Empremta digital HPLC i relació espectre-antitumoral per a la discriminació entre Mylabris Phalerata Pallas i Mylabris Cichorii Linnaeus

Contacte: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Escola de Farmàcia, Zunyi Medical University, Zunyi, Xina,

2 Laboratori clau de farmacologia bàsica del Ministeri d'Educació i Laboratori d'investigació internacional conjunt d'etnomedicina del Ministeri d'Educació, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou, Xina.

3 Escola de Ciències Mèdiques Bàsiques, Zunyi Medical University, Zunyi, Xina, 4Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, Xina.

Feu clic aquí per obtenir més informació sobre Cistanche antitumoral

Destacats

Aquest estudi proporciona un mètode HPLC aplicable, creïble i més eficient per discriminar dues espècies de Mylabris. I, l'empremta dactilar HPLC i l'espectreefectes antitumoralses van integrar i es van trobar els tres marcadors diferencials importants per a un nou marcador de Mylabris.

Resum

Objectiu: Avaluació de la discriminació entre dues espècies de Mylabris basada en l'empremta dactilar HPLC i l'espectre.efecte antitumoralrelació. Mètodes: En aquest estudi, un mètode de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) senzill i eficient que s'integra amb l'anàlisi quimiomètrica i l'espectre.efecte antitumoralLa relació es va desenvolupar per a la discriminació entre dues espècies de Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Resultats: a l'anàlisi d'empremtes digitals, es van seleccionar 14 pics característics per avaluar les diferències entre MP i MC mitjançant l'anàlisi de semblança i reconeixement de patrons mitjançant PCA i OPLS-DA. Els cromatogrames HPLC de mostres de 10 regions de la Xina van mostrar diferències entre MP i MC, i es van trobar 7 marcadors químics característics. En l'espectre-efecte antitumoralanàlisi de relacions, 4 marcadors d'activitat van tenir un paper vital en la disminució de l'IC50 i podrien ser els components antitumorals de Mylabris mitjançant l'anàlisi relacional gris i l'anàlisi de regressió lineal multivariant. L'anàlisi quimiomètrica en combinació amb els resultats de la relació espectre-efecte va indicar que els pics 2 (citosina), 4 (desconegut) i 14 (desconegut) eren marcadors diferencials importants per distingir les dues espècies de Mylabris.

Conclusió: el mètode és aplicable, creïble i més eficient per discriminar MP i MC, i oferirà una nova manera de facilitar el control de qualitat dels medicaments contra insectes.

Paraules clau: HPLC, empremtes dactilars, espectreefecte antitumoral, Mylabris, Discriminació

Fons

Mylabris, anomenat ban mao a la Xina, s'ha utilitzat com a medicina tradicional xinesa (MTC) per tractar el forúncle, les úlceres profundes, una massa abdominal i és un importantantitumoralagent. A més, s'utilitza àmpliament a Europa com a medicina popular [1]. El principal component actiu de Mylabris és la cantaridina, que és eficaçantitumoralcompost [2]. Els estudis farmacològics moderns han demostrat que Mylabris posseeix múltiples activitats i és molt apreciat per al tractament de tumors per la seva dobleanticancerígenspropietats i la capacitat d'augmentar el nombre de leucòcits [3-4]. En l'actualitat, Mylabris s'ha utilitzat àmpliament en algunes receptes clíniques de TCM anticancerígens a la Xina, com ara la injecció d'Aidi i la càpsula mao de la prohibició del compost.

Segons la Farmacopea de la República Popular de la Xina (versió de 2015), Mylabris es defineix com un cos sec de Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC), que es diferencien en les seves característiques botàniques, dinàmica de població i ecologia. 5-6]. Mylabris també és un fàrmac altament tòxic. Com que els fàrmacs disponibles a la Xina solen ser una barreja de MP i MC, cal identificar les diferències químiques i d'activitat entre les dues espècies.

Com que els TCM contenen nombrosos ingredients coneguts i desconeguts, l'anàlisi del perfil quantitatiu dels seus constituents químics suposa un repte important. L'empremta dactilar de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) té un paper important en el control de qualitat (QC) de TCM a causa del seu perfil general de característiques de la majoria de compostos en un sistema complex. A més, l'anàlisi d'empremtes digitals de TCM té una bona reproductibilitat i estabilitat per a l'autenticació d'espècies i l'avaluació de la qualitat, i és acceptada per l'Organització Mundial de la Salut, l'Administració Estatal d'Aliments i Medicaments de la Xina (SFDA) i l'Agència Europea d'Avaluació de Medicaments (EMEA). Recentment, s'ha desenvolupat una anàlisi quimiomètrica que combina empremtes dactilars HPLC per al control de qualitat i discriminant diferents fonts naturals complexes [7]. Tanmateix, és ineficaç discriminar les diferències en TCM, ja que no pot reflectir les diferències de constituents actius, cosa que és més important per a l'ús clínic. Fins ara, l'espectreantitumoral efectes'han utilitzat enfocaments de relació per identificar amb èxit els constituents bioactius dels MTC [8]. L'empremta dactilar HPLC combinada amb l'anàlisi quimiomètrica i la relació espectre-efecte antitumoral dilucidarà millor la diferència de múltiples fonts de TCM.

Recentment s'han informat alguns mètodes per determinar el contingut de cantaridina, que es pot utilitzar per determinar la qualitat de Mylabris [9]. També es van aplicar algunes empremtes cromatogràfiques per al control de qualitat [10-11]. Només un estudi va utilitzar un mètode que implicava una elució en gradient dels compostos solubles en aigua de Mylabris basat en HPLC. Mentrestant, només es van utilitzar deu mostres i cap mostra de MC [12]. Segons el nostre coneixement, la discriminació de MP i MC en funció de la composició i l'activitat química no s'ha estudiat abans.

Aquest estudi pretenia desenvolupar un mètode senzill i eficaç per discriminar dues espècies de Mylabris mitjançant empremtes dactilars HPLC combinades amb anàlisi quimiomètrica i espectre.antitumoralefecterelació, que proporcionarà una base per al control de qualitat de Mylabris. Aquest mètode també es podria aplicar per identificar el marcador QC d'altres TCM.

Materials i mètodes

En total, es van recollir 20 lots de Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC) de diferents províncies de la Xina (taula 1) i identificats pel nostre professor Xiao-Fei Li. Els exemplars de val es van dipositar als nostres laboratoris.

La citosina, uridina, guanosina i adenosina estàndard de referència es van comprar a ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Xina). L'acetonitril i el metanol de grau HPLC es van comprar a Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, EUA). L'aigua pura de Watson es va utilitzar durant tot l'estudi. Altres productes químics i dissolvents eren de grau analític i s'obtenien del reactiu Aladdin (Xangai, Xina), el reactiu Chengdu Kelong (Chengdu, Xina) i el reactiu químic Sinopharm (Beijing, Xina)

Aparell i condicions cromatogràfiques

L'anàlisi HPLC es va realitzar mitjançant un sistema HPLC Agilent 1260 Infinity a 30 graus en un Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) per a la presa d'empremtes digitals. Per a la separació es va utilitzar l'elució de gradient lineal amb els eluents A (aigua/àcid acètic glacial, 100:1, v/v) i B (metanol). El programa de gradients es va desenvolupar de la següent manera: 0-1 min, 3.0-4,6 per cent B; 1-9 min, 4.6-6,8 per cent B; 9-25 min, 6.8-51,0 per cent B; 25-30 min, 51.0-100 per cent . El cabal de la fase mòbil va ser d'1,0 ml/min. El cromatograma es va controlar a 254 nm. Després d'un període d'equilibri de 15 minuts, es van utilitzar 10 μL de mostres per a la injecció.

Preparació de la mostra

Les mostres seques es van triturar en pols i es van extreure 2,5 g de cada mostra en pols dues vegades amb 50 ml d'etanol al 75 per cent per reflux durant 1,5 hores cada vegada. La mostra extreta es va barrejar i concentrar a pressió reduïda fins a 20 ml. A continuació, la mescla es va precipitar amb 80 ml d'aigua durant 24 hores a 4 graus. Posteriorment, l'extracte es va centrifugar a 3000 g min-1 durant 10 min per separar el sobrenedant. El sobrenedant es va concentrar a pressió reduïda fins a 25 ml. Finalment, el sobrenedant es va filtrar a través d'una pel·lícula Millipore de 0, 22 μm abans de l'anàlisi HPLC.

Validació de la metodologia

El mètode HPLC es va validar per a la precisió, la reproductibilitat i l'estabilitat (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). La validació es va estimar en funció del temps de retenció (RT) i de l'àrea màxima (PA). Finalment, es van establir empremtes dactilars químiques de 20 lots de Mylabris per identificar les característiques químiques integrades de múltiples compostos. Es van introduir algunes tècniques quimiomètriques a l'empremta química per a l'anàlisi.

Anàlisi de reconeixement de patrons

Les diferències entre dues espècies de les zones màximes es van avaluar per a la significació estadística mitjançant la prova t de Student no aparellada. Un valor p inferior a 0.05 es va considerar estadísticament significatiu. Com a mètode clàssic no supervisat, l'anàlisi de components principals (PCA) s'aplica àmpliament per a l'anàlisi de dades estadístiques. En lloc d'utilitzar moltes variables, PCA pren un petit nombre d'ordinadors sense perdre molta informació, i després es visualitzen els diagrames de puntuació per a la separació gratuïta de les observacions. En aquest estudi, la PCA es va dur a terme a les àrees màximes normalitzades de cada component de les empremtes dactilars HPLC mitjançant el programari SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Suècia) per trobar la discriminació entre les dues espècies de Mylabris.

Per a una discriminació més preferida entre les dues espècies de Mylabris, es va aplicar un mètode supervisat d'anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials ortogonals (OPLS-DA) per analitzar les diferències en les àrees màximes normalitzades de cada component a les empremtes dactilars HPLC. El valor VIP és una suma ponderada de quadrats dels pesos OPLS, que reflecteix la contribució relativa de cada variable X al model. Les variables amb VIP > 1, juntament amb S-plot, es van considerar influents per a la separació de mostres en els diagrames de puntuació generats a partir de l'anàlisi OPLS-DA. A continuació, es van obtenir els marcadors químics característics per a la discriminació.

Anàlisi de la relació espectre-efecte antitumoral

Per explorar elantitumoralàrea màxima d'efecte per a mostres de Mylabris integrades amb dades d'empremta digital i comparar les diferències entre les dues espècies, la correlació entre el pic de l'empremta digital ianti-tumores van estudiar els efectes. SPSS19.0 (IBM, EUA) i GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Xina) van aplicar dos mètodes que combinen l'anàlisi relacional gris i l'anàlisi de regressió lineal multivariant (MLRA). Elanti-tumorLa prova es va dur a terme pels nostres mètodes publicats [12], les cèl·lules de la línia cel·lular de carcinoma hepatocel·lular humà HepG2 es van mantenir en un medi RPMI1640 complementat amb un sèrum boví fetal al 10%. Les cèl·lules es van cultivar en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de CO2 a 37 C. Es va utilitzar el mètode SRB per avaluar la proliferacióanti-tumoractivitats, després es va calcular l'IC50 de les cèl·lules HepG2, finalment, es van utilitzar l'IC50 i les àrees de pic normalitzades per a l'anàlisi quimiomètrica. A continuació, es van obtenir els marcadors d'activitat característics de Mylabris.

Resultats i discussió

Optimització de les condicions d'extracció

Per a una extracció suficient de compostos de solut en aigua de Mylabris, es va optimitzar el sistema d'extracció. Els ultrasons i el reflux van demostrar que aquests compostos es podrien extreure de manera òptima mitjançant el reflux.

Optimització del mètode HPLC

Per obtenir els pics cromatogràfics màxims per descriure la característica general de l'herba, es va investigar la composició de la columna cromatogràfica, la fase mòbil i les longituds d'ona de detecció (200, 254, 265 i 278 nm). Els resultats van mostrar que la columna Phenimenex Synergy Polar-RP80, aigua (que conté un 1% d'àcid acètic glacial) i metanol i 254 nm eren les millors condicions per a l'anàlisi HPLC de Mylabris (figura 1), l'estructura de 4 substàncies estàndard es mostra a la figura 2. .

Validació del mètode

En aquest estudi, 14 pics estaven ben separats i s'utilitzaven com a "pics comuns". La precisió, la repetibilitat i l'estabilitat es van basar en el temps de retenció (RT) i l'àrea de pic (PA). Els valors RSD de RT i PA per a la precisió (n=6) no van superar 0,2 i 4 per cent, respectivament; Els valors RSD de RA i PA per a la repetibilitat (n=6) eren inferiors a 0,2 i 4%, respectivament, i els valors RSD d'estabilitat (0-24 h) eren inferiors a 0-24 {10}}.4 i 5 per cent, respectivament, que indicaven que les mostres eren estables en 24 h. Aquests resultats van il·lustrar que la qualitat de les mostres estudiades i el mètode HPLC eren estables i ben controlats.

Avaluació de la similitud d'empremtes digitals

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}},921 excepte per a les mostres MC (de Guizhou2 i Guizhou4), les similituds de les quals eren 0,888 i 0,887, respectivament. Aquestes dades van indicar que la qualitat de Mylabris dins d'una espècie era estable. Tanmateix, les similituds de només tres mostres de MP en comparació amb l'empremta digital HPLC de referència eren > 0,930; i les similituds de només dues mostres de MC en comparació amb l'empremta digital HPLC de referència eren > 0,921. Aquests resultats van mostrar que les dues espècies de Mylabris presentaven una variació considerable en algunes zones de cim.

Discriminació de MP i MC per anàlisi de reconeixement de patrons

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, els pics 1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14 podrien ser les variables més significatives per discriminar entre les dues espècies (figura 6). El grup de pics (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) pot tenir un paper vital a l'hora de distingir entre MP i MC com a marcadors químics característics.

Relació espectre-efecte per anàlisi relacional de grisos

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Relació espectre-efecte per MLRA

El model MLRA és el mètode de modelització més comú per deduir la complexitat de la relació entre dues o més variables i una resposta que es va construir amb la fórmula següent

On Y és el valor estimat i representa la resposta; Xn és una variable independent, b{{0}} és la intercepció i bn és el coeficient de regressió de Xn. En aquest estudi, es va aplicar MLRA per establir la relació d'eficàcia de l'empremta digital entre els valors de les àrees màximes de les empremtes dactilars HPLC i l'IC50 d'anti-HepG2, i després trobar els possibles components antitumorals. La colineació de dades es va trobar mitjançant un model MLRA comú, que no és adequat per explorar la correlació entre Y (IC50) i X (PA). Es va utilitzar un model PCA MLRA per estudiar la relació empremtes dactilars-efecte, i els primers sis ordinadors amb una taxa de contribució de variància acumulada: el 91,068 per cent es van seleccionar per a l'anàlisi. Finalment, es va establir l'equació següent segons la sortida SPSS i els ordinadors: IC50=1.115864 més （ 1.87268PA{1- 699.722PA2 més 25.7138PA{3 - 24.1528PA4 més 7.22878PA{{{ 23}}.2114PA6 més 2,95283PA7- 15.5305PA8 més 13,0297PA9 més 22,5683PA10 - 10.3462PA11 més 123,762PA12 més 31,0428PA9, més 31,0428PA. (R era 0,682, P <>

Anàlisi integradora de dues espècies de Mylabris

L'experiment va demostrar que l'empremta dactilar HPLC es podria utilitzar per reflectir les característiques químiques de Mylabris. Els algorismes de semblança, PCA i OPLS-DA es van aplicar per trobar la diferència entre MC i MP. El grup de pics (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) es va definir com a marcadors químics característics.

A més, tant GRA com MLRA van demostrar ser un mètode satisfactori per discriminar més. Integrant els resultats de l'anàlisi GRA i MLRA, els pics 2, 4 i 14 com a marcadors d'activitat de Mylabris haurien de ser responsables de l'efecte antitumoral, que pot ser la base del material farmacodinàmic de Mylabris.

Es van definir els marcadors diferencials importants per al pic amb propietats químiques i marcadors d'activitat característiques. Per tant, entre MC i MP a les empremtes dactilars HPLC després de l'anàlisi de la relació espectre-efecte, els pics 2 (citosina), 4 (desconegut) i 14 (desconeguts) eren marcadors diferencials importants per a les diferències entre MP i MC, tal com es mostra a la figura 7.

Conclusió

En conclusió, en la present investigació, es va proposar un mètode HPLC per a la presa d'empremtes dactilars químiques de MP i MC. Combinant l'empremta digital HPLC, la PCA i l'anàlisi de relacions espectre-efecte com GAS i MLRA, es podrien discriminar les propietats químiques i farmacològiques de dues espècies properes de Mylabris. Això va indicar que els compostos dels pics 2 (citosina), 4 (desconegut) i 14 (desconegut) com a marcadors diferencials importants van tenir un paper dominant a l'hora de distingir entre MP i MC. L'estructura dels pics 4 i 14 s'hauria d'identificar mitjançant una altra tecnologia. Es va demostrar que el mètode d'empremta dactilar HPLC combinat amb l'anàlisi estadística, quimiomètrica i l'anàlisi de la relació espectre-efecte és eficient per descobrir components del marcador o per promoure el control de qualitat deherbes medicinals.

Referències

1 Wang GS. Usos mèdics de Mylabris a la Xina antiga i estudis recents. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Determinació del contingut de cantaridina i el seu efecte inhibidor sobre les cèl·lules HepG2 d'hepatoma humà. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: activitats inhibidores de la colesterol aciltransferasa d'amides d'àcids grassos aïllades del falarat de Mylabris Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Butllofes de cantaridina: una tècnica per investigar el tràfic de leucòcits i la producció de citocines en llocs d'inflamació en humans. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Estudi sobre l'aliment preferit de Mylabris phalerata adult en diferents poblacions geogràfiques. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Característiques biològiques dels Meloidae i la seva alimentació artificial. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Anàlisi quantitativa en combinació amb tecnologia d'empremtes dactilars i anàlisi quimiomètrica aplicada per avaluar sis espècies de París salvatge mitjançant UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Monitorització i avaluació de la consistència de la qualitat de les pastilles d'aluminat de bismut compost mitjançant un mètode d'empremta digital de proporció quantificada senzill combinat amb la determinació simultània de cinc compostos i correlacionat amb activitats antioxidants. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Anàlisi de cantaridina en falsos escarabats blister (Coleoptera: Oedemeridae) mitjançant microextracció en fase sòlida d'espai de cap i cromatografia de gasos-espectrometria de masses. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Estudi sobre les empremtes dactilars GC de Mylabris phalerata. Xina Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX i Shi XF. Empremtes digitals de Mylabris per HPCE. Farmàcia Central Sud (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX i Wang, Z. Estudi sobre les empremtes digitals HPLC de Mylabris. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Activitat de cèl·lules HepG 2 de carcinoma hepatocel·lular antihumà de cantaridina derivada de la província de Guizhou i les regions circumdants. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.