Part 1: L'equinacòsid inhibeix l'alliberament de glutamat suprimint el Ca2 dependent de la tensió més l'entrada i la proteïna quinasa C a les terminals nervioses cerebrals de la rata

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 i Su Jane Wang 3*

Resum:

El sistema glutamatèrgic pot estar implicat en els efectes de les teràpies neuroprotectores.Echinacòsid, un glucòsid feniletanoide extret de l'herba medicinal xinesaHerba Cistanche, té efectes neuroprotectors. Aquest estudi va investigar els efectes deequinacòsidsobre l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina a les terminals nervioses cerebrocorticals de rata (sinaptosomes). L'echinacòsid va inhibir l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina depenent de Ca2 més, però no independent de Ca2 més, d'una manera dependent de la concentració. L'echinacòsid també va reduir l'augment 4-evocat per l'aminopiridina de la concentració de Ca2 lliure citoplasmàtica més, però no va alterar el potencial de membrana sinaptosòmica. L'efecte inhibidor de l'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina es va prevenir mitjançant l'o-conotoxina MVIIC, un bloquejador d'ampli espectre dels canals Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q). , però era insensible al Ca2 intracel·lular més els inhibidors d'alliberament dantrolè i 7-cloro-5-({2-clorofenil)-1,5-dihidro-4 ,1-benzodiazepina-2(3H)-ona (CGP37157). A més, l'equinacòsid va disminuir la 4-fosforilació induïda per aminopiridina de la proteïna cinasa C, i els inhibidors de la proteïna cinasa C van abolir l'efecte de l'equinacòsid sobre l'alliberament de glutamat. Segons aquests resultats, suggerim que l'efecte inhibidor de l'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat evocat s'associa amb una reducció de Ca2 dependent del voltatge més l'entrada i la posterior supressió de l'activitat de la proteïna cinasa C.

Paraules clau:equinacòsid; alliberament de glutamat; terminals nervioses cerebrocorticals; canals Ca2 més dependents de la tensió; proteïna quinasa C

1. Introducció

Echinacòsidés un glucòsid feniletanoide important present aHerbaCistanche, una medicina tradicional xinesa coneguda que s'utilitza per tractar l'oblit, la impotència i el restrenyiment crònic [1].Echinacòsidposseeix diverses bioactivitats com ara antioxidació, antiinflamació, anticancerígen, hepatoprotecció i modulació immune [2–4]. En particular, l'echinacòsid té efectes neuroprotectors; per exemple, pot protegir contra la neurotoxicitat induïda per l'estrès oxidatiu o la neurotoxina en neurones corticals primàries de rata, cèl·lules SH-SY5Y del neuroblastoma humà i cèl·lules de feocromocitoma (PC12) [5–8]. A més, l'equinacòsid atenua el dany cerebral i millora la funció cognitiva en models animals de la malaltia de Parkinson, la malaltia d'Alzheimer i l'oclusió de l'artèria cerebral mitjana [9–12]. Tanmateix, el mecanisme a través del qualequinacòsidindueix neuroprotecció no s'entén del tot.

La neuroprotecció és un procés complex de preservar l'estructura i la funció neuronals davant els insults tòxics. La reducció de l'excitotoxicitat del glutamat es considera un mecanisme potencial implicat en la neuroprotecció cerebral. El glutamat, un neurotransmissor d'aminoàcids excitadors, té un paper crucial en diverses funcions cerebrals [13]. Tanmateix, la sobreactivació dels receptors de glutamat sota concentracions elevades de glutamat provoca Ca2 intracel·lular més sobrecàrrega, disfunció mitocondrial, producció de radicals lliures i mort neuronal [14,15]. Aquest procés patològic està implicat en nombrosos trastorns cerebrals, com ara la isquèmia cerebral, lesions cerebrals traumàtiques, epilèpsia i malalties neurodegeneratives [16,17]. Per tant, els inhibidors que bloquegen la transmissió glutamatèrgica fisiopatològica es consideren potencials fàrmacs neuroprotectors. Exemples notables d'aquests són els antagonistes del receptor de glutamat [18,19]; tanmateix, els assaigs clínics d'aquests fàrmacs han fracassat a causa de la menor efectivitat i dels efectes secundaris no desitjats, o fins i tot citotòxics [20,21]. A més del bloqueig directe del receptor de glutamat, la inhibició de l'alliberament de glutamat pot ser una estratègia eficaç per a la neuroprotecció. Diversos neuroprotectors (per exemple, memantina i riluzol) poden reduir l'alliberament de glutamat als teixits del cervell de rata [22–24].

Tenint en compte el paper del glutamat en l'excitotoxicitat i el perfil neuroprotector de l'equinacòsid, el present estudi va utilitzar terminals nervioses aïllades (sinaptosomes) purificades de l'escorça cerebral de rata per investigar l'efecte de l'echinacòsid en l'alliberament de glutamat i va explorar més enllà els mecanismes potencials. La preparació terminal nerviosa aïllada és un model ben establert per estudiar la regulació presinàptica de l'alliberament de neurotransmissors per fàrmacs en absència d'efectes postsinàptics [25]. Mitjançant aquest model, es va avaluar l'efecte de l'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat, el potencial de membrana, el Ca2 presinàptic més l'influx i l'activitat de la proteïna cinasa C. Segons la nostra revisió de la literatura, aquest és el primer informe que documenta el mecanisme mitjançant el qual l'echinacòsid inhibeix l'alliberament endògen de glutamat a nivell presinàptic.

2. Resultats

2.1. EchinacòsidInhibeix 4-l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina de les terminals nervioses cerebrals corticals de rata reduint l'exocitosi vesicular

La figura 1 il·lustra l'efecte depenent de la concentració de l'equinacòsid sobre l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina a partir de sinaptosomes cerebrocorticals de rata purificats. En sinaptosomes incubats amb 1 mM de CaCl2, 1 mM d'{7}}aminopiridina va provocar una alliberació de glutamat de 7,4 ± {{1{{20}}}},1 nmol/mg/5 min, que es va reduir per 1, 5, 10, 30 i 50 uM d'echinacòsid a 6,5 ​​± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0,1 o 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min, respectivament (F(5,24)=67,1, p=0. 000). El valor IC50 per a la inhibició mediada per equinacòsid de l'alliberament de glutamat provocat per 4-aminopiridina, derivat d'una corba dosi-resposta, va ser de 24 uM. A més, l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina 1 mM en una solució extracel·lular lliure de Ca2 plus que conté 300 uM d'etilenglicol bis(-aminoetil èter)-N,N,N/,N/-àcid tetraacètic (EGTA) era de 2,1 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310,65, p=0.000),

i aquest component independent de Ca2 més de l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina no es va veure afectat per 20 uM d'echinacòsid (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1) 0}}.58; Figura 1). En els sinaptosomes tractats amb 0,1 uM bafilomicina A1, un inhibidor del transportador vesicular [26], l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina 4-es va reduir significativament (2,2 ± 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249,518, p=0.000). En presència de bafilomicina A1, l'echinacòsid de 20 uM no va inhibir significativament l'alliberament de glutamat (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; figura 1). Per contra, 10 uM de DL-treo-beta-benzil-oxiaspartat (DL-TBOA, un inhibidor de la recaptació de glutamat) [27], va augmentar l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina a 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Fins i tot en presència de DL-TBOA, l'equinacòsid de 20 uM va inhibir 4-l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina de manera significativa (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p.=0.000; Figura 1).

2.2 L'equinacòsid redueix el Ca2 citosòlic més la concentració però no altera el potencial de la membrana sinaptosòmica

La despolarització del sinaptosoma causada per 1 mM 4-aminopiridina va augmentar la concentració de Ca2 més (p=0.000; Taula 1). L'aplicació de 20 uM d'echinacòsid no va afectar significativament la concentració de Ca2 basal més (t(8)=0,06, p=0,95), però va reduir significativament l'augment induït per 4-aminopiridina en Ca2 més concentració (t(10)=6.16, p=0.000). A més, la 4-aminopiridina 1 mM va augmentar en la fluorescència de iodur de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina [DiSC3(5)] (p=0.000). L'addició de 20 uM d'echinacòsid no va alterar el potencial de membrana en repòs (t(8)=0.976, p=0.36) ni va canviar significativament l'augment 4-mediat per aminopiridina en DiSC3 (5) fluorescència (t(8)=-0,014, p=0,99; Taula 1).

2.3 La reducció de Ca2 més l'influx a través dels canals Cav2.2 (Tipus N) i Cav2.1 (Tipus P/Q) es pot associar amb la inhibició de l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina per Echinacoside

La figura 2 mostra que 2 uM d'o-conotoxina MVIIC, un bloquejador de canals de tipus N i P/Q més Ca2, va reduir l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina 4-a partir de 7,4 ± {{10}}. 2 a 2.0 ± 0,1 nmol/mg/5 min (t(9)=25,35, p=0.000). En presència d'o-conotoxina MVIIC, l'efecte de 20 uM d'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat provocat per aminopiridina no va ser significatiu (1,8 2 ± més 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06, pàg=0.32). Dantrolè (10 uM), un inhibidor de l'alliberament intracel·lular de Ca de l'endoplasma

reticle [28], alliberament reduït de glutamat 4-evocat per aminopiridina (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, pàg=0.000). Tanmateix, en presència de dantrolè, l'echinacòsid de 20 uM encara podria inhibir l'alliberament de glutamat de manera significativa (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Es van observar resultats similars utilitzant 100 uM de 7-cloro-5-(2-clorofenia){-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina -2(3H)-one (CGP37157), un bloquejador permeable a la membrana de l'intercanvi de Na més /Ca2 més mitocondrial. A les cinc preparacions sinaptosòmiques examinades, 20 uM d'equinacòsid combinat amb 100 uM de CGP37157 van reduir l'alliberament de glutamat provocat per aminopiridina en un 48,3 per cent ± 5,2 per cent (F(2,13) ​​= 136,79, p {{4- 49}}.000), similar a la inhibició de l'echinacòsid sol (46,2 per cent ± 2,3 per cent; p=0,89; figura 2).

2.4 EchinacòsidInhibeix l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina mitjançant la senyalització mitjançant la proteïna quinasa C

Com es mostra a la figura 3, 10 uM de 2-[1-({3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol{-3-il) maleimida (GF109203X), un inhibidor general de la proteïna cinasa C [29], va reduir l'alliberament de glutamat provocat per 4-aminopiridina (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17} }}). En els sinaptosomes tractats amb GF109203X, l'equinacòsid de 20 uM va reduir l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina només en un 5,5 per cent ± 1,8 per cent (p=0,89), menys que el de l'equinacòsid sol (42,4 per cent ± 23,3 per cent). percentatge ; p=0.000). Es van obtenir resultats similars amb 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3 ,4-c]carbazol-12-propanenitril (Go6976), un selectiu per a les isoformes de la proteïna cinasa C depenent de Ca2 més ( , I, II, y) [29]. En presència de 3 uM de Go6976, 20 uM d'equinacòsid va reduir l'alliberament de glutamat en un 11,9 per cent ± 2,9 per cent (p=0,59), cosa que significa una reducció significativa en comparació amb l'equinacòsid sol (42,4 per cent, 2,3 per cent; p {{{{ 65}}.000; Figura 3). Per contra, 3 uM de rotlerina, un inhibidor de la proteïna cinasa C6 independent de Ca2 més [30], no va alterar significativament l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina (1 mM) (p=0.45). No obstant això, en presència de rotlerina, l'echinacòsid 20 uM va provocar efectivament una inhibició mitjana del 37,1 per cent ± 5,6 per cent de l'alliberament (F(2,13) ​​= 19,72, p=0.{{88} }}), similar a la de l'echinacòsid sol (p=0.41; Figura 3). A més, l'inhibidor de proteïna cinasa activat per mitogens 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H{-1-benzopiran-4-un) (PD98059) ) (50 uM) i l'inhibidor de la proteïna cinasa A N-[{2-(p-bromocinamilamino)etil]{-5-isoquinolinesulfonamida (H89) (100 uM) van reduir l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina (pàg=0.000). Fins i tot en presència de PD98059 o H89, 20 uM d'echinacòsid va reduir efectivament l'alliberament (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; Figura 3).

La figura 4 mostra que 1 mM 4-aminopiridina va augmentar la fosforilació de la proteïna cinasa C als sinaptosomes (t(4)=-6.871, p=0.002). Quan els sinaptosomes es van pretractar amb equinacòsid 20 uM durant 10 minuts abans de l'addició d'{10}}aminopiridina, 4-aminopiridina va induir la fosforilació de la proteïna cinasa C va disminuir considerablement (F(2,6)=29.202 , pàg=0.001).

2.5 La inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per echinacòsids no implica un receptor d'àcid gamma-aminobutíric tipus A (GABAA)

A la figura 5, es va comparar l'efecte de l'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina en absència o presència de SR95531 (un antagonista del receptor GABAA). A més, 100 uM SR95531 no va alterar significativament l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina (1 mM). En els sinaptosomes tractats amb SR95531-, l'aplicació de 20 uM d'equinacòsid va donar lloc a una inhibició del 43 per cent de l'alliberament de glutamat provocat per 4-aminopiridina (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), que no era significativament diferent de la inhibició produïda només per l'echinacòsid (40 per cent; p=0.000). Un resultat similar es va obtenir amb un altre antagonista del receptor GABAA, la bicucullina (50 uM). L'alliberament mesurat en presència de bicucullina i equinacòsid va ser significativament diferent de l'obtingut en presència de bicucullina sola (p=0.000).

3. Discussió

En aquest estudi,equinacòsid, un compost actiu a HerbaCistanche, va inhibir l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina a les terminals nervioses de l'escorça cerebral de la rata. Els possibles mecanismes subjacents per alequinacòsidLa inhibició mediada de l'alliberament de glutamat s'investiga més i es discuteix aquí.

3.1 Mecanismes subjacents a la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per equinacòsid

L'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina consta de dos components: un component depenent de Ca2 més fisiològicament rellevant, que es produeix mitjançant l'exocitosi de vesícules sinàptiques que contenen glutamat; i un component independent de Ca2 més, que s'origina a partir d'una despolarització prolongada que provoca un desplaçament mediat pel potencial de membrana de l'estat estacionari del transportador de glutamat cap a la direcció exterior, afectant així l'eflux de glutamat citosòlic [31]. Aquí, vam observar que l'echinacòsid no va inhibir significativament l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina 4- en presència d'un medi lliure de Ca2 més (alliberament independent de Ca2 més). A més, la inhibició observada de l'alliberament de glutamat provocat per 4-aminopiridina mediada per equinacòsids es va prevenir eficaçment per bafilomicina A1 (que esgota el contingut de glutamat de les vesícules sinàptiques), però no per DL-TBOA (que inhibeix de manera no selectiva tots els aminoàcids excitadors). subtipus de transportadors). Aquests resultats suggereixen que l'equinacòsid afecta l'exocitosi depenent de Ca2 plus de l'alliberament de glutamat sense afectar l'eflux citosòlic independent de Ca2 plus de glutamat mitjançant la inversió del transportador de glutamat de la membrana plasmàtica terminal nerviosa. A les terminals sinàptiques, la inhibició del canal Na més o l'activació del canal K més estabilitzen l'excitabilitat de la membrana i, en conseqüència, redueixen l'entrada de Ca2 més evocada i l'alliberament del neurotransmissor [32,33]. Per tant, el mecanisme potencial subjacent a la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per echinacòsids implica una reducció de l'excitabilitat sinaptosòmica. Tanmateix, aquesta possibilitat és insostenible a partir de dues observacions: (1) 4-la despolarització del potencial de membrana evocada per aminopiridina, mesurada amb el colorant sensible al potencial de membrana DiSC3(5) no es va veure afectada per l'addició d'echinacòsid; i (2) l'echinacòsid no va afectar l'alliberament independent de Ca2 més glutamat evocat per 4-aminopiridina, un component d'alliberament que depèn només del potencial de membrana [31]. Si l'efecte no és causat per la supressió de l'excitabilitat sinaptosòmica, es pot manifestar mitjançant una reducció de l'activitat dels canals Ca2 més Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) juntament amb l'exocitosi de glutamat en el terminals nervioses [34–36]. Mitjançant l'ús de fura-2, demostrem que l'equinacòsid redueix significativament l'augment 4-evocat per l'aminopiridina de Ca2 més la concentració. A més, les nostres dades mostren que l'efecte inhibidor de l'echinacòsid sobre l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina va disminuir del 42,4% del 2,3% al 12,1% del 3,9% després de l'exposició a un bloquejador de Cav2.2 (tipus N) i Cav2. .1 (tipus P/Q) Ca2 més canals. A més, vam observar que l'echinacòsid continuava inhibint significativament l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina en presència de Ca2 intracel·lular més inhibidors d'alliberament. Aquests resultats indiquen que la supressió simultània de Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) més l'activitat del canal és el mecanisme potencial subjacent a la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per equinacòsid. Tanmateix, l'activació combinada de Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) més l'activitat del canal no va poder bloquejar completament l'acció de l'echinacòsid. Per tant, altres tipus no identificats de canals de Ca2 més o altres vies presinàptiques poden estar implicats en la inhibició. Per exemple, els receptors GABAA estan presents a nivell presinàptic i s'ha demostrat que la seva activació inhibeix l'influx de Ca2 i l'alliberament de glutamat [37]. En el present estudi, els antagonistes del receptor GABAA SR95531 i la bicucullina no van bloquejar la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per echinacòsids, cosa que suggereix que els receptors GABAA no estan implicats en la reducció de l'activitat del canal de Ca2 més dependent del voltatge i en la inhibició posterior de l'alliberament de glutamat. L'entrada de Ca2 més a través dels canals de Ca2 més dependents del voltatge activa diverses proteïnes cinases associades a l'alliberament de glutamat a les terminals nervioses, com ara la proteïna cinasa activada per mitògens, la proteïna cinasa C i la proteïna cinasa A. Aquí, demostrem que els inhibidors de la proteïna cinasa C van antagonitzar eficaçment l'echinacòsid. -inhibició mediada de l'alliberament de glutamat; no obstant això, l'inhibidor de la proteïna cinasa activat per mitogen PD98059 o l'inhibidor de la proteïna cinasa A H89 no van ser efectius. A més, la 4-fosforilació induïda per aminopiridina de la proteïna cinasa C va disminuir als sinaptosomes després del pretractament amb equinacòsid a una concentració efectiva per inhibir l'alliberament de glutamat. Per tant, la via de senyalització de la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per equinacòsid pot implicar la proteïna cinasa C. La proteïna quinasa C és un important sistema de senyalització intracel·lular que està present a nivell presinàptic i té un paper crucial en l'exocitosi del neurotransmissor. Per exemple, diverses proteïnes sinàptiques implicades en el tràfic o el reclutament de vesícules sinàptiques i l'exocitosi, com el substrat miristoilat de la cinasa C ric en alanina, estan fosforilades per la proteïna cinasa C [38,39]. Aquest procés de fosforilació es pot augmentar mitjançant l'entrada de Ca2 estimulada per la despolarització, que facilita l'alliberament de glutamat [40]. Per tant, podem especular raonablement que l'efecte inhibidor de l'echinacòsid sobre l'entrada de Ca2 més observat aquí pot reduir l'activitat de la proteïna cinasa C i, en conseqüència, l'alliberament de glutamat.

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2