8 }}, desencadenant l'apoptosi. Tanmateix, tant la caspasa-9 com la caspasa-3 es troben aigües avall de la via apoptòtica, i les molècules de senyalització aigües amunt s'han d'explorar més. En aquest estudi, CDP a una concentració de 5 mg/ml va induir l'apoptosi de les cèl·lules Jurkat mentre inhibeix l'expressió de CD45, que era similar a la de l'anticòs monoclonal CD45 descrit anteriorment. Per tant, des de la perspectiva dels receptors relacionats amb l'apoptosi CD45 i CD71,Cistancheté un cert potencial per al tractament o tractament adjuvant de la leucèmia.Els sistemes de proteïna cinasa activada per mitògens (MAPK) s'expressen a totes les cèl·lules eucariotes.

Cistanche pastilles per millorar el sistema immunitari del tractament de la leucèmia

És una via de transmissió d'informació molt important que porta a terme la transducció del senyal d'estimulació extracel·lular a la intracel·lular i està composta per proteïnes cinases serina/treonina, incloses ERK, JNK i p38MAPK. La seva fosforilació i desfosforilació són interruptors de les activitats de la vida cel·lular i estan implicades en i regulen el procés de creixement, proliferació, diferenciació, activació i apoptosi cel·lular. Aquest estudi suggereix que la desfosforilació de JNK està implicada en l'apoptosi de cèl·lules T induïda per CDP, mentre que la fosforilació ERK està implicada en els dos processos, ja que la CDP inhibeix la proliferació cel·lular i indueix l'apoptosi.

En conclusió,Cistanche CDPté un efecte citotòxic sobre la línia cel·lular de leucèmia limfocítica T Jurkat, demostrant que les concentracions baixes (per sota de 2 mg/ml) inhibeixen la proliferació cel·lular, mentre que les altes concentracions (5 mg/ml) indueixen l'apoptosi.Cistanche CDPindueix l'apoptosi a les cèl·lules Jurkat principalment afectant i alterant les cèl·lules.

L'expressió dels receptors CD71 i CD45 relacionats amb l'apoptosi a la superfície de la membrana transmet senyals a l'interior de les cèl·lules, provocant encara més la fosforilació d'ERK i la desfosforilació de JNK, i finalment l'activació de la caspasa-9, que al seu torn activa la caspasa{{4} } per induir l'apoptosi.