L'extracte de Cistanche Deserticola augmenta la formació òssia en osteoblasts
Mar 05, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Liun, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Estany-Yun Houn, Chi-Ming Wuun, Wen-Chi Chend,Yi-Chin Fonga,ei Chih-Hsin Tangf,c
Abstracte
Objectius:Hem investigat l'efecte deCistanche deserticola Ma. (CD) sobre la formació òssia per osteoblasts cultivats.MètodesL'assaig de formació de nòduls mineralitzats es va utilitzar per examinar els efectes in vitro del CD en la formació òssia. La fosfatasa alcalina (ALP), les proteïnes morfogenètiques òssies (BMP)-2 i l'expressió d'ARNm d'osteopontina (OPN) van ser analitzades mitjançant la reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real. El mecanisme d'acció de l'extracte de CD es va investigar utilitzant western blotting. L'efecte anti-osteopomàtic in vivo de l'extracte de CD es va avaluar en ratolins ovariectomitzats.Resultats clauL'extracte de CD no va tenir cap efecte sobre la proliferació, migració o cicatrització de ferides d'osteoblasts cultivats, però va augmentar l'ALP, BMP-2 i l'ARNm OPN i la mineralització òssia. Els inhibidors de la proteïna quinasa activada per mitogen (MAPK) o factor nuclear (NF) -kB van reduir la formació òssia induïda per extracte de CD i l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN. No obstant això, l'extracte de CD no va afectar l'osteoclastogènesi. A més, l'extracte de CD va prevenir la pèrdua òssia induïda per l'ovariectomia in vivo.ConclusionsEl CD pot ser un nou agent de formació òssia per al tractament de l'osteoporosi.
Introducció
L'os és un teixit complex compost per diversos tipus cel·lulars que se sotmeten a un procés continu de renovació i reparació anomenat "remodelació òssia". Dos tipus cel·lulars principals responsables de la remodelació òssia són els osteoclasts, que reorbeixen l'os, i els osteoblasts, que formen un nou os. La remodelació òssia està regulada per diverses hormones sistèmiques (per exemple, hormona paratiroïdal, 1, 25-hidroxivitamina D3, hormones sexuals i calcitonina) i factors locals (per exemple, òxid nítric, prostaglandines, factors de creixement i citocines). [1]
L'osteoporosi resulta quan la reorció i la formació de l'os estan descoordinats i l'excés de ruptura òssia supera la construcció òssia. [2] Els tractaments actuals per a l'osteoporosi inclouen bisfosfonats, calcitonina i estrògens, que són inhibidors de la reorpció òssia que mantenen la massa òssia inhibint l'activitat osteoclast. [3] No obstant això, l'efecte d'aquests fàrmacs en l'augment o recuperació de la massa òssia és relativament petit, certament no més del 2% per any. [3] Per tant, hi ha una necessitat d'agents de construcció òssia, com el teriparatida, que estimulin la formació de nous os i corregeixin el canvi en la microarquitectura trabecular que és característic de l'osteoporosi establerta. [4,5] Com que la nova formació òssia és principalment una funció de l'osteoblast, els agents que actuen augmentant la proliferació de cèl·lules del llinatge osteoblastic o induint la diferenciació dels osteoblasts poden millorar la formació òssia. [5,6]
Tot i que els mecanismes de l'osteoporosi encara no estan clars, és probable que estiguin relacionats amb la disminució de la disponibilitat o els efectes dels factors de creixement ossi, com les proteïnes morfogenètiques òssies (PMC). [7] Els BMP, que estan estructuralment relacionats amb la superfamília trans-formadora del factor de creixement b, es van identificar originalment per la seva capacitat d'induir la formació òssia ectòpica en rosegadors. [8] Els PMC juguen un paper important en la formació òssia i la diferenciació de cèl·lules òssies estimulant l'activitat de la fosfatasa alcalina (ALP), així com la síntesi de proteoglica, col·lagen i osteopontina (OPN). [9] Un estudi recent va trobar un vincle entre l'osteoporosi i els polimorfismes específics en els gens BMP-2, ALP i OPN, el que suggereix que estan associats amb el desenvolupament de l'osteoporosi. [10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; abreujat com CD) és una herba nativa a la Xina i s'utilitza àmpliament en medicina tradicional com a agent terapèutic a causa de les seves propietats sedants, analgèsiques i immunoestimuladores. [11] Estudis lògics moderns de farmaco-farmacèua han demostrat que els extractes de CD poden estimular la immunitat,[12] eliminar els radicals lliures[13], i augmentar l'activitat de la superòxid dismutasa. [14] Els agents antiinflamatoris i antioxidants tenen el potencial de tractar l'osteoporosi augmentant la formació òssia i / o suprimint la reorció òssia. No obstant això, l'efecte del CD sobre la funció cel·lular òssia encara no s'ha determinat. Aquí, informem que l'extracte de CD no va afectar la proliferació, migració o activitat de curació de ferides dels osteoblasts cultivats, sinó que va augmentar l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN i la mineralització òssia. A més, demostrem que les vies de senyalització de la proteïna quinasa activada per mitogen (MAPK) i el factor nuclear (NF) -kB poden estar involucrades en l'augment mediat per CD en l'expressió gènica i la mineralització òssia. En canvi, l'extracte de CD no va suprimir l'osteoclastogènesi in vitro. Cal destacar que el tractament de ratolins amb extracte de CD va prevenir la pèrdua òssia induïda per l'ovariectomia in vivo. Les nostres dades, per tant, suggereixen que el CD es pot utilitzar per estimular la formació òssia per al tractament de l'osteoporosi.
Cistanche deserticola
Materials i mètodes
Extracte i materials de Cistanche deserticola
L'extracte de CD va ser comprat a la Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). L'extracció i aïllament de CD es va seguir com es descriu anteriorment (sobre la base de dades espectrals que han identificat la composició química incloent beta-sitosterol, daucosterol, àcid succínic, triacontanol, acteòside, betaïna i polisacàrid). [17] Anticossos policlonals de conill específics per a quinases regulades per senyals p-extracel·lulars (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65 i p65 es van comprar a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, EUA). El kit ELISA d'osteocalcina va ser adquirit a Biosource Technology (Nivelles, Bèlgica). Els telopèptids C-terminals del kit ELISA de col·lagen tipus I es van obtenir de Cross Laps (Herlev, Dinamarca). El mutant p38 dominant negatiu va ser proporcionat pel Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, EUA). El mutant dominant negatiu JNK va ser proporcionat pel Dr. M. Karin (Universitat de Califòrnia, San Diego, EUA). El mutant dominant negatiu ERK2 va ser proporcionat pel Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Tots els altres reactius van ser obtinguts de Sigma-Aldrich (St Louis, EUA).
Cultiu cel·lular
La línia cel·lular d'osteoblast murina MC3T3-E1 va ser comprada a American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Estats Units). Les cèl·lules es van cultivar en un 95% d'aire, un 5% de CO2 amb un MEM que es va complementar amb HEPES de 20 mm i un 10% de sèrum de panxell fetal inactivat per calor, 2 mm-glutamina, penicil·lina (100 U /ml) i estreptomicina (100 mg /ml).
Mesura de la formació de nòduls mineralitzats
La formació de nòduls mineralitzats va ser avaluada com es descriu. [18] En resum, els osteoblasts es cultivaven en un medi que contenia vitamina C (50 mg / ml) i b-glicerofosfat (10 mm) durant dues setmanes, i el medi es canviava cada tres dies. Després de la incubació amb extracte de CD durant 12 dies, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb salina tris-amortiment de 20 mm que contenia
0,15 m NaCl (pH 7,4), fixat en gel fred 75% (v / v) etanol durant 30 min, i assecat a l'aire. La deposició de calci es va determinar utilitzant tinció vermella-S d'alizarina. Breument, les cèl·lules fixes d'etanol i la matriu es van tenyir durant 1 h amb alizarina vermell-S de 40 mm (pH 4,2) i es van esbandir àmpliament amb aigua. La taca lligada es va eludir amb clorur de cetilpíridini del 10% (w / v), i l'alizarina vermell-S en les mostres es va quantificar mesurant l'absorbància a 550 nm i es va comparar amb una corba estàndard. Un mol d'alizarina vermell-S s'uneix selectivament a aproximadament dos mols de calci.
Reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real
L'ARN total es va extreure d'osteoblasts utilitzant un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). La transcripció inversa es va realitzar utilitzant 2 mg d'ARN total i una imprimació oligo(dT). [19,20] La reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real (qPCR) es va dur a terme utilitzant TaqMan® Master Mix de PCR d'un sol pas (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA). Es va afegir cDNA total (100 ng per reacció de 25 ml) amb imprimacions específiques de seqüència i sondes Taqman®. Totes les imprimacions i sondes de gens diana es van comprar comercialment, inclosa la b-actina com a control intern (Applied Biosystems). Els assays qPCR es van dur a terme per triplicat en un sistema de detecció de seqüències Ste-pOnePlus (Applied Biosystems). Les condicions de ciclisme van ser d'activació de la polimerasa de 10 min a 95 °C seguida de 40 cicles de 95 °C per 15 s i 60 °C per 60 s. El llindar es va establir per sobre del fons de control sense plantilla i dins de la fase lineal d'amplificació de gens diana per calcular el nombre de cicle en què es va detectar la transcripció (denotat CT).
Anàlisi de blot occidental
Les lisats cel·lulars es van preparar com s'ha descrit anteriorment. Les proteïnes van ser resoltes per SDS-PAGE i transferides a membranes de difluorurs de polivinil Immobilon (Millipore, Billerica, EUA). Les taques es van bloquejar amb albúmina sèrica bovina del 4% durant 1 h a temperatura ambient i després es van sondejar amb anticossos antihumans de conill contra p-65, o p-p65 (1: 1000) durant 1 h a temperatura ambient. Després de tres rentats, les taques es van incubar amb anticòs secundari anti-conill conjugat amb peroxidasa (1: 1000) durant 1 h a temperatura ambient. Les taques van ser visualitzades per quimioluminescència millorada utilitzant pel·lícula X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, EUA).
Osteoporosi induïda per ovariectomia
Per a aquest estudi es van utilitzar ratolins femelles d'ICR, de quatre setmanes d'edat, 22 ~ 28 g. Els ratolins van ser ovariectomitzats bilateralment sota anestèsia de tricloro-acetaldehid (100 mg / kg) i els ratolins de control van ser operats per farsa (Sham) per a la comparació. La densitat mineral òssia i el contingut mineral ossi es van mesurar després de l'administració oral de diverses concentracions d'extractes de CD cada dos dies durant quatre setmanes. La densitat mineral òssia total del cos i el contingut mineral ossi van ser determinats per un absorptiòmetre de raigs X de doble energia (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, EUA) utilitzant un mode per a temes petits com s'ha descrit anteriorment. [18,23] Tots els protocols van complir amb les directrius institucionals i van ser aprovats pel Comitè d'Atenció Animal de la Universitat Mèdica de la Xina.
Anàlisi estadística
L'anàlisi estadística es va realitzar utilitzant prisma 4.01soft- ware. (GraphPad Software Inc., San Diego, ESTATS UNITS). Els valors donats són mitjans ± SEM. L'anàlisi estadística entre dues mostres es va realitzar mitjançant la prova t de l'Estudiant. Les comparacions estadístiques de més de dos grups es van realitzar utilitzant anàlisi unirecció de la variància amb la prova posthoc de Bonfer-Roni. En tots els casos, P< 0.05="" was="" considered="">
Extracte de Cistanche deserticola
Resultats
L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la mineralització òssia per osteoblasts
L'addició de l'extracte de CD per 24 o 48 h no va afectar la proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 d'osteoblast de ratolí en un assaig MTT (dades no mostrades). Com que la diferenciació d'osteoblasts és un procés complex que implica la proliferació i migració cel·lular, també vam provar la capacitat migratòria de les cèl·lules MC3T3-E1 després del tractament amb extracte de CD. Utilitzant Transwell i assays de cicatrització de ferides, vam trobar que l'extracte de CD no afectava la migració d'osteoblasts (dades no es mostren). La formació de nòduls mineralitzats és un dels marcadors de maduració dels osteoblasts. La tinció vermella d'alizarina va mostrar que els nòduls mineralitzats es van formar quan els osteoblasts es cultivaven durant dues setmanes en un medi que contenia vitamina C (50 mg / ml) i glicerofosfat b (10 mm), i això es va incrementar de manera dependent de la concentració mitjançant l'addició de CD (Figura 1a). Per tant, l'extracte de CD va induir la formació de nòduls ossis per osteoblasts cultivats, però no la seva proliferació o migració. També vam examinar el paper de l'extracte de CD en l'osteoclastogènesi induïda per RANKL, però no vam trobar cap efecte (dades no mostrades).
L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la fosfatasa alcalina, la proteïna morfogenètica òssia-2 i l'expressió d'osteopontina en osteoblasts cultivats
Els osteoblasts diferenciats presenten una activitat ALP elevada, que es correlaciona amb alts nivells d'expressió enzimàtica. [18] Vam trobar que el tractament amb extracte de CD durant 72 h va augmentar significativament l'activitat d'Osteoblast ALP (Figura 1b). Donat el paper crucial de BMP-2, ALP i OPN en la diferenciació d'osteoblasts, vam provar si l'extracte de CD exerceix el seu efecte sobre la diferenciació d'osteoblasts mitjançant la regulació de l'expressió de BMP-2, ALP i OPN. El tractament de cèl·lules amb extracte de CD va augmentar l'expressió d'ARNm d'ALP, BMP-2 i OPN d'una manera dependent de la concentració (Figura 1c), demostrant que l'extracte de CD va induir la diferenciació d'osteoblasts mitjançant la regularització de l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN.
L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la formació de nòduls ossis a través de la via de la proteïna quinasa activada per mitogen
S'ha informat que MAPK juga un paper important en la formació òssia[24,25] de manera que a continuació vam examinar si aquesta via de senyalització està involucrada en la mineralització òssia induïda per extractes de CD. Pretractament de cèl·lules amb inhibidor de l'ERK U0126, inhibidor de p38 SB203580, o inhibidor JNK SP600125 reduït de mineralització òssia augmentada per extracte de CD (Figures 2a, 3a i 4a). A més, els inhibidors també van bloquejar l'expressió ALP induïda per extractes de CD, BMP-2 i OPN (Figures 2b-4c). Transfecció de cèl·lules amb mutant ERK2, p38 o JNK reduït augment d'extracte de CD en l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN mRNA (Figures 2c, 3c i 4c). A continuació, vam examinar directament l'activació ERK, p38 i JNK després del tractament d'extracte de CD. Incubació de cèl·lules amb extracte de CD induïda per ERK, p38 i fosforilació JNK (Figures 2d, 3d i 4d). Per tant, ERK, p38 i JNK intervenen en l'augment de la formació òssia induïda pel tractament amb CD d'osteoblasts.
L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la formació de nòduls ossis a través de la via factor-kB nuclear
Com s'ha esmentat anteriorment, l'activació de NF-kB és necessària per a la formació òssia. [26,27] A continuació, vam tractar osteoblasts amb els inhibidors de NF-kB de dithiocarbamat de pirrolidina (PDTC) i N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) es van comprar a Calbiochem (Darmstadt, Alemanya) per determinar si l'activació de NF-kB està involucrada en la mineralització òssia induïda per extractes de CD. La figura 5a mostra que el pretractament d'osteoblasts amb PDTC o TPCK va inhibir la formació de nòduls ossis induïts per CD i també va reduir l'augment de l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN (Figura 5b i 5c). La fosforilació de la subunitat NF-kB p65 és un indicador de l'activació NF-kB; [28] d'acord amb això, vam trobar que l'extracte de CD va augmentar la fosforilació p65 en els osteoblasts (Figura 5d). Aquests resultats van indicar que l'activació de NF-kB és important per a l'alp induïda per l'extracte de CD, l'expressió de BMP-2 i OPN i la formació de nòduls ossis.
Inhibició de la pèrdua òssia per extracte de Cistanche deserticola en ratolins ovariectomitzats
Per examinar l'efecte de l'extracte de CD sobre la pèrdua òssia, l'osteoporosi va ser induïda en ratolins femenins per ovariectomia. Com era d'esperar, els ratolins ovariectomitzats van mostrar una disminució de la densitat mineral òssia total del cos i el contingut mineral ossi (Figura 6a i 6b). El tractament amb extracte de CD durant quatre setmanes va inhibir la pèrdua de densitat mineral òssia i contingut mineral ossi de manera dependent de la dosi (Figura 6a i 6b). Les concentracions sanguínies d'ALP poden reflectir l'activitat osteoblastica. [29] Com es mostra a la figura 6c, l'extracte de CD va inhibir la disminució de l'activitat sèrica d'ALP induïda per l'ovariectomia. A més, l'extracte de CD també va augmentar el nivell d'osteocalcina, un marcador de formació òssia, i va reduir el nivell de telopèptids C-terminals de col·lagen tipus I, un marcador de reorció òssia (Figura 6d i 6e). Aquestes troballes, per tant, donen suport a la potència i l'eficàcia de l'extracte de CD en la prevenció de la pèrdua òssia in vivo.
Discussió
Cistanche deserticolaMa, una herba nativa a la Xina, s'utilitza àmpliament en medicina tradicional per a diversos tractaments terapèutics a causa de la seva activitat sedant, analgèsica i immunoestimulatòria. [11–15] Aquí, vam demostrar que l'extracte de CD va induir mineralització òssia en osteoblasts cultivats, però no va afectar la seva migració o proliferació cel·lular. A més, hem trobat que ALP, BMP-2 i OPN són proteïnes diana de la senyalització induïda per extractes de CD, que requereix l'activació d'ERK, p38, JNK i NF-kB.
L'os és un teixit complex compost per diversos tipus cel·lulars que estan contínuament en procés de renovació i reparació. [30] Quan la reorció i la formació de l'os es desequilibren, la ruptura òssia anul·la la formació òssia i els resultats de l'osteoporosi. [30] Vam utilitzar ratolins ovariectomitzats per examinar l'efecte anti-osteoporòtic de l'extracte de CD. Els ratolins ovariectomitzats havien reduït la densitat mineral òssia total del cos i el contingut mineral ossi, que es va alleujar mitjançant el tractament amb extracte de CD. Extracte de CD també va augmentar els nivells sèrics del marcador osteogènic ALP i osteocalcina. Per tant, el CD és un agent de formació òssia que evita la pèrdua òssia provocada per l'ovariectomia in vivo.
Tot i que els mecanismes de l'osteoporosi no estan del tot clars, és probable que estiguin relacionats amb la disminució de la disponibilitat, o disminució dels efectes, de factors de creixement ossi, com ALP, BMP-2 i OPN. Aquests tres factors juguen un paper important en el procés de formació i remodelació òssia,[31] i s'ha documentat bé que l'estimulació de la diferenciació cel·lular dels osteoblasts es caracteritza principalment per una major expressió d'ALP, BMP-2 i OPN. [32] En aquest estudi, vam trobar que l'extracte de CD augmentava l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN i millorava la mineralització òssia. Per tant, l'extracte de CD media la formació òssia en part mitjançant la regularització de l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN.
S'ha informat que p38 està involucrat en la regulació de l'expressió d'ALP durant la diferenciació de cèl·lules osteoblastiques; De la mateixa manera, ERK1/2 és important per a la proliferació i diferenciació d'osteoblasts. [34,35] JNK està involucrat en la formació d'osteoclast. [36] Vam demostrar aquí que l'extracte de CD va induir la fosforilació ERK, p38 i JNK, i els inhibidors d'aquests enzims van antagonitzar la potenciació mediada per extracte de CD de mineralització òssia, el que suggereix que l'activació ERK, p38 i JNK tenen un paper obligatori en la formació òssia induïda per extractes de CD per osteoblasts. A més, els inhibidors enzimàtics i mutants dominants negatius d'ERK, p38 i JNK van reduir l'extracte de CD millorat alp, BMP-2 i l'expressió OPN. Aquestes dades suggereixen que l'activació de les vies ERK, p38 i JNK és necessària per a l'augment de l'expressió i maduració d'ALP, BMP-2 i OPN causada per l'extracte de CD en osteoblasts. S'ha informat que l'ERK augmenta la proliferació i diferenciació d'osteoblasts. No obstant això, no vam detectar un efecte de l'extracte de CD sobre la proliferació d'osteoblasts. Per tant, altres vies poden haver contrarestat l'efecte ERK després de l'estimulació de l'extracte de CD, o ser necessari per a la proliferació. En aquest sentit, hem trobat que els inhibidors de PI3K i Akt també redueixen la mineralització òssia induïda per extracte de CD i l'expressió d'ARNm ALP, BMP-2 o OPN (dades no mostrades). Per tant, aquestes vies poden ser necessàries per a la formació d'ossos induïts per extracte de CD.
S'ha demostrat que NF-kB controla la funció dels osteoblasts en l'os. [37] Els resultats d'aquest estudi mostren que l'activació de NF-kB contribueix a la mineralització òssia induïda per extracte de CD i a l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN en osteoblasts cultivats i que els inhibidors de la via de senyalització dependent de NF-kB (PDTC i TPCK) van inhibir la mineralització òssia induïda per extracte de CD i l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN. p65 és fosforilat a Ser536 per una varietat de quinases en diverses vies de senyalització, el que millora el potencial de transactivació p65. [38] Els resultats d'aquest estudi van mostrar que l'extracte de CD va augmentar la fosforilació de p65. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'activació de NF-kB és necessària per a la formació d'os induïts per extractes de CD en osteoblasts cultivats. També vam trobar que els inhibidors ERK, p38 i JNK van invertir l'activitat de la luciferasa induïda per extracte de CD (dades no mostrades), d'acord amb aquests enzims que són mediadors ascendents de l'activació NF-kB induïda per extractes de CD. Per tant, l'extracte de CD indueix la formació òssia a través de les vies ERK / p38 / JNK / i NF-kB.
Conclusions
Aquest estudi va demostrar que l'extracte de CD indueix diferenciació i maduració d'osteoblasts, però no proliferació o migració. L'extracte de CD també va augmentar l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN i la mineralització òssia. Hem demostrat que les vies ERK, p38, JNK i NF-kB estan involucrades en la formació d'ossos mediats per extractes de CD i l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN. A més, l'extracte de CD va prevenir la pèrdua òssia in vivo induïda per l'ovariectomia. Per tant, el CD pot ser beneficiós per estimular la formació òssia en el tractament de malalties osteopoòtiques.
