Accessibilitat de la cromatina i expressió de microARN a les cèl·lules progenitores de la nefrona durant el desenvolupament del ronyó

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6, Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10, Jacqueline Ho^2,3*i Dennis Kostka^1,4*

¹Departament de Biologia del Desenvolupament, Facultat de Medicina de la Universitat de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA²Rangos Research Center, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA³Departament de Pediatria, Divisió de Nefrologia, Facultat de Medicina de la Universitat de Pittsburgh, PA, EUA⁴Departament de Biologia Computacional i de Sistemes i Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, Universitat de Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, EUA⁵Divisió de Medicina Genètica i Genòmica, Departament de Pediatria, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA⁶Departament de Patologia, Laboratori de Genètica Bioquímica Clínica, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA⁷Departament de Pediatria, Divisió de Gastroenterologia, Hepatologia i Nutrició, Facultat de Medicina de la Universitat de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA.⁸Biologia Computacional,⁹Ciències Biològiques, i¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, EUA

Resum

Les nefrones de mamífers provenen d'una població decèl·lules progenitores de nefrona, i els canvis en els transcriptomes d'aquestes cèl·lules contribueixen a la cessació de la nefrogènesi, un determinant important del nombre de nefrones. Per caracteritzar l'expressió de microRNA (miRNA) i identificar regions putatives reguladores de cis, vam recollir cèl·lules progenitores de nefrona del ratolí.ronyonsel dia embrionari 14,5 i el dia zero postnatal i es va analitzar l'expressió d'ARN petita i la cromatina accessible a la transposasa. Vam detectar l'expressió de 1.104 miRNA (114 amb canvis d'expressió) i 46.374 regions accessibles a la cromatina (2.103 amb canvis d'inaccessibilitat). A tot el genoma, les nostres dades destaquen processos com la diferenciació cel·lular, la migració cel·lular, les interaccions de la matriu extracel·lular i les vies de senyalització del desenvolupament. A més, identifiquen nous elements reguladors cis candidats per a Eya1 i Pax8, tots dos gens amb un paper en la diferenciació de cèl·lules progenitores de nefrona. Finalment, associem miRNAs que canvien l'expressió, incloent let-7-5p, miR-125b-5p, miR{-181a-2-3p i miR{{ 20}}p, amb elements reguladors cis candidats i gens diana. Aquestes anàlisis posen de manifest nous loci reguladors cis putatius per a miRNA en progenitors de nefrona.

Introducció

La unitat funcional de laronyóés la nefrona, que serveix per filtrar els residus i mantenir l'homeòstasi normal de l'aigua, àcid-base i electròlits del cos. El nombre de nefrones varia àmpliament en humans (normalment entre dos-cents mil i més d'un milió de nefrones (Hughson et al., 2003)) i s'estableix abans del naixement en humans (aproximadament el dia postnatal 2-3 en ratolins (Hartman et al., 2003) ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Les nefrones no es poden regenerar després del naixement, i la disminució de la dotació de nefrones s'associa amb un augment del risc de malaltia renal crònica i hipertensió (Bertram et al., 2011). El nombre de nefrones, al seu torn, està determinat en gran part per una població de cèl·lules anomenadacèl·lules progenitores de nefrona(Cebrian et al., 2014b). En les últimes etapes deronyódesenvolupament, els progenitors de nefrones augmenten la seva propensió a diferenciar-se, la qual cosa esgota gradualment la seva població i marca l'eventual cessament de la nefrogènesi (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Entendre els mecanismes que regulen el cessament de la nefrogènesi té implicacions importants per a la determinació de la dotació de nefrones i el risc de malaltia renal posterior.

Durantronyódesenvolupament, s'indueix que els progenitors de nefrona Cited1 més /Six2 més auto-renovables es converteixin en progenitors Cited1-/Six2 plus primers i, posteriorment, es diferencien en vesícules renals que expressen Wnt{4-en resposta a Wnt9b/-catenina (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). Els canvis transcripcionals intrínsecs en els progenitors de la nefrona precoç i tardà inclouen gens i vies que influeixen en l'envelliment de les cèl·lules mare, en particular, mTor i el seu repressor hamartina (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). De fet, es creu que l'hamartina desensibilitza els progenitors de la nefrona als senyals d'auto-renovació, i d'aquesta manera contribueix a la cessació de la nefrogènesi (S. Chen et al., 2015). En consonància amb la idea que els primers progenitors de la nefrona tenen una major tendència a auto-renovar-se és l'observació que l'accessibilitat de la cromatina s'enriqueix per als llocs d'unió dels factors de transcripció de les cèl·lules progenitores de la nefrona bàsica, inclosos Six2 i Wt1 en comparació amb els progenitors de la nefrona tardana (Hilliard et al. , 2019). S'ha demostrat que aquests factors de transcripció s'uneixen a seqüències potenciadores situades en "punts calents reguladors" del genoma (O'Brien et al., 2018). La inducció de progenitors de nefrones es produeix a causa de l'augment dels nivells de -catenina, que donen lloc a l'activació de complexos Lef1/Tcf7 en gens preparats per a l'activació del programa de nefrogènesi (Park et al., 2012), i s'ha suggerit que es complexa amb Tcf7l1 i Tcf7l2. per establir i mantenir bucles de cromatina reguladors que faciliten l'activació gènica (Guo et al., 2021).

Feu clic aCistanche tubulosa en pols per al tractament de la malaltia renal

Estudis recents han implicat els microARN (miRNA) en la regulació del cessament de la nefrogènesi. Els miRNA són molècules d'ARN curtes i no codificants que es dirigeixen a les transcripcions d'ARN missatger (ARNm) per reduir la traducció o millorar la degradació mitjançant el complex de silenciament induït per l'ARN (RISC) (Bartel, 2009). La proteïna Lin28b és un repressor conegut de la família let-7de miRNAs (Heo et al., 2008). L'expressió de Lin28b disminueix en els progenitors de nefrones a mesura que avança la nefrogènesi, i això coincideix amb un augment de l'expressió de la família de miRNA let-7 (Yermalovich et al., 2019). A més, la inducció condicional de l'expressió de Lin28b en el llinatge Wt1- dóna lloc a la repressió del miRNA let-7, que és suficient per allargar la nefrogènesi (Yermalovich et al., 2019). Es desconeix si altres miRNAs regulen el temps de la nefrogènesi. A més, si bé s'han identificat potenciadors que regulen l'expressió llarga d'ARN no codificant durant la nefrogènesi (Nishikawa et al., 2019), no s'ha demostrat que cap reguli l'expressió de miRNA en progenitors de nefrona.

En aquest estudi, hem intentat identificar simultàniament un nou miRNA que contribueixi a la cessació de la nefrogènesi, juntament amb possibles característiques reguladores cis. Per tant, per observar els canvis en l'expressió de miRNA i l'accessibilitat de la cromatina entre el dia embrionari 14.5 (E14.5) i el dia zero postnatal (P0), vam produir conjunts de dades d'ARNm-seq i ATAC-seq coincidents a partir de conjunts de dades primaris i no passats.cèl·lules progenitores de nefronaen aquests dos moments. Hem identificat 114 miRNAs que s'expressen de manera diferentcèl·lules progenitores de nefronaentre aquests dos punts de temps, així com 2.103 regions d'accessibilitat de cromatina canviant que anomenem regions d'accés diferencial (DAR). Les anàlisis d'enriquiment dels objectius genètics predits de canvis significatius de miRNA, així com entre les ubicacions genòmiques dels DAR, impliquen vies que afecten la diferenciació de cèl·lules epitelials, la migració cel·lular, les interaccions de la matriu extracel·lular i les vies clau de senyalització del desenvolupament com la senyalització Wnt, Notch i TGF. . Observem canvis significatius en l'accessibilitat a la cromatina i presentem múltiples línies d'evidència que impliquen dues regions genòmiques com a potenciadors putatius dels gens Eya1 i Pax8 a les cèl·lules progenitores de la nefrona. Finalment, vam identificar l'accessibilitat de la cromatina i els canvis d'expressió de miRNA consistents per a 33 parells de miRNA i DAR, inclosos let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p i miR-9-3p, i presenten gens objectiu putatius expressats en progenitors de nefrones per a miRNA expressats de manera diferent.

Resultats

Aïllament de poblacions de cèl·lules progenitores de nefrona d'E14.5 i P0ronyons

Cèl·lules progenitores de nefronaes van aïllar mitjançant selecció positiva per Itg 8 a E14.5 o a P 0, i cada mostra es va dividir per realitzar mRNA-seq, ATAC-seq i control de qualitat (figura suplementària 1 AB). La PCR quantitativa (qRT-PCR) va confirmar que els gens marcadors de progenitors de nefrona Six2 i Cited1 (Huang et al., 2016) s'expressen molt en mostres aïllades de progenitors de nefrona en relació amb el conjunt.ronyó, més que els marcadors per a altres tipus de cèl·lules (incloent-hi el brot uretèric (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), cèl·lules endotelials (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), estroma renal (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) i vesícula renal (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (figura suplementària 1 C). Pel que fa al sexe, les escombraries utilitzades per a mostres d'E14.5 oscil·laven entre Entre un 27% i un 50% de dones, i les cames per a les mostres P0 oscil·laven entre un 31% i un 75% de dones. De mitjana, les mostres E14,5 eren un 38% de dones i les mostres P0 eren un 49% de dones (figura suplementària 1 D). Aquestes envelleixen amb cura. -les poblacions de cèl·lules progenitores de nefrones coincidents ens van permetre analitzaraccessibilitat de la cromatinai una petita expressió d'ARN en les mateixes etapes de desenvolupament en dos punts temporals (E14.5 i P0).

Els progenitors de la nefrona primerenca i tardana tenen perfils transcripcionals de miRNA diferents

La seqüenciació d'ARN petit va detectar 1,104 transcripcions de miRNA conegudes i va identificar 114 miRNAs que mostren un canvi significatiu en l'expressió entre les mostres E14.5 i P{{{0}} (taxa de descobriment fals ( FDR)=0.05; Taula suplementària 1). La meitat dels miRNAs expressats de manera diferent mostren una expressió més gran a P0 en comparació amb E14.5, i l'anàlisi dels components principals posa de manifest una major homogeneïtat en l'expressió de miRNA entre les mostres E14.5 en comparació amb P0 (figura 1A). L'agrupació jeràrquica revela una clara agrupació de miRNAs en els d'expressió creixent i decreixent entre E14.5 i P0, respectivament (figura 1B). Els membres de la família let-7de miRNAs es troben entre els miRNA més altament expressats detectats, i observem que tots els membres de la família amb canvis significatius mostren una expressió més gran a P0 (dades no mostrades). Això està en línia amb els resultats que mostren que una reducció de l'expressió de Lin28b condueix a un ampli augment de l'expressió de la família let-7 al llarg de la nefrogènesi (Yermalovich et al., 2019). Altres miRNAs amb una expressió significativament més alta a P0 inclouen miR-429-3p, un membre de la família miR{-200 conegut per afectar la diferenciació dels podòcits (Z. Li et al., 2016), i tots dos miR{{30} }}a-5p i miR-125b-5p. Se sap que els dos darrers reprimeixen les transcripcions de Lin28 en diferents entorns cel·lulars (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). El miRNA amb una expressió significativament menor a P0 inclou l'angiogènesi (S. Wang et al., 2008) i la promoció de la proliferació (Schober et al., 2014) miR-126.

L'eina DIANA miRPath permet l'anàlisi de la via KEGG del miRNA en funció dels seus respectius gens dianes, tal com prediu el micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Trobem que els miRNA amb els majors canvis d'expressió entre E14.5 i P0 (amunt o avall) són els que regulen les vies amb papers clau en la nefrogènesi (figura 1C, figura suplementària 2). Per exemple, el Tgf- és secretat per les cèl·lules estromals circumdants per promoure la diferenciació del progenitor de nefrona (Rowan et al., 2{{50}}18), i observem una expressió reduïda entre el miRNA del progenitor de nefrona dirigit als efectors aigües avall de la "via de senyalització TGF" (via KEGG mmu04350, valor p 1,45e- 6). La "via de senyalització MAPK" (mmu04010) influeix en l'organització i la preparació dels progenitors de la nefrona per a la diferenciació, i regula les seves interaccions amb la matriu extracel·lular (ECM) mitjançant Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Observem un nombre significatiu de miRNAs regulats a l'alça i a la baixa que es dirigeixen a diferents gens en aquesta via de senyalització MAPK (valors p de 3,5e- 6 i 3,0e{- 4 per a llistes amunt i avall, respectivament) . Finalment, la via KEGG "Interacció amb el receptor de la matriu extracel·lular (ECM)" (mmu04512) és la via més significativament enriquida identificada, i els seus gens constitutius estan dirigits de manera molt més significativa per miRNA que augmenta l'expressió amb el temps (valor p de 7,4e{). {32}} entre miRNA creixent versus 1.1e-2 entre disminució). Els gens associats a l'ECM estan dirigits per alguns dels miRNA més expressats i que augmenten significativament que detectem, inclosos miR-196a-5p, miR{-148a-3p, miR -125a-5p i deixeu-7f-5p. En particular, miR-196a-5p és el miRNA més alt expressat a les nostres mostres i observa un augment 8-de vegades entre E14,5 i P0. Les transcripcions gèniques que eren els objectius previstos del miRNA (utilitzant TargetScan (Agarwal et al., 2015)) amb una expressió augmentada a P0 inclouen Bach2, un enllaç molecular proposat entre les vies MAPK/AP1 i Six2/-catenina per a l'autorenovació i diferenciació. en progenitors de nefrones, respectivament (Hilliard et al., 2019).

Per identificar objectius putatius de miRNA expressats de manera diferent en progenitors de nefrona, vam utilitzar l'anotació computacional de miRNAs proporcionada a miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) i les interaccions experimentals miRNA-mRNA anotades a partir de la base de morter (HY). Huang et al., 2020), en combinació amb el nostre conjunt de dades de seqüenciació d'ARN unicel·lular E14.5 generat anteriorment (Bais et al., 2020). Així, vam generar una llista de possibles interaccions miRNA-mRNA basades en l'expressió diferencial del miR entre E14.5 i P0 en progenitors de nefrona amb un canvi corresponent en l'expressió gènica objectiu entre els progenitors de nefrona autorenovables i cebats, així com els diferenciant els progenitors de la nefrona (figura 2). La nostra anàlisi suggereix que Meis2 i Hmga2 són objectius potencials de la família let-7 de miRNAs en progenitors de nefrona (figura 2), amb una disminució de l'expressió de Meis2 i Hmga2 associada a una major expressió dels membres de la família let-7. en diferenciar o envellir els progenitors de nefrona. El factor de transcripció Meis2 s'expressa fortament en els progenitors de la nefrona i l'estroma renal durantronyódesenvolupament (Lam et al., 2014), i està vinculat a la regulació de la proliferació cel·lular en altres contextos (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 és una proteïna que no s'uneix a la cromatina d'histona, s'expressa molt a les cèl·lules mare i s'ha associat amb una varietat de tumors mesenquimàtics (Fusco i Fedele, 2007; Lam et al., 2014). De la mateixa manera, hi ha una expressió de Jag1 creixent associada amb una expressió decreixent de miR-34b-5p, miR-983p i miR{-200a-3p en la diferenciació o progenitors de nefrona envellit (figura 2). Jag1 és un lligand clau en la senyalització de Notch, l'expressió del qual augmenta a mesura que es diferencien els progenitors de la nefrona (Chung et al., 2016). Totes les dianes de miRNA previstes o anotades per a gens amb canvis d'expressió entre els progenitors de nefrona auto-renovables, preparats i diferenciats estan disponibles a Suplement.

Figura 1. Canvis substancials en l'expressió de miRNA entre els progenitors de nefrona E14.5 i P0. A) L'anàlisi dels components principals mostra que el punt de temps del desenvolupament és un contribuent important a la variació de l'expressió de miRNA. B) Mapa de calor que representa l'expressió relativa de tots els miRNA que canvien significativament. Les columnes que contenen mostres E14.5 a l'esquerra estan anotades en verd clar, i les columnes amb mostres P0 a la dreta s'anoten en verd fosc. C) Enriquiment de gens de vies KEGG específiques entre dianes genètiques previstes de miRNA regulat a l'alça i a la baixa (barres vermelles i blaves, respectivament). El valor p mínim inclòs és 1e-5.

Figura 2. Interaccions miRNA-ARNm amb un possible paper en l'envelliment i la diferenciació de les cèl·lules progenitores de la nefrona. Es mostren miRNA (cercles) i mRNA (quadrats). Els miRNA amb una expressió augmentada entre E14.5 i P0 es mostren en vermell, els miRNA que disminueixen es mostren en blau. Gens diana anotats (de mirDB i mir TarBase) amb una expressió creixent entre autorenovació, preparació o diferenciaciócèl·lules progenitores de nefrona(Bais et al., 2020) es mostren en vermell, ARNm amb una expressió decreixent en blau. S'han omès les vores de mirDB i mirTarDB que no són coherents amb els canvis d'expressió observats, però s'inclouen a la taula suplementària 2.

Els progenitors de la nefrona primerenca i tardana tenen entorns de cromatina diferents

Les dades ATAC-seq dels progenitors de la nefrona E14.5 i P0 ens van permetre identificar 46.374 regions de cromatina accessible (amb una taxa de descobriment irreductible (Boleu et al., 2015) llindar de {{ 22}}.1, vegeu (figura suplementària 3 C, taula suplementària 3), combinada entre mostres i punts de temps. Observem que les nostres dades s'ajusten a les directrius ATAC-seq del projecte ENCODE (ENCODE, nd) (figura suplementària 3 A, B) i que observem un augment de les taxes de conservació entre els pics de l'IDR que en els controls aleatoris (figura suplementària 3 D). Entre els IDR que informem, 3.576 contenen potenciadors documentats a VISTA (Visel et al., 2007) i/o Les bases de dades potenciadores FANTOM5 (de Rie et al., 2017) i 13.495 contenen seqüències d'ADN amb funcions reguladores previstes en almenys un tipus de cèl·lula o teixit de ratolí segons EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

L'anàlisi dels components principals (ajustat per diferències de sexe entre mostres) va revelar una clara agrupació de mostres per punt de desenvolupament (figura 3A). Per identificar els loci genòmics amb canvis en l'accessibilitat de la cromatina, vam comparar el senyal ATAC-seq entre les mostres E14.5 i P0. Hem observat 2,103 DAR, controlant el FDR a l'10 per cent. D'aquests 1.323 (55 per cent) van mostrar una major accessibilitat a P0 en comparació amb E14.5, i la agrupació jeràrquica va revelar una clara distinció entre els DAR que s'obren i es tanquen entre E14.5 i P0, respectivament (figura 3B).

Les petjades del factor de transcripció es van identificar mitjançant HINT i es van relacionar amb proteïnes d'unió a l'ADN mitjançant motius de la base de dades HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). Entre els 431 motius provats, els DAR que contenen petjades de diverses proteïnes del factor de transcripció associades a la nefrogènesi mostren un augment de l'accessibilitat entre E14.5 i P0. Entre les petjades que resideixen als DAR que augmenten l'accessibilitat de mitjana, les sis primeres pertanyen a les petjades de factors de transcripció coincidents amb Pax8 ({{10}},15), Six2 (0,14), Cebpd (0,13), Six4 (0,13), Jun (0,12) i Fos (0,11). Les petjades anotades en els DAR de tancament inclouen factors de transcripció E2F2 i E2F4, que se sap que influeixen en la progressió del cicle cel·lular (Gaudet et al., 2011) i que promouen la proliferació cel·lular (D. Wang et al., 2000) en altres contextos cel·lulars (figura suplementària). 4).

Per avaluar el context biològic d'obertura i tancament de DAR, hem utilitzat l'eina d'enriquiment d'anotacions de regions genòmiques (GREAT) (McLean et al., 2010) per destacar conjunts de gens amb enriquiment de regions de cromatina canviants associades. Amb aquest enfocament, identifiquem processos biològics d'ontologia gènica (GO) estretament lligats al desenvolupament del progenitor de nefrona: en particular, el procés enriquit més important entre els DAR d'obertura és "Regulació de la diferenciació de cèl·lules epitelials" (GO:0030856, Binomial Q-value {{3). }}.5e-5) i "Regulació positiva de la diferenciació de cèl·lules epitelials" (GO:0030858, Binomial Q-value=5e{-3) es troba entre els 10 més enriquits significativament ( Figura suplementària 5). Tots dos són coherents amb un augment de la propensió dels progenitors de nefrones a patir transicions mesenquimatosos a epitelials (MET) a mesura que es diferencien (S. Chen et al., 2015). Altres vies significativament enriquides inclouen la "regulació positiva de la via de senyalització de Notch" (GO:0045747, Binomial Q-value=2e{-5), que és coherent amb el paper que juga la senyalització de Notch en la promoció de la diferenciació dels progenitors de la nefrona ( Chung et al., 2016). Els 10.083 DAR de tancament detectats no van revelar termes GO significatius basats en els criteris d'importància predeterminats de GREAT (vegeu la figura suplementària 5).

Figura 3. Les diferències en l'accessibilitat de la cromatina caracteritzen E14.5 vs. P0cèl·lules progenitores de nefrona.A) L'anàlisi dels components principals de les mostres ATAC-seq destaca els punts de temps de desenvolupament com una font important de variació. B) Mapa de calor que mostra regions IDR canviants significativament a través de mostres ATAC-seq. Les mostres/columnes E14.5 s'anoten en verd clar i les mostres/columnes P0 s'anoten en verd fosc. C) GO Termes del procés biològic enriquits per a regions genòmiques que s'obren entre E14,5 i P0 segons GRAN, classificats per valor P binomial, FDR Menor o igual a 0,001.

A continuació, vam exploraraccessibilitat de la cromatinaen regions del genoma que contenen promotors i potenciadors de gens amb papers publicats en la diferenciació de cèl·lules progenitores de nefrona. Entre aquests, el factor de transcripció Six2 és fonamental per mantenir la multipotènciacèl·lules progenitores de nefrona(Self et al., 2006), i en totes les mostres, vam observar cromatina accessible que envoltava el seu promotor i un potenciador Six2 conegut ~ 50 kb aigües amunt del lloc d'inici de la transcripció Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Figura 4A, B, zones ombrejades en blau). També observem regions de cromatina accessible al promotor i un potenciador publicat per a la proteïna Gdnf (figura 4D, E), que és secretada pels progenitors de la nefrona per promoure la ramificació dels brots uretèrics (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996). ). Aquest potenciador es troba a ~ 113 kb aigües amunt del promotor del gen i se sap que respon a la senyalització Wnt en el context del desenvolupament de progenitors de nefrona (Park et al., 2012). Tot i que el promotor de Gdnf no canvia significativament amb el temps, el potenciador anotat augmenta significativament la inaccessibilitat. També observem regions de cromatina accessible que envolten un potenciador publicat actiu en progenitors de nefrona per a Eya1 situat ~ 325 kb aigües amunt del TSS del gen (Park et al., 2012) (figura suplementària 6). Eya1 és un factor de transcripció que interacciona amb Six2 per mantenir la multipotència del progenitor de la nefrona (J. Xu et al., 2014).

Observem diversos DAR que no se superposen a les característiques reguladores conegudes, però abasten regions que es preveu que tinguin activitat potenciadora per a gens específics en diversos tipus de cèl·lules de ratolí, tal com s'anota a EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). A més del potenciador publicat d'Eya1 (Park et al., 2012) (figura suplementària 6), un DAR de tancament en un dels introns d'Eya1 (figura 5A-B) inclou una regió que es preveu que tingui activitat potenciadora del gen Eya1 al ratolí. cèl·lules progenitores neuronals i cèl·lules progenitores de granulòcits-monòcits (Gao i Qian, 2020). D'acord amb una reducció de l'activitat potenciadora, hem observat anteriorment que l'expressió d'Eya1 es redueix en la diferenciació dels progenitors de la nefrona mitjançant dades de scRNA-seq E14.5 (figura suplementària 7) (Bais et al., 2020). Això és coherent amb les dades ChIP-seq publicades en progenitors primaris de nefrona E16.5 que mostren una manca de la marca potenciadora activa, H3K27ac, i una manca d'unió de Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7 (Figura 5) (Guo et al. ., 2021). Aquest potenciador potencial també conté petjades de factors de transcripció per a Hoxd10 dins del seu màxim, un factor de transcripció que és essencial per a la diferenciació i integració dels progenitors de la nefrona durant les transicions mesenquimals a epitelials (MET) (Yallowitz et al., 2011).

Un DAR que augmenta la inaccessibilitat al cromosoma 24 se superposa a una regió de cromatina amb una activitat potenciadora prevista per al factor de transcripció Pax8 en cèl·lules cultivades a partir de ronyó de ratolí, epiteli intestinal i úter (Gao i Qian, 2020). Pax8 és parcialment redundant amb Pax2, però es requereix almenys un d'aquests dos factors de transcripció en els progenitors de nefronaronyódesenvolupament (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Abans vam observar que l'expressió de Pax8 augmenta en els progenitors de nefrona diferenciats i diferenciats (figura suplementària 7) i observem un augment significatiu de l'accessibilitat en un DAR que inclou aquesta característica reguladora. Aquesta regió també s'associa amb una marca potenciadora activa, H3K27ac, i la unió de Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7 a les dades publicades de ChIP-seq de progenitors primaris de nefrona E16.5 (figura 5) (Guo et al., 2021). Observem una sèrie de petjades de factors de transcripció que es troben dins del pic d'accessibilitat altament conservat d'aquest DAR, incloses dues per a Sall1, un factor nuclear conegut per afectar la nefrogènesi (Kanda et al., 2014) i set petjades estretament agrupades per al dit de zinc associat a MYC. proteïna (Maz), un factor de transcripció que s'ha demostrat que té efectes dependents de la dosironyódesenvolupament en humans i ratolins (Haller et al., 2018). La taula suplementària 3 conté una llista completa de les regions accessibles que trobem, així com les seves respectives estadístiques d'accessibilitat diferencial, anotacions de gens, exons i promotors que se superposen i llistes de petjades clau de factors de transcripció relacionades amb la nefrogènesi identificades.

Figura 4. Perfils ATAC-seq en llocs reguladors coneguts i putatius. Per a cada panell de dalt a baix, les facetes denoten l'enriquiment de plecs deaccessibilitat de la cromatinaa les mostres E14.5 i P0, amb IDR i DAR identificats com a destacats en blau (IDR invariable) i verd (DAR obert). i vermell (DAR de tancament). La faceta següent mostra anotacions de gens, posicions nucleosomiques (gris) i regions lliures de nucleosomes (vermell) mesurades en mostres agrupades d'E14.5 i P0, i puntuacions de conservació de PhastCon60 (el negre indica 1{{ 12}}0 per cent de conservació, blanc 0 per cent conservat A) Promotor i cos del gen del factor de transcripció Six2. B) Enhancer per a Six2, publicat per Park et. al. C) Potenciador d'accés diferencial per a Gdnf amb una major accessibilitat a P0. D) Promotor de Gdnf.

Figura 5. DARs que superposen nous potenciadors potencials per a gens vinculats a la nefrogènesi. A i C) Els panells mostren un mapa de la regió d'1MB que envolta un gen d'interès, amb gens que codifiquen proteïnes en verd i la interacció potenciadora/promotor proposada com un bucle negre. . B i D) De dalt a baix, els panells representen l'enriquiment de plecsaccessibilitat de la cromatinamesurat en mostres E14.5 i P0, amb IDR ressaltats en verd (obertura) i vermell (tancament), seguides de mesures ChIP-seq en aquestes regions mesurades per Guo et. al. en el progenitor primari de la nefronacèl · lules(Guo et al., 2021). El tercer plafó representa les anotacions de gens (blau) i els elements reguladors predits de Enhancer Atlas 2.0 (vermell), i el quart panell denota les petjades del factor de transcripció identificades a les dades ATAC-seq. El cinquè panell representa nucleosomes (gris) i NFR (vermell), i el panell inferior indica la conservació. A) Regió d'1 MB que conté el cos del gen per a Eya1 i un potencial potenciador d'Eya1 aproximadament 325 kb aigües amunt. B) Una regió de 4,5 kb que conté el potencial potenciador Eya1. C) Regió d'1 MB que conté el locus del gen Pax8 i un potenciador previst. D) Una regió de 4,5 kb que conté el potenciador previst i el seu DAR superposat.

Els dominis associats topològicament ajuden a identificar les relacions potenciadors potencials-miRNA

Els dominis associats topològicament (TAD) són regions a escala megabase d'organització de la cromatina d'ordre superior que resulten de l'empaquetament de la cromatina al nucli en un espai tridimensional (Dixon et al., 2012), i les interaccions potenciador-promotor normalment es restringeixen a elements dins del mateix TAD (Symmons et al., 2014). Hem aproximat els TAD dels progenitors de nefrones mitjançant anotacions generades a partir de cèl·lules mare embrionàries de ratolí (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Per detectar possibles regions reguladores cis de miRNA, vam correlacionar els canvisaccessibilitat de la cromatinaamb miRNA expressat de manera diferent dins del mateix TAD. En total, 42.778 regions accessibles úniques (aproximadament el 92 per cent) es troben dins dels TAD anotats, i d'aquestes 30,626 (al voltant del 72 per cent ) no es superposen a un promotor conegut. Això inclou 2.103 DAR, amb 1.180 i 923 que s'obren i es tanquen al llarg del temps, respectivament. Quinze DAR d'obertura comparteixen un TAD amb un o més miRNA amb una expressió augmentada entre E14.5 i P0, i nou DAR de tancament comparteixen un TAD amb un o més miRNA amb una expressió reduïda. La figura 6 resumeix aquest enfocament i il·lustra les distàncies entre els DAR i el seu miRNA coincident, que oscil·len entre 27 kb i més d'1 mb (mitjana: 447 kb). La taula 1 detalla conjunts de possibles relacions DAR-miRNA, amb un DAR llistat per miRNA coincident.

Entre els parells de potenciadors de miRNA anotats, n'observem tres d'interès particular. En primer lloc, s'ha identificat un DAR d'obertura 120 kb aigües avall de let-7c-5p i 73 kb aigües avall de miR{-125b{-5p, que està associat amb un Six2 lloc d'unió en un conjunt de dades ChIP-seq del progenitor de nefrona E16.5 publicat anteriorment (figura 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p és un dels miRNAs let-7 més alts que detectem, i se sap que la família let-7 també reprimeix les transcripcions Lin28b (Slack i Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Observem que Hmga2 i Meis2 també s'identifiquen com a objectius nous potencials de la família let-7 en progenitors de nefrona (figura 2). També s'ha demostrat que miR-125b{-5p reprimeix les transcripcions de Lin28 en tipus de cèl·lules hematopoètiques i progenitores de ratolí (Chaudhuri et al., 2012). En segon lloc, miR-9-3p és el complement invers a miR-9-5p, un miRNA que recentment s'ha demostrat que protegeix deronyófibrosi dirigint-se a les vies metabòliques (Fierro-Fernández et al., 2020). Detectem una disminució superior a 10-vegades en les transcripcions miR-9-3p entre els progenitors de la nefrona E14,5 i P0, i hem identificat un element regulador potencial a uns 249 kb de distància (figura 7B). Observem petjades de factors de transcripció per a Snai1 i Snai2 al DAR associat, que s'ha demostrat que promouen les transicions epitelial-mesenquimals (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Finalment, vam fer coincidir miR-181a-2-3p amb un possible locus regulador cis intergènic de 131 kb aigües amunt al cromosoma 2, on observem una petjada del factor de transcripció per al factor de transcripció Wt1, un regulador clau del progenitor de la nefrona. supervivència (Kreidberg et al., 1993) i unió a Six2 en un conjunt de dades ChIP-seq del progenitor de nefrona E16.5 publicat (figura 7C) (Guo et al., 2021).

Taula 1. Canvis d'expressió de miRNA, relacionats amb un o més DAR en el mateix TAD.

Figura 6. Trobar parells de potenciador candidats-objectiu-miRNA. A) Diagrama de flux que denota com es van prioritzar les regions d'accessibilitat per a una possible regulació de l'expressió de miRNA. B) Ubicacions genòmiques de cada miRNA seleccionat en relació amb el seu potenciador candidat (banda vertical taronja). L'escala del seu canvi de plec logarítmic es mostra a l'eix y, i els miRNA amb expressió creixent o decreixent es destaquen en verd i vermell, respectivament.

Figura 7. Quatre parells de miRNA objectiu potenciador potencial. Els TAD es destaquen en gris, s'alineen per punts de partida i es dibuixen a la mateixa escala per il·lustrar la mida relativa. Els gens coneguts d'Ensembl es mostren en violeta, i les regions més fosques indiquen exons. L'accessibilitat relativa a E14.5 i P0 es mostra com a gràfics de barres per sobre i per sota de la línia negra horitzontal, respectivament, així com en gràfics inserits que il·lustren l'acumulació al DAR especificat juntament amb les dades de ChIP-seq publicades per Guo et al. . al. (Guo et al., 2021). Les petjades dels factors de transcripció identificades per HINT s'enumeren en pancartes taronges. Els diagrames de barres en panells separats a la dreta indiquen l'expressió de miRNA (verd) i els esdeveniments normalitzats d'inserció de Tn5 a les regions potenciadores proposades (taronja). A) El membre de la família let-7 let-7c-5p està molt altament expressat encèl·lules progenitores de nefronai coincideix amb el "pic_54636" a 119 kb de distància en una regió intergènica. B) miR-9-3p coincideix amb un DAR a 249 kb de distància. C) miR-181a 2-3p es troba a 131 kb de distància del "pic_5887", un possible potenciador intergènic.

Discussió

En aquest estudi, hem intentat identificar simultàniament un nou miRNA que contribueixi a la cessació de la nefrogènesi, juntament amb possibles característiques reguladores cis. Hem identificat 114 miRNAs que s'expressen de manera diferent a les cèl·lules progenitores de nefrona, així com 2,103 DAR, a E14.5 en comparació amb P0ronyons. Observem múltiples característiques que prediuen nous potenciadors putatius per als gens Eya1 i Pax8cèl·lules progenitores de nefrona. Finalment, hem identificat coherentsaccessibilitat de la cromatinai els canvis d'expressió de miRNA per a 33 parells de miRNA i DAR, inclosos let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p i miR-9-3p i presenten gens objectiu putatius expressats en progenitors de nefrona per a miRNA expressats de manera diferent. En conjunt, les nostres dades demostren que els canvis intrínsecs als progenitors de la nefrona i que depenen de l'etapa de la nefrogènesi es reflecteixen en l'entorn de cromatina de la cèl·lula progenitora i en el seu transcriptoma de miRNA.

Entre els canvis que observem en el transcriptoma del miRNA del progenitor de la nefrona, observem un ampli augment de l'expressió a la família let{{0}} a mesura que els progenitors envelleixen. Això és coherent amb els informes anteriors: la proteïna Lin28b i la família let-7 de miRNAs són mútuament antagòniques i formen un interruptor biestable que governa l'expressió let-7 en mamífers (Zhu et al., 2011) i en progenitors de nefrones, el canvi cap a l'augment de l'expressió let-7 afecta directament el moment de la cessació de la nefrogènesi (Yermalovich et al., 2019). També observem una expressió més gran de miR-125b{-5p, que també se sap que reprimeix l'expressió de Lin28b en altres contextos cel·lulars (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). La família let-7 i miR{-125b{-5p es troben entre els 114 miRNA que s'expressen de manera diferent entre E14,5 i P0 en progenitors de nefrons, cosa que suggereix el paper dels miRNAs en el desenvolupament dels progenitors de nefrones. no es limita a let-7/Lin28b. Per exemple, els miRNAs que disminueixen l'expressió inclouen dos membres de la família miR-200, que s'ha informat que tenen un paper en la diferenciació de podòcits (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p i miR-429-3p. Més endavant, observem una disminució de l'expressió de miR-126a 5p, que se sap que promou la vasculogènesi (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Això pot reflectir el llinatge mesenquimal comú dels progenitors vasculogènics i nefrònics, i el compromís d'un subconjunt d'aquestes cèl·lules per convertir-se en progenitors de nefrona.

Les anàlisis de vies dels objectius genètics predits de canvis de miRNA mitjançant DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) mostren senyalització MAPK i TGF d'enriquiment, tots dos reguladors clau dels progenitors de nefrona (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018). ). Diverses altres vies KEGG també estan sobrerepresentades entre les dianes genètiques previstes dels miRNAs regulats a l'alça, incloses les vies relacionades amb la matriu extracel·lular, el citoesquelet d'actina i l'adhesió focal: totes les facetes crucials de la migració cel·lular, diferenciació, ramificació, unió, polarització i proliferació. (Rozario & Desimone, 2010). Els gens associats a l'ECM estan dirigits per alguns dels miRNAs més altament expressats i que augmenten significativament que detectem, inclosa la transcripció més alta que detectem: miR-196a-5p. Se sap que miR-196a-5p apunta a Col1a1, Col1a2 i Col3a1, gens que estan regulats a l'alça en progenitors de nefrona amb deficiència de Pax2-que pateixen transdiferenciació a l'estroma renal (Naiman et al. al., 2017). Per tant, l'augment de l'expressió miR-196a-5 pot tenir un paper a l'hora de reforçar els límits del llinatge a mesura que els progenitors envelleixen. A més, identifiquem noves interaccions potencials diana miRNA-mRNA que poden contribuir a la cessació de la nefrogènesi, inclosa la regulació positiva de la família let-7 que pot orientar-se a Hmga2 i Meis2 (associada a la proliferació cel·lular) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco i Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) a mesura que envelleixen els progenitors de la nefrona. Hmga2 no té cap paper conegutronyódesenvolupament. Tanmateix, es creu que Meis2 té una superposició funcional amb el factor de transcripció relacionat Meis1, que se sap que és necessari per al desenvolupament del ronyó (Hisa et al., 2004). També observem la regulació a la baixa dels miRs (miR-34b{-5p, miR-983p i miR{-200a-3p) que poden orientar-se Jag1, que se sap que està regulat i és important en la diferenciació de nefrones (Chung et al., 2016).

Juntament amb el transcriptoma canviant del miRNA, vam mesurar simultàniament els canvis en l'entorn de cromatina de la cèl·lula progenitora de la nefrona entre E14.5 i P0. Descrivim dos potenciadors nous putatius per a Eya1 i Pax8, basats en (i) la seva proximitat a aquests promotors de gens, (ii) els seus respectius canvis enaccessibilitat de la cromatinadurant el desenvolupament en línia amb els canvis d'expressió gènica pseudotime durant la diferenciació, (iii) petjades deronyófactors de transcripció del desenvolupament, (iv) conservació de la seqüència, (v) evidència de la funció potenciadora en altres teixits/tipus de cèl·lules de Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020) i (vi) Dades de ChIP-seq a E16 .5 progenitors de nefrona per a una marca de potenciadors actius (H3K27ac) i unió del factor de transcripció de Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7. Observem una disminució de l'accessibilitat de la cromatina per al potenciador d'Eya1, que és coherent amb el paper d'Eya1 en la promoció de la multipotència del progenitor de la nefrona i amb informes que la pèrdua d'Eya1 dóna lloc a l'epitelització primerenca de la població progenitora (J. Xu et al., 2014; PX). Xu et al., 1999). Pax8 i el seu homòleg Pax2 contribueixen a l'especificació del llinatge dels progenitors de la nefrona (Bouchard et al., 2002), i els progenitors de la nefrona sense almenys un d'aquests gens no patiran MET (Narlis et al., 2007). L'augment de l'accessibilitat de la cromatina que detectem per al putatiu potenciador de Pax8 és coherent amb l'augment de l'expressió de Pax8 a l'epiteli renal a mesura que es diferencien les nefrones.

L'anàlisi d'enriquiment (McLean et al., 2010) de les DAR va revelar "Regulació de la diferenciació epitelial" com el terme més enriquit entre les regions de cromatina obertes, cosa que indica que els DAR que detectem poden contenir característiques reguladores que impulsen o responen a senyals de diferenciació i desenvolupament decèl·lules progenitores de nefronaen tipus de cèl·lules epitelials. La senyalització Notch es troba entre els termes GO enriquits més significativament identificats entre els DAR d'obertura, i en els progenitors de nefrones, se sap que aquesta via reprimeix l'expressió Six2 i promou la diferenciació de cèl·lules progenitores de nefrones (Chung et al., 2016). Entre els gens implicats en aquesta via hi ha Jag1, un lligand clau en la senyalització de Notch, l'expressió del qual s'ha informat que està inversament correlacionada amb l'expressió de Six2 i Hes1 (Chung et al., 2016). Observem que Jag1 és un objectiu anotat per a tres miRNAs amb expressió creixent (miR34b-5p, miR98-3p i miR200a-3p, figura 2). Finalment, observem l'enriquiment de gens associats a la remodelació dels vasos sanguinis i la morfogènesi en l'obertura de DAR, tot i que això sembla ser una conseqüència dels gens compartits entre aquestes vies de desenvolupament i la diferenciació de cèl·lules epitelials, incloent Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 i Hey2.

Canvis enaccessibilitat de la cromatinaentrecèl·lules progenitores de nefronas'han mesurat en estudis anteriors (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

En general, els nostres resultats són coherents amb aquests estudis anteriors, que destaquen els gens relacionats amb Notchsignaling i Pax{0}}. No obstant això, cal destacar que hi ha algunes diferències experimentals en aquests estudis anteriors en comparació amb aquest informe. L'aïllament dels progenitors de nefrones que expressen GFP mitjançant una cèl·lula activada per fluorescència del ratolí reporter del transgen Six2-TGC es pot confondre amb la constatació que aquest al·lel té una disminució del nombre de nefrones d'aproximadament un 45 per cent (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). A més, s'ha demostrat que els progenitors de nefrones cultivats (creïts amb dosis baixes o altes de CHIR) tenen transcriptomes diferents dels progenitors de nefrones primaris, cosa que suggereix que la seva accessibilitat a la cromatina també seria diferent (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Atès que l'objectiu del nostre estudi era entendre com els canvis en el paisatge de la cromatina afecten l'expressió de miRNA en els progenitors de la nefrona primerenca versus la tardana, era necessària l'anàlisi dels progenitors primaris de la nefrona.

Cistanche és millor per als ronyons

En combinar aquests canvis observats en l'entorn de la cromatina amb canvis coincidents en l'expressió de miRNA, impliquem diversos parells de potenciadors de miRNA putatius en el cessament de la nefrogènesi per a un estudi posterior. Els miRNAs miR-125a-5p i let-7c{-5p, per exemple, veuen un augment significatiu de l'expressió entre E14.5 i P0 , i això es recapitula per la creixent inaccessibilitat d'un DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) al mateix TAD. Aquest DAR també s'associa amb un lloc d'unió Six2 (Guo et al., 2021) i pot indicar un potenciador que afecta l'expressió de miR-125a-5p i/o let{{18} }c-5p, que al seu torn podria promoure la diferenciació mitjançant la repressió de Lin28b. De la mateixa manera, observem un possible potenciador de miR 181a, que se sap que modula l'expressió de renina en humans (Marques et al., 2015) i s'ha considerat un objectiu terapèutic per reduir la nefrotoxicitat a causa de la seva capacitat per reprimir BIRC6 i l'apoptosi (Liu et al., 2015). al., 2018). Finalment, observem un DAR de tancament associat amb miR-9-3p que té petjades de factor de transcripció per a les proteïnes que responen a la senyalització Wnt Snai1 i el complement invers de Snai2.miR-9-3p, miR-9-5p, se sap que protegeixronyóS'ha demostrat que la fibrosi (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 i Snai2 promouen la metàstasi del carcinoma en cèl·lules de càncer de pell de ratolí (Olmeda et al., 2008) i afavoreixen les transicions epitelial-mesenquimal (EMT) en pacients amb càncer. (Sundararajan et al., 2019), mentre que se sap que miR-9 promou l'angiogènesi i la migració de cèl·lules endotelials tumorals (Zhuang et al., 2012). Pot existir un mecanisme en què l'augment de la senyalització Wnt produeix una reducció de l'expressió de Snai1 i Snai2, que al seu torn redueix l'expressió de miR-9-3p per donar suport a la diferenciació dels progenitors de la nefrona.

El nostre estudi va identificar de manera exhaustiva els canvis en el paisatge de la cromatina i el transcriptoma del miRNA dels progenitors de la nefrona durant el desenvolupament embrionari, i hem identificat regions reguladores cis candidates i miRNA que poden tenir un paper en el cessament de la nefrogènesi. Les anàlisis d'enriquiment tant per a les dades d'ARNm-seq com per a ATAC-seq proporcionen pistes atractives sobre els mecanismes que poden estar implicats, com ara vies que regulen la diferenciació dels progenitors de la nefrona, com ara Notch i TGF-. També informem de dos nous elements reguladors putatius per a Eya1 i Pax8, gens coneguts per ser importantsronyódesenvolupament i seqüències reguladores potencials per a miRNA clau que estan implicades en el cessament de la nefrogènesi.

Mètodes

Soques de ratolí

Les femelles embarassades de tipus Wildtype CD-1 es van obtenir de Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, EUA, RRID: MGI:5659424) ironyonses van recollir de les cames el dia embrionari E14.5 o P0. Tots els animals es van allotjar al vivari del Centre de Recerca Rangos de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh (Pittsburgh, PA, EUA) i tots els experiments amb animals es van dur a terme d'acord amb les polítiques del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Pittsburgh. El sexe de cada embrió o cadell es va identificar mitjançant la realització de PCR en ADN genòmic aïllat dels retalls de la cua mitjançant els primers següents per al gen del cromosoma Y Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ i SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA, com -3' publicat anteriorment (McFarlane et al., 2013).

Seqüenciació i anàlisi d'ARN petit

ARN total aïllat delcèl·lules progenitores de nefronaLa resta després d'eliminar la fracció de cèl·lules ATAC-seq es va enviar al Health Sciences Sequencing Core de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh per a la preparació de la biblioteca mitjançant el kit de preparació de biblioteques QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{10}}2). La seqüenciació d'un sol extrem de biblioteques d'ARNm-seq es va realitzar en un Illumina NextSeq500, i les biblioteques es van seqüenciar a una profunditat d'aproximadament 50 milions de lectures d'un sol extrem per biblioteca. A continuació, les lectures seqüenciades es van alinear al genoma mm10 del ratolí mitjançant el paquet Rsubread (Liao et al., 2019) (versió 2.0.1) i es van anotar a miRNA conegut llistat a miRBase (versió 22) (Kozomara i Griffiths-Jones, 2014) amb la funció featureCounts del paquet Rsubread. L'expressió diferencial de miRNA conegut es va mesurar mitjançant el paquet DESeq2 R (versió 1.26.0) (Love et al., 2014). La fracció de lectures alineades anotades al miRNA conegut, així com la fracció d'embrions femenins per mostra, es van incloure com a cofactors en el model de prova enviat a DESeq2. Aleshores es van identificar miRNA expressats de manera diferent mentre es controlava la taxa de descobriment fals al 5 per cent, i la seva direcció de canvi (augmentant versus disminució) es va determinar en funció del seu valor de canvi de plec ("augmentant" que indica una expressió més alta a P0 en comparació amb E14.5) . L'enriquiment de les vies reguladores entre els objectius genètics predits de miRNA amb una expressió significativament creixent i decreixent es va calcular mitjançant les eines DIANA miRPath versió 3.0 (Vlachos et al., 2015). Les transcripcions objectiu previstes per a miRNA es van recuperar dels dipòsits TargetScan (Agarwal et al., 2015) i miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Aïllament del progenitor de la nefrona

Ronyonses van disseccionar a partir de camades d'embrions {{0}} E14.5 o cries P0, i cada camada es va considerar una mostra. Es va utilitzar un ronyó per mostra per a l'aïllament total de l'ARN per utilitzar-lo com a "control del ronyó sencer" en anàlisis posteriors (vegeu més avall). Es van recollir un total de tres mostres en cada moment. Les cèl·lules corticals es van aïllar de cada mostra mitjançant la classificació de cèl·lules activades per magnètica (MACS) tal com es va publicar anteriorment (Brown et al., 2011). Breument, els ronyons es van sotmetre a una digestió parcial amb col·lagenasa A 2 mM (Roche 11088793001) i pancreatina 3,5 mM (Sigma P1625) en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) durant 15 minuts a 37 graus. La reacció de digestió es va aturar amb sèrum boví fetal al 100% (FBS) i es va recollir la suspensió cel·lular i es va tornar a suspendre en solució salina tamponada amb fosfat de Dulbecco (DPBS) freda amb un inhibidor de la proteasa de fluorur de fenilmetilsulfonil (PMSF) 1 mM (Sigma-Aldrich 108030910870). Les cèl·lules es van rentar i es van tornar a suspendre en un tampó d'aïllament gelat que constava d'un 2 per cent de FBS en PBS, després es van incubar amb perles magnètiques (kit Dynabeads FlowComp Flexi, ThermoFisher 11061D) biotinilats a anticossos per a Integrin alfa 8 (Itg 8, R&D Systems) AF40766 utilitzant el kit d'etiquetatge de proteïnes de biotina DSB-X (ThermoFisher D-20655). Els progenitors de nefrona lligats a aquestes perles es van aïllar tal com es va publicar anteriorment (Hemker et al., 2020) i es van agrupar a través dels ronyons per a cada mostra. Una alíquota de 50,000 cèl·lules progenitores de nefrona es va processar immediatament a través delaccessibilitat de la cromatinaprotocol de preparació de la biblioteca (vegeu a continuació) i l'ARN total es va extreure de la suspensió cel·lular restant mitjançant el Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Per confirmar l'enriquiment decèl·lules progenitores de nefronaen relació amb altres tipus de cèl·lules, l'ARN total es va aïllar dels progenitors de la nefrona així com del sencerronyons(control del ronyó sencer, vegeu més amunt) i es va realitzar PCR de transcripció inversa quantitativa (qRT-PCR) per als marcadors següents: marcadors progenitors de nefrona Six2 i Cited1 (L. Huang et al., 2016), i per a Lhx1, Pdgfr, Pecan i Caleb que marquen vesícula renal (Brunskill et al., 2014), estroma renal (S. Chen et al., 2015), endotelial (Kobayashi et al., 2008) i brot ureter (Cebrian et al., 2014a). ) cèl·lules, respectivament; vegeu també la figura suplementària 1. Gapdh (Barber et al., 2005) es va utilitzar com a gen de neteja i la quantificació relativa es va calcular mitjançant el mètode 2-ΔΔCt (Livak i Schmittgen, 2001). Els primers per a aquestes transcripcions s'inclouen a la taula 2.

Taula 2. Cebadors RT-PCR.

Accessibilitat de la cromatinapreparació de la biblioteca

Aproximadament 50,000cèl·lules progenitores de nefronaes van utilitzar per generar cada biblioteca de seqüenciació per ATAC-seq mitjançant el Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) amb modificacions segons un mètode publicat anteriorment (Buenrostro et al., 2013). En resum, les cèl·lules es van suspendre en un tampó de lisi no iònic fred amb gel que constava de 10 mM de Tris, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2, 1 mM d'inhibidor de proteasa PMSF i un 0,05 per cent de Triton X-100 en volum durant 10 minuts per lisar la cèl·lula. membranes deixant intactes les membranes nuclears. Els nuclis progenitors de nefrona intactes es van tornar a suspendre en un tampó de transposició que contenia l'enzim transposasa i es van incubar a 37 graus durant 30 minuts. L'ADN genòmic lliure alliberat pel procés de transposició es va purificar mitjançant el kit de purificació MinElute PCR (Qiagen 28004) i després es va indexar amb imprimadors d'índex directe (i7) i invers (i5) del kit d'índex Nextera (Illumina FC-121-1011). La lligadura d'índex i l'amplificació de fragments es van aconseguir mitjançant el programa de cicle tèrmic d'amplificació per PCR del mètode.

Per determinar el nombre òptim de cicles d'amplificació necessaris per a la biblioteca ATAC-seq, es va realitzar una reacció lateral qPCR mitjançant SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) i un 96-well C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) per calcular la normalització. valor reporter (Rn) per a cada cicle. El nombre de cicle en què la reacció va assolir un terç de la seva fluorescència màxima es va identificar com el nombre òptim de cicles d'amplificació restants, i el volum restant de la reacció de transposició ATAC-seq indexada es va sotmetre a aquest nombre de cicles addicionals a l'amplificació final. programa. Les biblioteques finals es van purificar mitjançant perles magnètiques Ampure XP (Beckman Coulter A63881).

Accessibilitat de la cromatinaseqüenciació

La seqüenciació d'extrems aparellats de la biblioteca ATAC-seq es va realitzar en un Illumina NextSeq500 pel nucli de seqüenciació de ciències de la salut de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh, multiplexat amb concentracions de biblioteca que s'espera que donin 90 milions de lectures aparellades per mostra. . Les lectures es van retallar de qualitat mitjançant TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (versió 0.4.3) en mode "--emparellat" i amb la configuració predeterminada. Les lectures es van alinear amb el genoma mm10 (Church et al., 2011) mitjançant Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (versió 2.3.1) amb la configuració "--local -q -X 2000 -- m". Les lectures resultants de duplicats de PCR del mateix fragment d'ADN es van marcar mitjançant la funció MarkDuplicates de Picard Tools (Broad Institute, 2016) (versió 2.10.9) amb la configuració predeterminada. Les lectures que mapejaven de manera ambigua a més d'una ubicació del genoma es van assignar aleatòriament a una d'aquestes ubicacions si hi havia menys de quatre possibilitats, i d'altra manera es van eliminar (ENCODE, nd) (utilitzant un script Python disponible a https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) amb la configuració "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (versió 1.3.1) es va utilitzar per filtrar lectures duplicades, no mapejades, orfes i mitocondrials, així com per ordenar i indexar fitxers BAM. El control de qualitat de les dades ATAC-seq va seguir les directrius ATAC-seq del projecte ENCODE (ENCODE, nd), i les biblioteques de mostres es van mostrejar aleatòriament per contenir 31 milions de lectures d'extrem aparellat per tal de normalitzar les diferències de mides de la biblioteca.

Cistanche pot prevenir la infecció renal

Identificació de regions de cromatina accessibles

Els fitxers BAM que contenien lectures ATAC-seq filtrades es van convertir en format BED d'extrem aparellat mitjançant Bedtools" (Quinlan & Hall, 201{{2{0}}) (versió 2.26.0) "bombejat" ' funció amb la configuració "- bed pe -mate1". Les regions de cromatina accessible es van identificar mitjançant l'eina d'anàlisi basada en models de ChIP-seq (MACS2, versió 2.1.1.20160309) de l'algoritme de trucada de pic ampli (Zhang et al., 2008), amb la configuració "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --ample --desplaçament 37 --mida del text 75 --conserva tot el --model". Per identificar regions accessibles d'alta confiança, es van realitzar comparacions per parelles (de cada combinació de rèpliques d'un punt de temps determinat) i es va calcular la taxa de descobriment irreproducible (IDR) (Q. Li et al., 2011) utilitzant un mètode disponible públicament. Implementació de Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) amb la configuració "--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --llit de tipus fitxer de sortida". Concretament, per a cada punt temporal es va enviar un fitxer BED concatenat de totes les regions accessibles mitjançant l'argument "--llista de pics" per a cada comparació (per exemple, quan es comparen dues mostres E14.5, tots els pics amples E14.5 entre les tres rèpliques s'utilitzen). Les regions d'accessibilitat que eren coherents per IDR en almenys dues comparacions de rèpliques per parelles (amb un mínim del 20 per cent de superposició) es van combinar en un conjunt unificat de regions accessibles d'alta confiança ("regions IDR").

Canvis en les regions de cromatina accessibles

L'accessibilitat de cada regió IDR dins d'una mostra determinada es va quantificar comptant el nombre d'esdeveniments de transposició que es produeixen mentre es normalitza el contingut de la seqüència GC a través de les mostres. Això es va aconseguir mitjançant un script personalitzat (disponible al dipòsit de programari adjunt, vegeu dades addicionals). Els canvis en aquesta accessibilitat es van determinar després comparant aquests valors a través de punts de temps mitjançant el paquet de programari Limma-voom (versió 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Per tenir en compte el sexe de l'embrió, la fracció d'embrions femenins de cada mostra es va incloure com a cofactor en models lineals utilitzats per a l'anàlisi d'accessibilitat diferencial, i es va eliminar com a efecte de lot en visualitzacions mitjançant la funció d'efecte d'eliminació de lots del paquet Limma. Es va considerar que les regions de cromatina d'accés diferent (DAR) s'obren significativament (augment de l'accessibilitat entre E14.5 i P0) o tancaven (disminució de l'accessibilitat entre E14.5 i P0) quan es controlava la taxa de descoberta falsa al 10 per cent. . Les anàlisis d'enriquiment funcional de les regions genòmiques d'obertura i tancament es van determinar enviant les coordenades respectives a l'eina d'enriquiment d'anotacions de regions genòmiques (GREAT, disponible a http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010). ). Les anotacions dels potenciadors coneguts i predits es van recuperar dels dipòsits FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) i EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Petjades del factor de transcripció

Les petjades del factor de transcripció es van identificar agrupant tots els fitxers BAM des del mateix punt de temps, i després executant el programari d'identificació de petjades TF basat en Hmm (HINT) de la caixa d'eines de genòmica reguladora (versió 0.12.3), concretament el model de petjada per a ATAC -seq data (disponible a www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Aquest programari s'ha executat amb la configuració "{8}}organisme=mm10 --a continuació --parellat d'empremta a la dreta". A continuació, es van anotar les petjades amb motius d'unió de ratolí coneguts de la base de dades HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) mitjançant la funció de concordança de motius de HINT amb la configuració "anàlisi del motiu dret que coincideix amb --organisme=mm10". Es van excloure les petjades amb puntuacions HINT inferiors a 10. Finalment, es van mesurar els patrons d'activitat diferencials entre les petjades coincidents amb motius utilitzant la funció diferencial del programa RGT-HINT, amb la configuració "{24}}organisme=mm10 --bc {{27} del diferencial de la pista dreta }NC 12 --perfils de sortida". Es van identificar els nivells d'activitat que canvien significativament a partir d'un tall de valor p de 0,05 (mètode Friedman-Nemeny).

Cistanche pot millorar la funció renal

Configuració nucleosòmica

Les lectures alineades des del mateix punt de temps es van agrupar en un únic fitxer BAM i es va utilitzar el paquet NucleoATAC (versió 0.3.4) per identificar patrons de longituds de lectura que suggereixen tant les diades nucleosomiques lligades com les regions lliures de nucleosomes ( NFRs) (Schep et al., 2015). Aquest programari s'ha executat amb la configuració predeterminada. Els nucleosomes es van anotar com la regió de 146 pb centrada al voltant de cada diada anomenada nucleosoma.

Expressió d'ARN unicel·lular

Les dades d'expressió gènica unicel·lular es van processar per a un manuscrit anterior (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) i es van recuperar del Gene Expression Omnibus (GEOIDE GSE158166). Les dades processades incorporades a la figura suplementària 7 inclouen tipus de cèl·lules, nivells d'expressió gènica, incrustacions de dimensions baixes (tSNE) i anotacions pseudotimes relatives a la trajectòria establerta entre grups de progenitors de nefrona proliferant i diferenciant. Es va accedir a les dades i es van organitzar mitjançant el paquet SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

Interaccions miRNA-ARNm en l'envelliment i la diferenciació de les cèl·lules progenitores de la nefrona

Gens amb expressió canviant entre autorenovació, preparació i diferenciaciócèl·lules progenitores de nefronaes van obtenir a partir de les taules suplementàries 3 i 4 publicades per Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Seqüenciació de la immunoprecipitació de la cromatina en progenitors primaris de nefrona

Les dades de seqüenciació d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP-seq) per a la unió -catenina, Lef1, Six2 i Tcf7 en progenitors primaris de nefrona es van recuperar dels fitxers BedGraph dins del dipòsit GEO (GSE131119) per a Guo et al., 2021. Els valors de senyal d'enriquiment de plecs eren mitjans. a través de mostres repetides.

Detecció d'elements reguladors que afecten l'expressió de miRNA

Per detectar potenciadors potencials de miRNA, vam anotar miRNA i DAR amb els dominis associats topològicament (TAD) en què es troben en funció d'anotacions mm10 de cèl·lules mare embrionàries de ratolí, descarregats des del 3D Genome Browser (disponible a http://3dgenome). .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Regions deaccessibilitat de la cromatinai els miRNA es van considerar potenciadors candidats: parells de miRNA si ocupaven el mateix TAD i mostraven canvis consistents en l'accessibilitat i l'expressió (augmentant l'accessibilitat amb l'augment de l'expressió de miRNA i viceversa). Els DAR només es consideraven com a possibles "característiques reguladores" si no es solapaven amb un promotor o un exó conegut. Es van prioritzar les parelles potencials de miRNA i elements reguladors putatius si 1) entraven dins del mateix TAD i 2) experimentaven canvis significatius entre E14.5 i P0 (augment de l'expressió de miRNA i augment de l'accessibilitat de la regió IDR, i viceversa) .

Agraïments

Shelby Hemker i Abha Bais van contribuir al disseny experimental. La seqüenciació per ATAC-seq i mRNA-seq va ser realitzada pel Health Sciences Sequencing Core a l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh.

Interessos competitius

No s'han declarat interessos oposats

Finançament

AC va comptar amb el suport de subvencions de l'Institut Nacional de Diabetis i Digestiu iRonyóMalalties de l'Institut Nacional de Salut (T32DK061296-17). DK va comptar amb el suport de subvencions de l'Institut Nacional de Ciències Mèdiques Generals de l'Institut Nacional de Salut (R01GM115836). JH va comptar amb el suport de subvencions de l'Institut Nacional de Diabetis i Malalties Digestives i Renals de l'Institut Nacional de Salut (R01DK103776 i 125015). DMC va comptar amb el suport d'un Premi al Desenvolupament de Carreres de la Xarxa d'Estudis de Síndrome Nefròtic (NEPTUNE) i de la Beca Postdoctoral del Consell Assessor de Recerca de l'Hospital Infantil de Pittsburgh. YP va comptar amb el suport de subvencions de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh i el North American Mitocondrial Disease Consortium.

Disponibilitat de dades

Els potenciadors del ratolí previstos es van recuperar de FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; fitxer disponible aquí), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; fitxer disponible aquí) i EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980); bases de dades. El genoma del ratolí mm10 i les seves anotacions es van descarregar mitjançant el projecte de genomes Illumina (disponible aquí). El fitxer de cadena per elevar les coordenades mm9 a mm10 es va recuperar del navegador del genoma UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; fitxer disponible aquí). Les anotacions TAD de cèl·lules mare embrionàries del ratolí es van recuperar del 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; fitxer disponible aquí). Els objectius de transcripció de miRNA predits es van recuperar de TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, fitxer disponible aquí) i de la versió 6 de miRDB (DOI: 10.1093/var/gkz757, fitxer disponible aquí). Les dades ATAC-seq incloses les ubicacions IDR/DAR, les anotacions i els resultats d'enriquiment diferencial estan disponibles a GEO (GSE168339), així com les dades de mRNA-seq incloses les anotacions i els resultats d'expressió diferencial (GSE168342). El codi informàtic utilitzat per processar i analitzar dades i per generar xifres està disponible a https://bitbucket.org/clugstonA/mirna{32}}enhancers

Bibliografia

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A. i Cippitelli, M. (2019). El factor de transcripció homeobox MEIS2 és un regulador de la supervivència de les cèl·lules canceroses i l'activitat dels IMiD en el mieloma múltiple: modulació per inhibidors de proteïnes Bromodomain i Extra-Terminal (BET). Mort i malaltia cel·lular, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW i Bartel, DP (2015). Predicció de llocs objectiu de microRNA efectius en ARNm de mamífers. ELvida. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T. ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Un atles de potenciadors actius a través de tipus de cèl·lules i teixits humans. Nature, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Trim abundància. En Bioinformàtica. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_abundant

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. i Kostka, D. (2020). La seqüenciació d'ARN unicel·lular revela l'activitat diferencial del cicle cel·lular en poblacions cel·lulars clau durant la nefrogènesi. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA i Clark, BJ (2005). GAPDH com a gen de neteja: anàlisi de l'expressió d'ARNm de GAPDH en un panell de 72 teixits humans. Genòmica fisiològica. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). Funcions reguladores i de reconeixement de dianes de MicroRNA. Cel·la, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD i Hoy, WE (2011). Nombre de nefrona humana: implicacions per a la salut i la malaltia. Nefrologia pediàtrica, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ i Li, Q. (2015). Taxa de descobriment irreproduïble (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A. i Busslinger, M. (2002). Especificació del llinatge nefric per Pax2 i Pax8. Gens i desenvolupament. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

De: Journal Pre-proof

2021 Publicat per Elsevier Inc.