El polisacàrid de Cistanche Deserticola atenua l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia mitjançant la inhibició de la senyalització RANKL i la producció d'espècies reactives d'oxigen

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

L'osteoporosi és una malaltia metabòlica caracteritzada per osteopènia i deteriorament de la microestructura òssia. Els osteoclasts són les cèl·lules efectores primàries que degraden la matriu òssia i la seva funció anormal condueix al desenvolupament de l'osteoporosi. L'acumulació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) durant el metabolisme cel·lular afavoreix la proliferació i diferenciació dels osteoclasts, per tant, juguen un paper important en l'osteoporosi.Cistanchedeserticolapolisacàrid(CDP) posseeix activitat antitumoral, antiinflamatòria i antioxidant. Tanmateix, l'impacte del CDP sobre els osteoclasts no està clar. En aquest estudi, es va utilitzar la tinció de fosfatasa àcida resistent al tartrat, la immunofluorescència, la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa i l'anàlisi de western blot per demostrar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va inhibir l'osteoclastogènesi i la reabsorció d'hidroxiapatita. A més, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)també va inhibir l'expressió de gens marcadors d'osteoclasts, inclosos Ctsk, Mmp9 i Acp5, i no va tenir cap efecte sobre l'expressió de l'activador del receptor del factor nuclear κB (RANK). Les anàlisis mecàniques van revelar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)augmenta l'expressió d'enzims antioxidants per atenuar la producció de ROS mediada per RANKL als osteoclasts i inhibeix el factor nuclear de les cèl·lules T activades i l'activació de la proteïna cinasa activada per mitògens. Aquests resultats suggereixen que el CDP pot representar un fàrmac candidat per al tractament de l'osteoporosi causada per una activitat excessiva dels osteoclasts.

PARAULES CLAUreabsorció òssia,Cistanchedeserticolapolisacàrid, MAPK, osteoclast, espècies reactives de l'oxigen

culturisme cistanche

1|INTRODUCCIÓ

L'equilibri entre la formació òssia, mediada pels osteoblasts, i la reabsorció òssia, mediada pels osteoclasts, té un paper vital en el manteniment de l'homeòstasi metabòlica òssia (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Quan la reabsorció òssia supera la formació òssia, es produeix l'osteoporosi, que es caracteritza per una reducció de la massa òssia i un dany microestructural òssia (Ikeda, 2008). L'osteoporosi és una malaltia comuna en persones grans i dones postmenopàusiques i la seva patogènesi no s'ha dilucidat del tot (Cooper i Melton, 1992). La deficiència d'estrògens és una de les principals causes d'osteoporosi (Manolagas, O'Brien i Almeida, 2013). A més, les espècies reactives d'oxigen (ROS) poden ser induïdes per l'activador del receptor del lligand del factor nuclear κB (RANKL) i s'associen amb la formació d'osteoclasts (Yip et al., 2005), i per tant poden contribuir al desenvolupament de l'osteoporosi (Manolagas, 2010). Alguns estudis han trobat que la deficiència d'antioxidant Nrf2 augmenta els nivells de ROS i promou la diferenciació d'osteoclasts induïda per RANKL (Hyeon, Lee, Yang i Jeong, 2013). Per tant, la reducció de la producció de ROS durant la diferenciació dels osteoclasts s'hauria d'avaluar com una estratègia terapèutica per al tractament de l'osteoporosi.

Els osteoclasts es deriven del llinatge hematopoètic dels monòcits o dels macròfags i són les úniques cèl·lules multinucleades que realitzen la reabsorció òssia (Teitelbaum, 2000). Per tant, la investigació que implica la formació d'osteoclasts és de gran importància per desenvolupar tractaments efectius per a les malalties del metabolisme ossi (Lorenzo, 2017). El factor estimulant de colònies de macròfags (M-CSF) i RANKL, produïts per osteoblasts i cèl·lules T activades, són citocines importants que regulen l'osteoclastogènesi (Kim i Kim, 2016; Teitelbaum i Ross, 2003). RANKL indueix l'expressió del factor nuclear de les cèl·lules T activades (NFATc1), que és un factor de transcripció crític actiu durant la formació dels osteoclasts (Ishida et al., 2002). NFATc1 activat afavoreix l'expressió de gens marcadors d'osteoclasts com la fosfatasa àcida resistent al tartrat (TRAcP) i la catepsina K (CTSK) que regulen l'osteoclastogènesi i la funció dels osteoclasts (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolisacàrid(CDP) està aïllat de les tiges carnoses deCistanchei posseeix regulació immune, antitumoral, antienvelliment i altres efectes farmacològics (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo i Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va tenir un efecte inhibidor sobre la producció d'òxid nítric (NO) induïda per lipopolisacàrids a les cèl·lules microglials del ratolí (cèl·lules BV-2; Nan et al., 2013). A més, un extracte ric en feniletanoides (ECD) deCistancheva millorar la capacitat de natació dels ratolins disminuint el dany muscular, retardant l'acumulació d'àcid làctic i millorant l'emmagatzematge d'energia (Cai et al., 2010). Tanmateix, els efectes del CDP sobre la funció i l'activitat dels osteoclasts segueixen sent desconeguts.

En aquest estudi, vam demostrar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)inhibeix la diferenciació d'osteoclasts induïda per RANKL i la reabsorció òssia. El mecanisme subjacent era aquest CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)millora l'expressió d'enzims antioxidants per atenuar la producció de ROS i després suprimeix les cascades de senyalització de NFAT activat per RANKL i proteïna quinasa activada per mitogens (MAPK). Aquests resultats suggereixen que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)es pot utilitzar per tractar l'osteoporosi causada per una reabsorció òssia osteoclàstica excessiva.

maca ginseng cistanche

2|MATERIALS I MÈTODES

2.1|Materials

CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)(puresa > 98 per cent) es va comprar a Solarbio (Beijing, Xina) i es va preparar a una concentració d'1 mM en solució salina tamponada amb fosfat (PBS). Els anticossos són específics per a c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilats (p)-ERK, p-p38, p-JNK i -actina es van obtenir de Santa. Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Els anticossos contra la V-ATPasa d2 es van produir tal com es va descriure anteriorment (H. Feng et al., 2009). El sistema d'assaig de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoli (MTS) i luciferasa es va obtenir de Promega (Sydney, Austràlia) . El M-CSF recombinant es va comprar a R+D Systems (Minneapolis, MN). La proteïna GST-rRANKL recombinant es va expressar i purificar tal com es va descriure anteriorment (Xu et al., 2000).

2.2|Cultiu cel·lular

Les cèl·lules RAW264.7 (cèl·lules de macròfags de ratolí) es van obtenir de la col·lecció American Type Culture (ATCC, Manassas, VA) i es van cultivar en un medi essencial mínim modificat (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Austràlia) complementat amb sèrum boví fetal al 10%, 2 mM. de L-glutamina, 100 U/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d'estreptomicina (mitjà complet). Els monòcits derivats de la medul·la òssia (BMM) es van aïllar de ratolins C57BL/6J de 6 setmanes, que van ser eutanasiats segons els procediments aprovats pel Comitè d'Ètica Animal de la Universitat d'Austràlia Occidental (RA/3/100/1244). Els ossos llargs es van disseccionar lliures de teixits tous i la medul·la òssia es va eliminar del fèmur i la tíbia, que després es va cultivar en un medi complet en presència de M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Assaig d'osteoclastogènesi

Els BMM es van xapar en plaques de cultiu de 96 pous a una densitat de 6 × 103 cèl·lules per pou i es van tractar amb un medi complet que contenia M-CSF (50 ng/ml) i GST-rRANKL (100 ng/ml), en presència o absència de concentracions variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tres nuclis) es van identificar com a osteoclasts.

2.4|Assajos de citotoxicitat

Els BMM es van sembrar en plaques de 96 pous a 6 × 103 cèl·lules per pou i es van deixar durant la nit per adherir-se. L'endemà, les cèl·lules es van incubar amb diferents concentracions de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). Després de 48 hores més, es va afegir la solució MTS (20 µl/pou) i es va incubar amb cèl·lules durant 2 hores. L'absorbància a 490 nm es va determinar amb un lector de microplaques (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Tinció immunofluorescent

Els BMM es van sembrar a una densitat de 6 × 103 cèl·lules per pou en presència de M-CSF (50 ng/ml) durant la nit. A continuació, es van estimular les cèl·lules amb M-CSF i GST-rRANKL (100 ng/ml) fins que es van formar osteoclasts madurs. Els osteoclasts es van tractar després amb concentracions variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)durant 48 h abans de fixar-se amb un 4% de paraformaldehid, permeabilitzar amb 0,1% Triton X-100-PBS i bloquejar amb un 3% d'albúmina sèrica bovina en PBS. Les cèl·lules preparades es van incubar amb fal·loidina conjugada amb rodamina durant 45 min a la foscor per tacar-hi l'actina F. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS, els nuclis es van tacar amb 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) i es van muntar amb cobertors per a la microscòpia confocal.

experiència de cistanche

2,6|Assaig de reabsorció d'hidroxiapatita

Per mesurar l'activitat dels osteoclasts, els BMM (1 × 105 cèl·lules per pou) cultivats en plaques recobertes de col·lagen de sis pous (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) es van estimular amb GST-rRANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ml). ml) fins que es van generar osteoclasts madurs (Zhou et al., 2016). Les cèl·lules es van separar suaument de la placa mitjançant una solució de dissociació cel·lular (Sigma-Aldrich) i es van sembrar un nombre igual d'osteoclasts madurs en pous individuals en plaques de 96 pous recobertes d'hidroxiapatita (Corning Osteoassay, Corning, NY). Els osteoclasts madurs es van incubar en un medi que contenia GST-rRANKL i M-CSF amb o sense CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)a les concentracions indicades. Després de 48 h, la meitat dels pous es van tacar immunohistoquímicament per a l'activitat de TRAcP, tal com es descriu anteriorment, per avaluar el nombre de cèl·lules multinucleades per pou. Els pous restants es van blanquejar durant 10 min per eliminar les cèl·lules i permetre mesurar les àrees resorbides. Les àrees resorbides es van fotografiar amb microscòpia de llum estàndard i es va utilitzar el programari Image J (Instituts Nacionals de Salut, Bethesda, MD) per quantificar l'àrea percentual de superfície d'hidroxiapatita resorbida pels osteoclasts.

2,7|Assajos de reporters de luciferasa

Per investigar l'activació transcripcional de NFATc1, les cèl·lules RAW264.7 es van transfectar de manera estable amb una construcció de reporter de luciferasa sensible a NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Les cèl·lules transfectades es van cultivar en plaques de 48 pous a una densitat d'1,5 × 105 cèl·lules per pou i es van tractar prèviament amb diverses concentracions de CDP.(Cistanchedeserticolapolisacàrid)durant 1 h. Després del pretractament, les cèl·lules es van estimular amb GST-rRANKL (100 ng/ml) durant 24 hores i es va mesurar l'activitat de la luciferasa mitjançant el sistema d'assaig del reporter de luciferasa segons el protocol del fabricant (Promega).

2,8|Anàlisi quantitativa de transcripció inversa-reacció en cadena de la polimerasa (RT-PCR).

L'ARN total es va aïllar de les cèl·lules mitjançant el reactiu Trizol segons el protocol del fabricant (Thermo Fisher Scientific). L'ADN complementari es va sintetitzar mitjançant la transcriptasa inversa del virus de la leucèmia murina Moloney amb 1 ug de plantilla d'ARN i cebadors oligo-dT. L'amplificació de la reacció en cadena de la polimerasa de seqüències específiques es va realitzar mitjançant el programa següent: 94 graus durant 5 min, seguit de 30 cicles de 94 graus durant 40 s, 60 graus durant 40 s i 72 graus durant 40 s, i un pas d'extensió final de 5 min a 72 graus. La informació detallada dels primers específics es mostra a la taula 1. Els nivells relatius d'ARN missatger es van calcular mitjançant la normalització a l'expressió del gen Hmbs de la neteja.

2,9|Anàlisi Western blot

Els BMM es van cultivar en medi complet amb M-CSF en plaques de sis pous i es van estimular amb GST-rRANKL (100 ng/ml) durant els temps indicats. Les cèl·lules es van lisar en tampó de lisi de radioimmunoprecipitació i les proteïnes es van resoldre mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida i es van transferir a membranes de poli (fluorur de vinilidè) (GE Healthcare, Silverwater, Austràlia). Les membranes es van bloquejar en llet desnatada al 5 per cent durant 1 hora i després es van sondar amb diversos anticossos primaris específics amb una suau agitació durant la nit a 4 graus. Les membranes es van rentar i posteriorment es van incubar amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant. Després es va detectar la reactivitat dels anticossos amb un reactiu de quimioluminescència millorat (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i es va visualitzar amb un Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Detecció intracel·lular de ROS

Els nivells intracel·lulars de ROS es van detectar mitjançant un kit d'assaig de detecció de ROS cel·lular de diacetat de diclorofluoresceïna de 2', 7' (Abcam, Melbourne, Austràlia). Els BMM (5 × 103 cèl·lules per pou) es van cultivar en plaques de 96 pous i es van tractar amb RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) i CDP durant 72 hores. Els nivells de ROS intracel·lulars es van mesurar mitjançant diacetat de 2',7'-diclorofluoresceïna, que s'oxida en DCF fluorescent en presència de ROS. Les cèl·lules es van rentar al tampó de Hank i es van incubar a la foscor durant 30 min amb 10 µM de DCFH-DA. Les imatges es van obtenir mitjançant microscòpia confocal.

2.11|Anàlisis estadístics

Totes les dades són representatives d'almenys tres experiments realitzats per triplicat tret que s'indiqui el contrari. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. Es va utilitzar una anàlisi de variància unidireccional seguida de proves post hoc de Student–Newman–Keuls per determinar la importància de les diferències entre els resultats, amb p <{0}},05 considerat="" com="" a="">

3|RESULTATS

3.1|La CDP inhibeix l'osteoclastogènesi induïda per RANKL i la fusió d'osteoclasts

Per determinar si CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)pot suprimir la formació d'osteoclasts induïda per RANKL, primer vam realitzar un assaig d'osteoclastogènesi mitjançant BMM de ratolí (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Els BMM es van tractar amb RANKL i M-CSF durant 5 dies amb concentracions creixents de CDP. CDP va reduir el nombre de cèl·lules multinucleades positives per TRAcP quan la concentració de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va arribar a 5 µM o més (figura 1a, b). Per avaluar CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)toxicitat i confirmem que aquests resultats no eren un reflex de la mort o el nombre cel·lular, vam realitzar un assaig MTS. Els BMM es van tractar amb RANKL i M-CSF durant 48 hores amb dosis variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). El CDP no va tenir cap efecte sobre la proliferació de BMM a una concentració de 15 µM o menys (figura 1c).

Per provar els efectes del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)en la fusió d'osteoclasts, els osteoclasts es van induir amb tractament RANKL i M-CSF, amb o sense dosis variables de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). Els osteoclasts es van tenyir amb rodamina-faloidina i DAPI per avaluar el nombre de nuclis per osteoclast (figura 2a). Tant el nombre d'osteoclasts com el nombre mitjà de nuclis per osteoclasts van disminuir després de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)tractament (5-10 µM; Figura 2b, c). Per tant, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va tenir efectes inhibidors sobre l'osteoclastogènesi induïda per RANKL i la fusió d'osteoclasts de manera dependent de la dosi.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)atenua l'activitat de reabsorció d'hidroxiapatita osteoclàstica induïda per RANKL

Es va realitzar un assaig de reabsorció d'hidroxiapatita per detectar l'efecte del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)sobre la funció dels osteoclasts (figura 3a). Després d'una incubació de 24 hores, el nombre d'osteoclasts per pou no va canviar, mentre que l'àrea de reabsorció d'hidroxiapatita es va reduir significativament amb el tractament amb 5 i 10 µM de CDP en comparació amb els grups control (figura 3b, c). Aquests resultats demostren que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)té forts efectes inhibidors tant en la formació d'osteoclasts com en l'activitat de reabsorció d'osteoclasts sense cap efecte citotòxic.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)inhibeix l'expressió dels gens marcadors d'osteoclasts

Per investigar més els efectes inhibidors del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)sobre l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia osteoclàstica, els BMM es van tractar amb RANKL i M-CSF durant 5 dies amb diferents concentracions de CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). A continuació, es va realitzar RT-PCR per detectar l'expressió de gens marcadors d'osteoclasts. L'expressió de Nfatc1, un factor de transcripció crucial durant l'osteoclastogènesi, va ser inhibida per CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)de manera dependent de la dosi (figura 4a). A més, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)(5 i 10 µM) van regular a la baixa l'expressió de gens relacionats amb la reabsorció òssia, inclosos Mmp9, Ctsk i Acp5 (figura 4b-d).

3.4|CDP suprimeix l'activitat de NFATc1 i l'expressió de proteïnes aigües avall

Per examinar l'efecte del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)sobre l'activitat NFATc1 induïda per RANKL, es va realitzar un assaig de reporter de luciferasa. Tractament amb CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid), a concentracions de 5 µM i més, va inhibir significativament l'activitat NFATc1 induïda per RANKL (figura 5a). A més, l'anàlisi de western blot va mostrar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va suprimir significativament l'expressió proteica de NFATc1 i c-Fos en BMM tractats amb RANKL i M-CSF durant 3 i 5 dies (figura 5b). A més, l'expressió de proteïnes relacionades amb la funció dels osteoclasts, com ara V-ATPase-d2 i CTSK, es va reduir a la baixa en presència de CDP.(Cistanchedeserticolapolisacàrid)en comparació amb els grups control. Tanmateix, CDP no va tenir cap efecte sobre l'expressió RANK (figura 5b).

3,5|CDP promou l'expressió d'enzims antioxidants per eliminar la producció de ROS durant l'osteoclastogènesi induïda per RANKL

Per explorar el mecanisme subjacent de la inhibició de l'osteoclastogènesi depenent de CDP, els BMM es van tractar amb RANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ml) juntament amb PBS o CDP.(Cistanchedeserticolapolisacàrid)durant 72 h. Es va examinar l'efecte del CDP sobre la producció intracel·lular de ROS estimulada per RANKL. Els nivells de ROS intracel·lulars es van augmentar amb el tractament RANKL, que va ser atenuat per CDP (5 i 10 µM; Figura 6a). Tant el nombre de cèl·lules positives de ROS com la intensitat de la tinció de ROS es van reduir amb el tractament amb CDP de manera dependent de la dosi (figura 6b, c). L'anàlisi de Western blot va mostrar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va promoure l'expressió de tioredoxina (TRX1) i glutatió reductasa (GSR) mentre va suprimir l'expressió d'òxid nítric sintasa inducible (NOS2) en BMM que es van tractar amb RANKL i M-CSF durant 3 dies (figura 6d).

Per explorar més si CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va suprimir la diferenciació d'osteoclasts reduint la producció de ROS, després vam tractar BMM amb peròxid (10 µM) per imitar l'estat elevat de ROS a les cèl·lules. Els BMM van ser induïts per RANKL i M-CSF durant 3 dies i els resultats de l'anàlisi de western blot i RT-PCR van mostrar que el peròxid va promoure l'expressió NFATc1 i c-Fos en comparació amb els grups control. D'acord amb els resultats de la figura 5, l'expressió de NFATc1 i c-Fos va ser suprimida per CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)mentre que el peròxid va rescatar l'efecte inhibidor del CDP (figura 6e, f). Aquestes dades van indicar que CDP va reprimir l'expressió de NFATc1 i c-Fos eliminant la producció de ROS.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)reprimeix les vies MAPK durant l'osteoclastogènesi induïda per RANKL

A continuació, vam investigar l'efecte del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)tractament sobre l'expressió TRAF6 mediada per RANKL i l'activació de la via MAPK. Després de la incubació en medi lliure de sèrum durant 2 hores, els BMM es van estimular amb RANKL, amb o sense CDP, durant 60 min. L'estimulació amb CDP (10 µM) no va tenir cap efecte sobre l'expressió de TRAF6 i la fosforilació atenuada de JNK2 i ERK1/2 als 10 i 20 min (figura 7). A més, CDP va inhibir significativament la fosforilació de p38(Cistanchedeserticolapolisacàrid)tractament de 60 min en comparació amb els grups control (figura 7). Aquestes dades revelen que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)suprimeix les vies de senyalització MAPK induïdes per RANKL, d'acord amb el seu efecte inhibidor sobre la formació i l'activitat dels osteoclasts.

4|DISCUSSIÓ

Cistanche, conegut com a "ginseng del desert", ha cridat molt l'atenció recentment per la seva capacitat de modular la immunitat i actuar de manera protectora durant l'envelliment i l'estrès oxidatiu (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). S'ha demostrat que els glucòsids substituïts amb fenilpropanoides, els principals components actius de Cistanche, inhibeixen l'activitat del NO als macròfags (Ahn, Chae, Chin i Kim, 2017). A més, aCistancheL'extracte va reduir l'estrès oxidatiu en el miocardi reperfusat després de la isquèmia i va tenir un paper important en la inhibició de les vies apoptòtiques que condueixen a la cardioprotecció (Yu, Li i Cao, 2016). Com a component important de Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)té una varietat de funcions farmacològiques. El nostre estudi actual va trobar que el CDP va reprimir la diferenciació i l'activació dels osteoclasts activats per RANKL atenuant la producció de ROS, així com l'activació de NFAT i MAPK.

Com a fosfatasa àcida, TRAcP existeix en una varietat de cèl·lules i és abundant en osteoclasts i macròfags alveolars (Snipes, Lam, Dodd, Gray i Cohen, 1986). TRAcP és un enzim característic dels osteoclasts i la seva expressió està estretament relacionada amb la funció dels osteoclasts, considerada com un indicador de l'activitat dels osteoclasts i la reabsorció òssia (Minkin, 1982). En el nostre estudi, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va inhibir el nombre de cèl·lules positives per a TRAcP, cosa que indica que l'osteoclastogènesi induïda per RANKL va ser bloquejada per CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid). La degradació de la matriu òssia per part dels osteoclasts depèn de la catepsina K (CTSK) i les MMP (Gruber, 2015). Aquí, CDP va reduir significativament l'expressió de gens funcionals dels osteoclasts com Mmp9, Ctsk i Acp5.

La diferenciació i la funció dels osteoclasts estan regulades per múltiples vies de senyalització (Boyle, Simonet i Lacey, 2003). Després d'unir-se a RANK, RANKL recluta la proteïna adaptadora TRAF6 per activar l'expressió de NFATc1, que és un factor de transcripció important per a la formació d'osteoclasts, que afecta l'expressió gènica específica dels osteoclasts, incloent TRAcP i CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). En aquest estudi, hem trobat que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)no va tenir cap efecte sobre l'expressió de RANK i TRAF6 en osteoclasts. No obstant això, CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va inhibir l'activació de NFATc1 induïda per RANKL durant l'osteoclastogènesi de BMM. A més, es va demostrar que les ROS, produïdes pels mitocondris en el procés de lliurament d'electrons, promouen la proliferació i diferenciació dels osteoclasts i regulaven la degradació de la matriu òssia (Ha et al., 2004). Un estudi recent va trobar que RANKL va induir la importació nuclear de Bach1 i va atenuar la producció d'enzims antioxidants mediada per Nrf2, augmentant així l'expressió intracel·lular de ROS i l'osteoclastogènesi en ratolins (Kanzaki et al., 2017). A més, l'augment de la generació intracel·lular de ROS per homocisteïna va millorar la formació i l'activitat dels osteoclasts (Koh et al., 2006). El nostre estudi va trobar que el CDP va reduir l'acumulació de ROS als osteoclasts mitjançant la inhibició de l'expressió NOS2 i la promoció de l'expressió d'enzims antioxidants, com el TRX1 i la glutatió reductasa. Quan vam tractar BMM amb peròxid per millorar l'acumulació intracel·lular de ROS, els resultats que l'augment de ROS podria millorar l'expressió de NFATc1 van revelar que ROS estava aigües amunt de NFATc1. També vam trobar que el peròxid va rescatar l'efecte inhibidor del CDP sobre l'expressió de NFATc1. Per tant, les nostres dades suggereixen que el CDP suprimeix l'acumulació de ROS per inhibir l'expressió de NFATc1 i després per reprimir la formació i la funció dels osteoclasts.

ERK, JNK i p38 pertanyen a la família MAPK, que també està implicada en la regulació de la diferenciació dels osteoclasts (Seger i Krebs, 1995). RANKL activa la via MAPK augmentant la fosforilació d'ERK, JNK i p38 (Mizukami et al., 2002). Hem demostrat que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va reprimir la fosforilació mediada per RANKL de proteïnes clau a la via MAPK, contribuint així a l'efecte inhibidor de CDP sobre l'expressió dels gens marcadors d'osteoclasts. Segons el nostre coneixement, aquest és el primer estudi que mostra els efectes inhibidors del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)sobre la producció de ROS, l'activació de NFAT i MAPK, que representen nous mecanismes d'acció de CDP in vitro.

En resum, vam demostrar que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)atenua l'osteoclastogènesi i la reabsorció d'hidroxiapatita i l'expressió de gens marcadors d'osteoclasts, inclosos Ctsk, Mmp9 i Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)va ser capaç de suprimir la producció de ROS mediada per RANKL, així com l'activació de NFAT i MAPK (figura 8). Col·lectivament, els nostres resultats suggereixen que CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)pot representar un fàrmac candidat per al tractament de condicions relacionades amb osteoclasts acompanyades d'una sobreproducció de ROS.

FIGURA 8 Diagrama esquemàtic del CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)funció en la diferenciació dels osteoclasts. CDP(Cistanchedeserticolapolisacàrid)suprimeix la producció de ROS induïda per RANKL, així com l'activació de NFATc1 i MAPK, inhibint per tant l'osteoclastogènesi. CDP,Cistanchedeserticolapolisacàrid; MAPK, proteïna quinasa activada per mitògens; NFATc1, factor nuclear de cèl·lules T activades; RANKL, activador del receptor del lligand del factor nuclear κB; ROS, espècies reactives d'oxigen [La figura de color es pot veure a wileyonlinelibrary.com]

AGRAÏMENTS

Aquest estudi va comptar amb el suport de la Nature Science Foundation de la Xina (81572164), el National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), la Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) i el University Science and Technology Research Project de Guangxi Província (KY2015YB054). També compta amb el suport parcial del Projecte de Pla de Desenvolupament de Tecnologia i Investigació Científica de Guangxi (GKG13349003, 1598013-15), Fons d'Infraestructura de Recerca Sanitària i Mèdica d'Austràlia Occidental, la Fundació Arthritis Austràlia, els Premis de Col·laboració en Recerca de la Universitat d'Austràlia Occidental (UWA) i el Consell d'Investigació Mèdica i Sanitària d'Austràlia (NHMRC, núms. 1107828 i 1027932).

CONFLICTES D'INTERÈS

Els autors declaren que no hi ha conflictes d'interessos

De: 'Cistanchedeserticolapolisacàridatenua l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia mitjançant la inhibició de la senyalització RANKL i la producció d'espècies reactives d'oxigen per Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684