Efectes preventius dels glucòsids de feniletanol de Cistanche Tubulosa

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Resum

Antecedents:Cistanchetubulosaés una medicina herbal tradicional xinesa que s'utilitza àmpliament per regular la immunitat.Feniletanoilglicòsids(CPhG) d'aquesta planta són els materials principalment eficaços. L'objectiu d'aquest estudi era avaluar els efectes preventius i terapèutics dels CPhG sobre la fibrosi hepàtica induïda per BSA en rates i els mecanismes moleculars relacionats que impliquen cèl·lules estelades hepàtiques. Biejiarangan (BJRG), una altra medicina tradicional xinesa a base d'herbes, es va utilitzar com a control positiu.

Mètodes:En experiments in vivo, 75 rates SD es van dividir aleatòriament en 6 grups: normal (tractat amb aigua destil·lada), model (tractat amb BSA), fàrmac positiu (tractat amb BSA més BJRG 600 mg/kg/dia) i tractat amb BSA. més grups de CPhG (125, 250 i 500 mg/kg/dia). Els índexs de fetge i melsa, nivells sèrics d'aspartat aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), àcid hexadecenoic (HA), laminina (LN), procol·lagen tipus III (PCIII), col·lagen tipus IV (IV-C), hidroxiprolina (Hyp). ), i el factor de creixement transformant 1 (TGF- 1) es van mesurar en fetges de rata. Es van avaluar els graus histopatològics de la fibrosi hepàtica per a cada grup mitjançant la tinció de tricrom de H&E i Masson. L'expressió de TGF- 1, col·lagen I (Col-I) i col·lagen III (Col-III) es va determinar mitjançant un mètode de tinció immunohistoquímica. Aquests efectes es van avaluar més in vitro determinant els nivells d'expressió de NF-κB p65 i Col-I mitjançant anàlisis quantitatives de PCR en temps real. L'expressió de la proteïna Col-I també es va examinar mitjançant western blotting.

Resultats: Tots els grups de dosis (125, 250 i 500 mg/kg/dia) de CPhG van reduir significativament l'índex de fetge i melsa, van disminuir ALT, AST, HA, LN , PCIII, nivells sèrics IV-C, contingut de TGF- 1 (P <{12}}.{01, p=""><0,01 i="" p=""><0,01) i="" hyp="" contingut.="" els="" cphg="" també="" van="" alleujar="" notablement="" la="" inflamació="" de="" les="" cèl·lules="" hepàtiques="" i="" van="" prevenir="" eficaçment="" la="" necrosi="" dels="" hepatòcits="" i="" la="" infiltració="" de="" cèl·lules="" inflamatòries.="" els="" resultats="" immunohistoquímics="" van="" mostrar="" que="" els="" cphg="" van="" reduir="" significativament="" l'expressió="" de="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 i="" p=""><0,01), col-i="" i="" col-iii.="" els="" efectes="" in="" vitro="" dels="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" i="" 25="" ug/ml)="" sobre="" hsc-t6="" van="" demostrar="" que="" els="" cphg="" van="" reduir="" significativament="" l'expressió="" d'arnm="" de="" nf-κb="" p65="" i="" col-i,="" i="" els="" cphg="" també="" van="" reduir="" l'expressió="" de="" la="" proteïna="">

Conclusions:Els CPhG tenen un efecte anti-fibrosi hepàtic important i es poden utilitzar com a hepatoprotectors per al tractament de la fibrosi hepàtica.

Paraules clau:fibrosi hepàtica,Cistanche tubulosa,Feniletanoilglucòsid,Quimiocina BSA, Prevenció i teràpia

FeniletanoilglucòsidenCistanchetubulosa

Fons

La fibrosi hepàtica és una resposta de cicatrització de ferides a una lesió hepàtica greu que es produeix en la patogènesi de la cronichepatitis induïda per diversos factors. Aquests factors són la infecció vírica, l'abús d'alcohol, la colèstasi i les malalties metabòliques i autoimmunes [1–3]. L'acumulació progressiva de la matriu extracel·lular (ECM) i la reducció de la remodelació altera l'arquitectura normal del fetge, donant lloc a fibrosi hepàtica [4]. La fibrosi hepàtica és una malaltia hepàtica crònica crítica i sovint es converteix en cirrosi i carcinogènesi irreversibles. Actualment, no hi ha mètodes ni fàrmacs efectius per al tractament de la fibrosi hepàtica. Per tant, és urgent trobar un fàrmac contra la fibrosi hepàtica que atenui la progressió de la lesió hepàtica a fibrosi i càncer.

CistanchetubulosaW (de la família Orobanchaceae) és una planta paràsita que es cultiva àmpliament a la regió sud de Xinjiang a la Xina [5]. Les persones solen utilitzar-lo per vigoritzar els ronyons, nodrir la sang, relaxar l'intestí i retardar la senescència. Està catalogat oficialment a la Farmacopea xinesa [6].Cistanchetubulosaconté una varietat de components actius. Això inclouFeniletanoilglicòsids(CPhGs), iridoides i polisacàrids. Un dels molts components actius enCistanchetubulosa, CPhGshave va mostrar efectes antioxidants, antifatiga, neuroprotectors i antiinflamatoris convincents tant en estudis in vivo com in vitro [7]. En els últims anys, s'ha informat que els CPhG tenen efectes hepatoprotectors. Els mecanismes potencials subjacents a aquests efectes són l'eliminació de radicals lliures, la protecció de les membranes hepàtiques, la immunoregulació, la inhibició de l'apoptosi, la inhibició de l'expressió d'HBsAg i HBeAg i la inhibició de la replicació de l'ADN del VHB i altres [8-11]. Tanmateix, pocs estudis a la literatura aborden l'efecte anti-fibrosi hepàtic dels GPhC. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu investigar l'efecte anti-fibrosi hepàtica dels GPhC mitjançant l'ús d'un model de fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina (BSA) en rates. Es van investigar mecanismes moleculars relacionats a les cèl·lules HSC-T6.

Mètodes

Productes químics i reactius

Es va comprar un kit d'hidroxiprolina (hidròlisi alcalina) (Lot: 20140616) al Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Xina). Els kits de sandvitxo ELISA TGF- 1 de rata (Lot: 238240615) es van comprar a Lianke Biotech Co., Ltd. (Xina). L'anticòs Rabbit Anti-CollagenI (lot: 140619), l'anticòs Rabbit Anti-Collagen III (lot: 980788 W) i l'anticòs Rabbit Anti-TGF- 1 (lot: 140619) van ser proporcionats per Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Xina). Tancat amb sèrum d'ovella normal (fluid de treball) (lot: WP141214), PV-6000(lot: WK141225) i kit DAB (lot: K136621D) es van comprar a Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Xina). La detecció d'anticossos primaris es va realitzar utilitzant 2. Solució d'anticossos (Alk-Phos.Conjugated, Anti-conill) i 2. Solució d'anticossos (Alk-Phos. Conjugated, Anti-ratolí) (lot: 272387) comprada a Invitrogen Company (EUA) .

L'albúmina sèrica bovina (BSA) (Lot: SLBG8239V) es va comprar a Sigma (EUA). Abans del seu ús, el BSA es va preparar a 18 g/L en solució salina normal, els bacteris es van eliminar per filtració i el BSA es va emmagatzemar a 4 graus. L'adjuvant incomplet de Freund que conté 1 g de lípid de pèl d'ovella (Lot: AF0220LA14, Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Xina)) es va barrejar amb 2 g de parafina líquida (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Xina), esterilitzat en un autoclau de vapor i emmagatzemat a 4 graus. El fàrmac positiu BJRG es va obtenir com a pastilles Biejiarangan de Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. aigua destil·lada a una concentració de 600 mg/kg.

Feniletanoil glucòsidenCistancheté efectes preventius

Materials vegetals

Cistanche tubulosa(família Orobanchaceae) es va comprar a la regió de Minfeng de Xinjiang de la Xina. El material va ser autenticat per l'investigador Jun Zhao, Laboratori clau de medicina uigur, Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang. Els exemplars de val es van dipositar a l'Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang.

Preparació de CPhGs

Rizomes secs i tallats a rodanxesCistanchetubulosa(6,0 kg) es van extreure consecutivament a reflux tres vegades amb etanol al 70 per cent, i es va eliminar el dissolvent per produir l'extracte d'etanol. Els extractes d'etanol es van purificar utilitzant la resina AB-8 per obtenir elfeniletanoideglicòsids(CPhGs). Les solucions d'emmagatzematge de CPhG utilitzades per a diferents grups de dosis en estudis amb animals (500 mg/kg, 250 mg/kg i 125 mg/kg, respectivament) es van dissoldre en un 0,5 per cent (5 g/L) de carboximetil cel·lulosa ( sal de sodi).

Quantificació de CPhGs

El contingut de dos components (echinacòsid i acteòsid) als CPhG es va determinar mitjançant HPLC mitjançant un mètode reportat anteriorment (Zhang et al. 2004)[12]. La HPLC es va realitzar utilitzant un LC-10AHPLC Shimadzu equipat amb un detector d'UV. La columna HPLC era una columna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). La fase mòbil isocràtica consistia en metanol-acetonitril -1 per cent d'àcid acètic (15:10:75, v/v/v). L'elució va ser durant 40 min i el cabal es va mantenir a 0,6 ml/min. La temperatura de la columna es va mantenir constant a 30 graus. La detecció UV va ser a 334 nm.

Animals i línia cel·lular HSC-T6

[Grau SPF] es van comprar rates Sprague–Dawley (SD) mascles adults sans (180–220 g) al Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, número de llicència: SCXK (Nou) 2011–0004. Les rates van ser alimentades amb chow lliure de patògens específics (SPF). Tots els procediments relacionats amb els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal del Primer Hospital Afiliat de la Universitat Mèdica de Xinjiang. Les rates estaven allotjades en gàbies en condicions ambientals controlades (25 graus i un cicle de 12 h de llum/foscor) i tenien accés lliure al menjar estàndard de pellets de rates i a l'aigua de l'aixeta. Les rates es van aclimatar abans del tractament.

Es va obtenir una línia cel·lular estelada hepàtica de rata immortalitzada, HSC-T6, de Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, Xina). Les cèl·lules HSC-T6 es van cultivar amb el mitjà d'àguila modificat de Dulbecco (glucosa alta) (DMEM, Pequín, Xina) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (Gibco, Amèrica del Sud), 100 UI/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d'estreptomicina (Beijing, Xina). ) en incubadora humidificada a 37 graus amb un 5 per cent de CO2.

Tractaments i lesions hepàtiques induïdes per BSA

Setanta-cinc rates SD es van dividir aleatòriament en sis grups: normal (tractat amb aigua destil·lada), model (tractat amb BSA), fàrmac positiu (tractat amb BSA més BJRG 600 mg/kg/dia) , i grups tractats amb BSA més CPhG (125, 250, 500 mg/kg/dia). Els grups tractats amb BSA més CPhG (125, 250, 500 mg/kg/dia) tenien 13 rates a cada grup, i l'altre grup tenia 12 rates a cada grup. El model de lesió hepàtica induïda per BSA es divideix en sensibilització primària seguida d'un atac immunològic) [13]. Excepte el grup normal, als altres grups se'ls va administrar múltiples injeccions subcutànias amb 0,5 ml (9 mg/ml) d'adjuvant incomplet de BSAFreund el dia 1, el dia 15, el dia 22, el dia 29 i el dia 36 per a la sensibilització primària. Set dies després de la cinquena injecció, es va obtenir sang a través del plexe de la vena ratretinal i es va provar els anticossos de l'albúmina sèrica. Es va detectar anticossos BSA en sèrum de rata mitjançant el mètode de difusió d'agar doble. La injecció d'atac es va realitzar mitjançant l'administració de 0,4 ml de BSA en salina normal a través de la vena caudal en rates positives amb anticossos BSA dues vegades per setmana durant deu vegades. Les concentracions i els temps de les injeccions van ser 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10.00 g/L el dia 46 , dia 50, dia 53, dia 57, dia 60, dia 64, dia 67, dia 71, dia 74 i dia 78, respectivament. Al grup normal, la solució salina normal es va utilitzar per a injeccions immunològiques primàries (sensibilització) i secundàries (atac) en lloc de BSA, i altres condicions eren les mateixes que les del grup model.

Al grup normal se li va administrar per via oral aigua destil·lada amb una dosi d'10 ml/kg/dia. El grup model es va administrar per via oral 10 ml/kg/dia de solució de CMC-Na al 0,5 per cent. El grup de fàrmacs positius es va administrar per via oral 600 mg/kg/dia de BJRG. Als grups tractats amb BSA més CPhGs (125.250 i 500 mg/kg/dia) es van administrar per via oral 125, 250 i 500 mg/kg/dia de CPhG, respectivament. Les rates de dosificació diària van continuar durant dues setmanes després de la darrera injecció.

Després del període experimental, les rates es van dejunar durant 12 h abans d'hidratar-se el 10% de cloral i després es van fer eutanasia immediatament. Es van recollir mostres de sèrum de cada rata i es van utilitzar immediatament. Els fetges es van recol·lectar amb dos finalitats: (1) conservació en nitrogen líquid per a kits Hyp i (2) fixació en formaldehid al 10 per cent per a exàmens histològics i immunohistoquímics. La durada total dels estudis amb animals va ser de 93 dies.

Feniletanoil glucòsidenCistancheté efectes preventius

Índexs hepàtics i de melsa

El fetge i la melsa es van disseccionar per laparotomia i es van rentar amb solució salina normal de 4 graus. Després d'absorbir l'excés d'aigua amb paper de filtre, el fetge i la melsa es van pesar per calcular els índexs corresponents: pes relatiu de l'òrgan=massa d'òrgans (g)/massa corporal individual (g) × 100 per cent [14].

Anàlisi de marcadors de fibrosi hepàtica

L'efecte protector dels CPhG contra la lesió hepàtica induïda per BSA es va avaluar mesurant ALT i AST (analitzador bioquímic automàtic de raigs mentals, A086A0182). El desenvolupament de la fibrosi hepàtica i els efectes del tractament es van determinar examinant HA, LN, PC III i IV-C (analitzador de quimioluminescència, TaiGeKeXin, MP2808).

Anàlisi de contingut i TGF- 1

El nivell d'Hyp al teixit hepàtic es va determinar mitjançant un mètode espectrofotomètric d'acord amb les instruccions del kit. El nivell d'Hyp es va expressar com a Hyp (ug)/proteïna (mg). Hyp (ug/mg)=(OD mesurada). - OD en blanc)/(OD estàndard OD en blanc) × 5 (ug/ml) × 10/pess humit del teixit (ml/mg). La concentració hepàtica de TGF- 1 es va detectar mitjançant l'ús de kits ELISA segons les instruccions del fabricant. L'efecte inhibidor dels CPhG sobre la fibrosi es va confirmar pels nivells d'expressió de TGF- 1.

Exploració histopatològica

El teixit hepàtic de la mateixa part del lòbul esquerre es va resecar i es va fixar en una solució de formaldehid al 10%. Els teixits es van tacar amb H&E convencional i tinció de Masson'strichrome per observar canvis histopatològics sota un microscopi de llum. L'expressió de col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i TGF- 1 als teixits hepàtics es va analitzar mitjançant una tinció immunohistoquímica [15].

La immunohistoquímica semiquantitativa es va realitzar segons els mètodes informats [16, 17]. Es van utilitzar les classificacions següents per a les cèl·lules positives TGF- 1: "-" indica gairebé cap expressió, 20=l; "+" indica cèl·lules positives reunides individualment a la zona de la lesió, 21=2; "++" indica cèl·lules positives en petits grups reunits al voltant de la zona de la lesió, 22=4; " més més més " indica cel·les positives disperses expressades com a 23=8. Els resultats representen una integració jeràrquica. El grau cromogènic i l'abast de col·lagen tipus I i tipus III es van convertir en CRI per a l'anàlisi estadística (grau cromogènic × rang cromogènic). El grau cromogènic es divideix en feble "plus", moderat "plus plus" i fort "plus plus plus". El rang cromogènic es divideix en "plus", el seu rang cromogènic < vista="" 1/4;="" "plus="" plus",="" el="" seu="" rang="" de="" visió="" cromogènic/4-2/4;="" "plus="" plus="" plus",="" el="" seu="" rang="" de="" visió="" cromogènic="" 2/4-3/4;="" "plus="" plus="" plus="" plus",="" el="" seu="" rang="" cromogènic=""> 3/4. La puntuació a cegues va ser realitzada per dues persones on "plus" és 1; " més més "és 2, " més més més " és 3 i " més més més més " és 4. Es van seleccionar aleatòriament tres camps d'observació de microscopi (ampliació × 200) per a cada secció, amb el nivell mitjà de les mostres utilitzat com a nivell semiquantitatiu.

Experiments amb cèl·lules

Les cèl·lules HSC-T6 es van xapar en una placa 96-pou. Inicialment, les cèl·lules es van cultivar amb DMEM que contenia un 10 per cent de FBS durant 48 h. A continuació, el medi es va substituir per DMEM sense FBS per morir de fam les cèl·lules durant 12 h. A continuació, es van cultivar les cèl·lules amb DMEM que contenia 5, 0 ng/mLTGF - 1 (sense FBS) durant 24 h. Finalment, diferents concentracions de CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), acteòsid (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml), andechinacòsid (500 ug/ml, 250 ug/ml, i 125 ug/ml) es van dur a terme a la placa en pous quadruplicats i es van incubar durant 48 h.

Anàlisi PCR en temps real

El nivell d'expressió d'ARNm de NF-κB, p65 i col·lagenI es va determinar mitjançant PCR en temps real. Per determinar les expressions d'ARNm a les cèl·lules HSC-T6, les cèl·lules (4 × 105 cèl·lules) es van sembrar en plaques de sis pous amb 3 ml de DMEM amb un 10 per cent de FBS i es van incubar durant la nit a 37 graus i un 5 per cent de CO2, després de la qual cosa el Els medis de cultiu cel·lular es van canviar per DMEM lliure de sèrum. A continuació, CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), acteòsid (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) i equinacòsid (500 ug/ml, 250 ug). /ml i 125ug/ml) es van afegir als pous. Després de 48 h d'incubació amb CPhG o composicions monomèriques, es va extreure l'ARN total mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen, EUA) i es va agitar vigorosament amb cloroform durant 15 s. Després d'estar assegut a temperatura ambient durant 3 min, el lisat es va centrifugar a 12,000 × g durant 15 min a 4 graus. L'ARN a la fase aquosa es va precipitar amb isopropanol i la fase aquosa superior es va transferir a un nou tub de microcentrífuga. L'ARN es va precipitar afegint un 0,75 per cent d'etanol, després del qual el tub de microcentrífuga es va centrifugar a 12,000 × g a 4 graus durant no més de 5 min. Es va eliminar el sobrenedant i l'ARN es va assecar a temperatura ambient durant 5-10 min. Conjunts específics de cebadors (Sangon, Xangai, Xina) que es van utilitzar per a l'amplificació de l'actina de rata [GenBank: NM_031144.3], Col·lagen I [GenBank: NM{_ 053304.1] i NF- Els gens κB p65[GenBank: NM_199267.2] es van dissenyar mitjançant Batch Primer 3. Els cebadors directes (FW) i inversos (RV) eren els següents: Col·lagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -actina (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Els resultats es van normalitzar a l'ARNm del gen de la casa -actina com a control intern i es presenten com a nivells d'ARNm relatius.

Les reaccions es van realitzar amb 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL 10 pM parell d'imprimadors, 8,5 μL d'aigua destil·lada i 2,5 μL d'ADNc. Cada reacció en cadena de la polimerasa es va realitzar en les condicions següents: 95 graus durant 3 min, després 40 cicles de 10 s a 95 graus, 30 s a 55 graus i 10 s a 55 graus - 95 graus per a l'extensió, seguit d'una mesura de fluorescència única. Els resultats finals es van descriure amb els valors relatius (2-ΔΔCt). El càlcul i l'anàlisi es van realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real iQ5.

Anàlisi Western blot

Els nivells d'expressió de proteïnes de col·lagen I (Abcam, Cambridge, Regne Unit, Art No: ab34710) es van determinar mitjançant Westernblotting [amb -actina (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Xina) com a control de neteja. Els extractes de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant l'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) (Thermo Scientific, EUA) amb un còctel d'inhibidors de Haltprotease a l'1 per cent (Thermo Scientific, EUA) i còctels d'inhibidors de la fosfatasa Halt a l'1 per cent (Thermo Scientific, EUA). La concentració de proteïnes es va mesurar i quantificar pel mètode Bradford [18]. La proteïna (10-50 ug) es va separar en un gel SDS-PAGE al 10 per cent i es va transferir a membranes PVDF (Millipore, EUA). Les membranes es van bloquejar durant 1 h a temperatura ambient amb un 5 per cent de BSA i els anticossos primaris (Anti-Colla gen I). anticossos, dilució 1:200 o mAb de ratolí de -actina, dilució 1:5000) es van incubar a 4 graus durant la nit. L'Alk-Phos corresponent. Els anticossos secundaris conjugats es van incubar a temperatura ambient. Finalment, les membranes es van rentar tres vegades amb 1 × Tris-HClsaline amb un 0, 1 per cent de Tween 20, i els senyals es van escanejar i visualitzar mitjançant el sistema d'imatges GEL DOC XR (Bio-Rad). Es va realitzar una anàlisi densitomètrica de les proteïnes d'interès i es va normalitzar a -actina mitjançant el programari GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). - L'actina es va utilitzar com a control intern.

Anàlisi estadística

La prova de normalitat de Shapiro-Wilk i la prova d'homogeneïtat de la variància de Levene es van aplicar per verificar la normalitat i l'homogeneïtat de la variància. Es va utilitzar l'anàlisi de variància (ANOVA) seguida de la prova post hoc de Tukey per identificar diferències estadístiques de dades no homogènies i distribuïdes normalment. La prova no paramètrica de Kruskal-Wallis es va utilitzar per analitzar dades no distribuïdes normalment o homogènies. Els resultats es van expressar com a mitjana ± SD. La importància es va establir a P <0.05. totes="" les="" dades="" es="" van="" analitzar="" mitjançant="" el="" programari="" spss="" 16.0="" (universitat="" de="" medicina="" de="">

Resultats

Determinació quantitativa de CPhGsCPhGs enCistanchetubulosaconté dosFeniletanoilglicòsids, echinacòsid i acteòsid, i el seu contingut en els CPhG es va determinar mitjançant l'anàlisi HPLC (Fig. 1) que era del 42,71 ± 0,42% i del 14,27 ± 0},18%, respectivament.

Índexs hepàtics i de melsa

Tal com es va mostrar a la taula 1, els índexs de fetge i melsa del grup model es van elevar significativament [P <0.01, p=""><0, 05).="" els="" índexs="" de="" fetge="" i="" melsa="" del="" fàrmac="" positiu="" bjrg="" i="" cphg="" a="" diferents="" grups="" de="" dosis="" es="" van="" reduir="" significativament="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" model="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0,005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectivament].="" els="" índexs="" de="" fetge="" i="" melsa="" eren="" més="" baixos="" que="" els="" del="" grup="">

Efectes dels CPhG sobre les activitats ALT, AST i marcadors de fibrosi hepàtica

En el present estudi, els nivells sèrics dels enzims hepàtics AST i ALT van augmentar significativament en el grup model, reflectint el dany hepatocel·lular en rates de fibrosi hepàtica induïda per BSA. Tanmateix, els experiments van demostrar que el tractament amb BJRG (600 mg/kg) i CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) va reduir significativament AST[PASSAT < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" respectivament]="" i="" alt="" [palt="0,117," palt="0,139," palt="0,189" ,="" nivells="" de="" palt="0.255," respectivament]="" en="" rates="" de="" fibrosi="" hepàtica.="" (taula="">

Els nivells d'HA, LN, PC i IV-C en rates model van augmentar significativament [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respectivament].="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" de="" models,="" els="" nivells="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="" {="0.023," respectivament],="" ln="" [pln="0,011," pln="0,004," p="" ln="0,026," p="" ln="" {="0,069," respectivament],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivament]="" i="" iv-c="" [p="" iv-c=""><0.001, p="" iv-c=""><0,001, p="" iv-c=""><0,001, p="" iv-c=""><0,001, respectivament]="" en="" rates="" es="" va="" reduir="" notablement="" per="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" i="" cphg="" a="" diferents="" grups="" de="" dosis="" (125,="" 250="" i="" 500="" mg/kg).="" )="" (taula="">

Contingut de moda i TGF- 1

També es va detectar el contingut de col·lagen mesurant Hyplevels al teixit hepàtic. Tal com es mostra a la taula 4, el nivell mitjà d'Hyp al grup model era significativament superior al grup normal, però es va reduir notablement al grup BJRG i als diferents grups de dosi de CPhG.

La concentració hepàtica de TGF{{0}} del grup model en rates va augmentar significativament [P <0.001]. en="" comparació="" amb="" el="" grup="" model,="" els="" nivells="" de="" tgf-="" 1="" del="" fàrmac="" positiu="" i="" els="" diferents="" grups="" de="" dosis="" de="" cphg="" van="" disminuir="" notablement="" [p="" tgf-="" 1=""><0,001, p="" tgf-="" 1=""><0,001,p tgf{{10="" }}=""><0,001, ptgf-="" 1=""><0,001, respectivament].="" els="" resultats="" es="" resumeixen="" a="" la="" taula="">

Exploració histopatològica

Les observacions de seccions de teixit hepàtic normal tenyides amb H&E i tricrom de Masson mostren hepaticlòbuls i sinusoides hepàtics diferents. L'estructura del teixit hepàtic a les rates model estava desordenada i el teixit hepàtic i els sinusoides hepàtics es van substituir per una gran quantitat de teixit connectiu. Tanmateix, es van detectar una citoarquitectura més normal i menys teixit connectiu al grup de tractament que els del grup model.

Tinció H&E

En el grup normal, es va observar integritat estructural del lòbul hepàtic sense àrees portals anormals i sinusoides hepàtics. Els cordons hepàtics estaven disposats de manera ordenada, amb el nucli rodó i clar. Els nuclis estan situats al centre de la cèl·lula, amb abundant citoplasma. Només la zona portal té una petita quantitat de teixit fibrós (Fig. 2a).

Al grup del model, l'estructura lobular es va danyar greument. Les cèl·lules hepàtiques van mostrar una degeneració aquosa lleu, principalment degeneració en globus i/o degeneració grassa. També es va observar la formació d'infiltració de cèl·lules inflamatòries, hiperplàsia extensiva del teixit fibrós, formació d'un gran nombre de septe fibrós, lòbuls dividits i proliferació significativa de cèl·lules hepàtiques. Aquestes observacions van confirmar l'èxit de l'establiment del model animal de lesions immunitàries de rata de fibrosi hepàtica (Fig. 2b).

En comparació amb el grup model, es va observar una reducció de la infiltració de cèl·lules inflamatòries en els diferents CPhG. També es va observar una menor necrosi i degeneració grassa de les cèl·lules hepàtiques així com un alleujament de la fibrosi. CPhGs va mitigar significativament la patologia de la fibrosi hepàtica induïda per BSA a les rates, va alleujar la inflor de les cèl·lules hepàtiques i va prevenir eficaçment la necrosi dels hepatòcits i la infiltració de cèl·lules inflamatòries, cosa que suggereix que CPhG exerceix un efecte protector sobre la fibrosi hepàtica de rata induïda per BSA. (Fig. 2c–f).

Tinció tricroma de Masson

En el grup normal, el teixit hepàtic era normal. L'àrea del portal hepàtic mostrava un petit nombre de fibres de col·lagen blau i el teixit hepàtic estava estructurat normalment (Fig. 3a). En comparació amb el teixit hepàtic del grup normal, el teixit fibrós va proliferar pel fullet central i es va expandir al parènquima hepàtic. Les fibres de col·lagen s'estenen i enllaçaven i embolcallaven tot el lòbul i envoltaven la vena central. Aquests efectes, juntament amb la fibrosi dels hepatòcits, el dany estructural lobular, la fibrosi periportal i la formació de pseudolòbuls (Fig. 3b) van proporcionar proves que el model es va establir.

En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen del grup de control positiu de fàrmacs es van estendre lleugerament cap a fora des de la zona del portal perifèric (Fig. 3c). En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen en els diferents grups de dosis de CPhG es van reduir significativament, es va inhibir la proliferació de fibres i es va reduir significativament la proliferació de teixits fibrosos dins del parènquima hepàtic. Aquests resultats van suggerir que els CPhG protegien les rates de la fibrosi hepàtica induïda per BSA (Fig. 3d-f).

Tinció immunohistoquímica

És important destacar que l'expressió del col·lagen tipus I i el col·lagen tipus III tenen un paper essencial en el desenvolupament de la fibrosi hepàtica, i la seva generació i deposició al teixit hepàtic podria servir com a determinant important de l'eficàcia anti-fibrosi hepàtica. Els resultats es resumeixen a la taula 5.

Col·lagen tipus I

El grup normal expressava col·lagen tipus I principalment als vasos sanguinis i la zona del portal. El grup model va expressar col·lagen tipus I fibrosi vascular a les zones portals. A l'espai de Disse, la tinció de col·lagen tipus I es va observar com una ratlla o com una distribució irregular. Fibrósseptes recoberts de col·lagen per formar pseudolòbuls. En aquests experiments, es van formar menys septes fibrosos per a BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 i PCol I=0.044, respectivament]. Els resultats semiquantitatius van revelar que l'expressió del seu col·lagen tipus I era significativament menor en comparació amb el grup model (Fig. 4).

Col·lagen tipus III

El col·lagen tipus III es va expressar dèbilment al grup normal i les zones perifèriques que envolten les venes portal i hepàtiques mostraven una petita quantitat de color groc fi en lloc de fibres contínues (Fig. 5a). Al grup del model, les fibres de col·lagen presentaven cordons amples i gruixuts, cosa que indicava una expressió forta, situada principalment a les zones del teixit portal i fibrós (Fig. 5b).

Les fibres de col·lagen de BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) eren filamentosos i distribuïts per la vena central i les zones del portal. En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen es van reduir significativament, la tinció era pàl·lida i fina i la tinció immunohistoquímica era feblement positiva (Fig. 5c-f). Aquests resultats semiquantitatius mostren que les cèl·lules expressades positivament en els grups de dosis positius i diferents [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 i PCol III.=0.037, respectivament] eren diferents dels del grup de models.

TGF- 1

Hi havia poca expressió de TGIF- 1 a les cèl·lules normals del fetge de rata. L'expressió es limitava a un nombre reduït de cèl·lules intersticials (Fig. 6a). Al grup model, l'expressió TGF- 1 es va distribuir àmpliament a la zona portal, espais fibrosos, cèl·lules estelades hepàtiques, cèl·lules inflamatòries, paret sinusoïdal i citoplasma. Una àrea del portal particular va mostrar una expressió fortament positiva amb una tinció de color groc marró (Fig. 6b)

Hi havia una petita quantitat d'expressió a l'àrea portal i septes fibrosos de BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhG (125, 250 i 500 mg/kg). L'extensió de la tinció positiva en aquests grups es va reduir significativament en comparació amb la del grup model. Es va reduir la tinció a les cèl·lules intersticials dels septes fibrosos i el citoplasma de les cèl·lules inflamatòries (Fig. 6c-f). Els resultats semiquantitatius van revelar que BJRJ i diferents grups de dosis de CPhG [P TGF- 1=0,001, P TGF- 1 <0,001, p="" tgf{-="" 1="0,009," ptgf{-="" 1="0." 004,="" respectivament]="" van="" ser="" significatius="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="">

Com s'ha esmentat anteriorment a l'article, el TGF- 1 és una citoquina important en la fisiopatologia de la fibrosi hepàtica, estimulant la producció de matriu extracel·lular [19]. Vam demostrar que el nivell de TGF- 1 va augmentar al grup model d'una manera coherent amb la gravetat de la fibrosi hepàtica. Els nivells d'expressió de TGF- 1 al fetge eren coherents amb els nivells sèrics de TGF- 1. Això indica que els CPhG poden reduir significativament la fibrosi hepàtica a causa de l'expressió de TGF- 1 participant en la síntesi i degradació de l'ECM.

L'expressió de col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i TGF- 1 pot detectar el procés patològic de la fibrosi hepàtica. Els seus nivells d'expressió en els grups de tractament es van reduir significativament i van il·lustrar que els CPHG poden millorar l'activitat de la col·lagenasa, mantenint l'equilibri dinàmic de la síntesi i la degradació de l'ECM hepàtica, retardant i evitant així la formació de fibrosi hepàtica.

Expressió de NF-κB p65 i col·lagen I després de la intervenció de fàrmacs a les cèl·lules HSC-T6

Per caracteritzar els senyals de fibrosi hepàtica, es van determinar dos gens reguladors clau del fetge mitjançant un assaig RT-PCR. Les dades van mostrar que les cèl·lules tHSC-T6 del grup control tenien nivells més baixos de NF κB i ARNm de col·lagen tipus I. Per contra, el TGF- 1 va induir les cèl·lules HSC-T6 per regular positivament notablement l'ARNm de NF-κB (P <0.01) i="" col-i="" (p="">< 0,01),="" amb="" nivells="" superiors="" als="" els="" del="" grup="" control.="" en="" presència="" de="" diferents="" concentracions="" de="" cphg,="" els="" resultats="" de="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" per="" a="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" per="" a="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0,007" per="" a="" 50="" ug/ml,="" i="" p="" nf-κb="0,012" per="" a="" 25="" ug/ml,="" respectivament]="" i="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respectivament]="" van="" mostrar="" expressions="" reduïdes="" d'aquests="" arnm="" (="" fig.="">

Anàlisi Western blot del nivell de col·lagen I després de la intervenció del fàrmac a les cèl·lules HSC-T6

La figura 8 mostra els nivells d'expressió de la proteïna de col·lagen I a les cèl·lules HSC-T6 dels diferents grups experimentals. El nivell d'expressió de la proteïna de col·lagen I es va reduir significativament en els diferents grups de dosis de CPhG (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, i 25 ug/ml) en comparació amb el grup TGF- 1.

Discussió

CPhGs és un glicòsid feniletanoide aïllat i purificat del rizoma de Cistanche, que s'utilitza com a herba medicinal tradicional xinesa. En els darrers anys, s'ha demostrat que CPhGshad posseeix una poderosa capacitat per prevenir lesions hepàtiques [20]. Per tant, vam tenir com a objectiu investigar si els CPhG tenen efectes inhibidors sobre la fibrosi de l'hepatitis per fibrosi hepàtica induïda per BSA en rates. BJRG s'utilitza habitualment com a fàrmac terapèutic per a la fibrosi hepàtica a la Xina. Està feta amb closques de tortuga. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, etc. tenen els efectes de reposar Qi i sang, alleujar la fatiga, suavitzar els nodes. A més, estudis anteriors mostren que té la funció òbvia de bloquejar la fibrosi hepàtica precoç, inhibir la proliferació de cèl·lules emmagatzemadores de greix i reduir la síntesi de col·lagen [21]. Per tant, el BJRG es va utilitzar com a fàrmac positiu en aquest estudi.

Els canvis patològics de la fibrosi hepàtica en rates induïts per injeccions de BSA són similars als de la cirrosi humana [22]. Depenent de la dosi, els CPhG van alleujar el grau de fibrosi hepàtica i van inhibir la transformació de l'HSC en cèl·lules semblants a miofibroblasts, van reduir els nivells elevats d'ALT sèrica, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 i l'índex hepàtic i van suprimir notablement l'expressió de col·lagen. I, col·lagen III i TGF- 1 al teixit hepàtic.

Les etapes de la fibrosi hepàtica estan correlacionades amb els nivells de HA, LN i IV-C, que com a marcadors poden tenir un paper en la detecció del grau de fibrosi hepàtica [23]. S'ha informat que l'HA és el principal recurs de la matriu extracel·lular. L'IV-C com a element essencial de la membrana basal es sintetitzarà abundantment i es dipositarà en gran mesura en les fases anteriors de la livercirrosi. Els nivells sèrics de LN i IV-C són els índexs de la taxa de rotació de la membrana basal i mostren el grau de fibrosi a la zona portal i capil·lars sinusoïdals [24]. El PC III és un marcador en el diagnòstic de fibrosi hepàtica i cirrosi precoç, però la seva sensibilitat i especificitat no són elevades, i no hi ha cap diferència significativa entre les diferents etapes de la offibrosi en moltes referències [24, 25]. Aquest estudi va obtenir un resultat similar.

A més, les observacions de la secció tenyida de tricrom de H&E i Masson mostren teixits hepàtics normals amb lòbuls hepàtics i sinusoides hepàtics diferents. L'estructura del fetge del grup model estava desordenada i el teixit hepàtic i el sinusoide hepàtic es van substituir per una gran quantitat de teixit connectiu. Tanmateix, es va observar una millora significativa en els grups de tractament en comparació amb el grup model.

És important destacar que l'expressió de col·lagen tipus I i col·lagen tipus III tenen un paper essencial en el desenvolupament de la fibrosi hepàtica, el bloqueig de la qual pot prevenir i tractar la fibrosi hepàtica. Per tant, la generació i la deposició al teixit hepàtic de col·lagen tipus I i col·lagen tipus III podria servir com a determinant important de l'eficàcia de la fibrosi antihepàtica. El TGF- 1 també és una citocina profibrogènica important en lesions hepàtiques i és biològicament actiu amb múltiples accions farmacològiques[26]. Es requereix un equilibri entre aquestes accions per mantenir l'homeòstasi dels teixits. L'expressió aberrant del TGF 1 està implicada en la patogènesi de les malalties hepàtiques [27, 28]. Se sap que el TGF- 1 és una citocina crucial que està implicada en les primeres etapes de la fibrosi hepàtica. L'estrès oxidatiu desencadena el TGF- 1, donant lloc a que aquest últim estimuli la producció i la deposició d'ECM [29]. Per tant, una de les estratègies efectives per produir fàrmacs anti-fibrosi hepàtica és identificar agents anti-TGF- 1. L'anàlisi immunohistoquímica va demostrar que les expressions de col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i TGF- 1 podrien detectar el procés patològic de la fibrosi hepàtica. Es redueixen les expressions del col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i TGF- 1 als grups de tractament, que van ser significativament més baixes en el grup de tractament amb CPhGs a dosis altes, en particular, i van suggerir que els CPhG són un col·lagen eficaç tipus I, col·lagen tipus III. , i inhibidor del TGF- 1. Presumiblement, CPhGs pot millorar l'activitat de la col·lagenasa, mantenint l'equilibri dinàmic de la síntesi i la degradació de l'ECM, retardant i evitant així la formació de fibrosi hepàtica.

Els CPhG no només podrien millorar la fibrosi hepàtica induïda per BSA en rates, sinó que també podrien estar associats amb la inhibició de l'activació de HSC in vitro. Es creu que l'activació de HSC representa el pas crucial de la fibrogènesi. En aquest estudi, els resultats van il·lustrar que l'administració de CPhG de 25 a 100 ug/ml va atenuar notablement la disminució de l'expressió de l'ARNm de col·lagen I i de la proteïna de col·lagen I en HSC.

NF-κB té un paper important en la modulació de la resposta immune a la infecció o els estímuls [30]. L'acumulació de NF-κB a les cèl·lules hepàtiques pot provocar el reclutament de citocines/mediadors inflamatoris, induint així el desenvolupament de fibrosi [31, 32]. A més, el col·lagen també és un índex sensible que reflecteix el nivell de fibrosi i representa aproximadament el 50 per cent de la proteïna total del fetge fibrós [33]. Com a resultat, vam postular que el mecanisme molecular contra la fibrosi hepàtica està relacionat amb la inactivació de l'expressió NF-κB mediada per CPhGs, en la qual el benefici contribueix a funcions sinèrgiques d'atenuació de la immunotoxicitat i l'estrès inflamatori en el fetus lesionat per BSA, corregint encara més el dismetabolisme a la funció d'amelioratització.

Conclusions

En conclusió, els nostres estudis indiquen que els CPhG atenuen significativament l'extensió de la fibrosi hepàtica induïda per la BSA a les rates. El seu mecanisme pot ser, almenys parcialment, degut a l'efecte inhibidor dels CPhG sobre la composició de l'ECM i l'estimulació de la degradació de l'ECM i/o per la inhibició directa de la síntesi de col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i l'expressió de TGF{{0 }}. Per tant, esperàvem que els CPhG es poguessin utilitzar en productes sanitaris o en medicaments clínics per a la prevenció de la fibrosi hepàtica humana. Es requereixen estudis futurs per establir l'eficàcia dels CPhG com a potent fàrmac anti-fibrosi hepàtica.

Abreviatures

CPhGs: glucòsids anols de cistanche;

BSA: albúmina sèrica bovina;

HSC-T6: Cèl·lules estelades hepàtiques;

Hip: Hidroxiprolina;

BJRG: pastilles compostes de Biejiarangan;

TGF- 1: factor de creixement transformador 1;

ALT: alaninaminotransferasa;

AST: Aspartat aminotransferasa;

HA: àcid hialurònic;

LN: Laminina; PC III: procol·lagen tipus III;

IV-C: col·lagen tipus IV;

NF-κB: potenciador de la cadena lleugera kappa del factor nuclear de cèl·lules B activades;

RT-PCR: reacció en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa;

SDS-PAGE: Electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida.

Interessos competitius

Els autors declaren que no tenen interessos en competència

Aportacions dels autors

TL, JZ, SPY, LM, MT i SLZ van concebre i dissenyar els experiments. SPY, TL i JZ van analitzar les dades. SPY i JZ van escriure el manuscrit. TL, LM i JZ van revisar el manuscrit. Tots els autors van llegir i van aprovar el manuscrit final.

Reconeixement

Aquesta investigació va comptar amb el suport de la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (81260624). Els autors volen expressar el seu sincer agraïment al professor Tao Liu per les seves millores suggerides per a la redacció d'aquest article.

Detalls de l'autor

1Departament de Toxicologia, Escola de Salut Pública, Xinjiang MedicalUniversity, núm. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Xinjiang Uyghur AutonomousRegion, Xina. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institut de MateriaMedica de Xinjiang, Urumqi 830004, Xina. 3núm. 140 Xinhua South Road, Districte de Tianshan, Urumqi 830000 Regió Autònoma Uigur de Xinjiang, Xina.

Feu clic aquí per comprovar-hoCistanchetubulosaproductes

Referències
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Estat actual de les noves teràpies antifibròtiques en pacients amb malaltia hepàtica crònica. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Cèl·lules estelades hepàtiques i fibrosi hepàtica. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogènesi de la fibrosi hepàtica. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Article de revisió: la reversibilitat de la cirrosi. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Acadèmia xinesa de ciències. 23a ed. Xina: Comitè Editorial de Flora of China; 2013. pàg. 1–16.
6. Comissió de Farmacopea Xinesa del Ministeri Sanitari de la República Popular de la Xina. Farmacopea xinesa, Part 1. Xina: Chemical Industry Publishing House; 2010. pàg. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Progrés de la investigaciófeniletanoideglicòsidsdes deCistanchetubulosa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Efecte de Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) sobre la toxicitat reproductiva en ratolins induïda pel glucòsid de Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H, et al. ACE i inhibidors de l'agregació plaquetària de Tamarix hohenackeri Bunge (planta hoste deHerbaCistancs) creixent a Xinjiang. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P, et al. Millora de la colitis induïda per sulfat de dextrano de sodi en ratolins mitjançant extracte enriquit amb equinacòsidCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches estimula el cicle redox del glutatió cel·lular mitjançant espècies reactives d'oxigen generades a partir de la respiració mitocondrial en cardiomiòcits H9c2. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: un mètode RP-HPLC per a la determinació simultània d'echinacòsid i acteòside en Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Estudi del model animal d'immunitat de fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Efecte dels extractes de Cichorium glandulosum sobre la fibrosi hepàtica induïda per CCl4-. Lluna Roja Iran Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF, et al. Diterpenoides de Clerodane i flavonoides prenilats de Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Correlació de NF-κB i estadificació patològica de la fibrosi hepàtica en pacients amb hepatitis B crònica. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Efectes de les saponines totals de Panax notoginseng contra la fibrosi hepàtica en rates. Acta Academiae Medicinae Militaris Terciària. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Comparació d'assajos colorimètrics amb anàlisi quantitativa d'aminoàcids per a la quantificació de proteïnes de mòduls generalitzats per a antígens de membrana (GMMA). Mol Biotecnologia. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Avenços en la comprensió del paper del factor de creixement transformador- 1 en la patogènesi de la fibrosi hepàtica. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, et al. Efecte protector de l'acteòsid sobre la lesió hepàtica immunològica induïda per Bacillus Calmette-Guerin més lipopolisacàrid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Efectes de les píndoles de Fufang Biejia Ruangan sobre la fibrosi hepàtica in vivo i in vitro. Món J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. El paper del factor de creixement transformador 1 i el seu receptor en la fibrogènesi hepàtica induïda immunològicament en rates i efecte del polisacàrid de cordyceps sobre elles. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. La relació entre l'estadificació hepàticafibrosi i els nivells de bioquímica sèrica. HBPD INT. 2002;1:246–8.Tu et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Pàgina 12 de 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Marcadors de fibrosi sèrica en el diagnòstic de fibrosi hepàtica. BarbetaJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP, et al. Estudi preliminar de la combinació de paràmetres no invasius en el diagnòstic de la fibrosi hepàtica. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. La relació entre TGF- 1, PDGF-BB, CTGF i l'hepatitis B crònica amb fibrosi. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Els extractes de Boswellia serrata i Salvia miltiorrhiza redueixen la fibrosi hepàtica induïda per DMN en ratolins mitjançant la regulació a la baixa de TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY, et al. L'efecte dels gipenòsids sobre la via TGF- 1/Smad en la fibrosi hepàtica induïda pel tetraclorur de carboni en rates. Intern J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Protecció mitjançant un mecanisme antioxidant de la berberina contra la fibrosi hepàtica de rata induïda per múltiples factors hepatotòxics. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. La via de senyalització del factor nuclear kappa B: integrar el metabolisme amb la inflamació. Tendències Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB a la lesió d'enllaç hepàtic, fibrosi i carcinoma hepatocel·lular. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Toll-like receptors in hepa disease. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. La suplementació dietètica de suc de nabius millora l'expressió hepàtica de la metalotioneïna i atenua la fibrosi hepàtica a les rates. PLoS One. 2013;8, e58659.