Cistanche: producció d'òxid nítric induïda per echinacòsids a cèl·lules endotelials: papers del receptor d'andrògens i la via PI3K-Akt

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU i XIN LIU

Introducció

CistancheHoffmg. Et Link és una herba paràsit perenne d'un gènere de la família Orobanchaceae. HerbaCistanche, la tija deCistanche deserticolaY. c . MA iCistanche tubulosa(Schenk) R. Pes, s'han utilitzat com a agent tònic per tractar la deficiència renal, la impotència, la leucorrea mòrbida i el restrenyiment senil (1), que pot ser degut al seu efecte regulador d'hormones sexuals o andrògens (2).Echinacòsid(EcH; c35H46O20;

pes molecular, 786,73; Fig. 1), és un dels glicòsids feniletanoides (PhG) aïllats de les tiges d'HerbaCistanche, i presenta múltiples propietats biològiques, com ara efectes antioxidants, antienvelliment, antiinflamatoris, hepatoprotectors i neuroprotectors (3). Les investigacions farmacològiques modernes han demostrat que diversos constituents d'HerbaCistanche, incloent EcH, acteòsid, kankanosa, kankanòside F i cistanoside F, presenten activitat vasorelaxant (4).

L'endoteli és un regulador crític de la vasculatura i l'òxid nítric (NO) és un important factor relaxant alliberat per les cèl·lules endotelials. Mitjançant la difusió a les cèl·lules musculars llises, el NO activa la guanilat ciclasa, augmenta els nivells de guanosina monofosfat cíclic (cGMP) i després activa les proteïnes quinases (PKG) dependents de cGMP per promoure la relaxació del múscul llis (5). Anteriorment es va demostrar que EcH a 350-400 µM actua directament sobre el múscul llis vascular i inhibeix la proliferació induïda per la hipòxia a les cèl·lules musculars llises de l'artèria pulmonar de rata (6), mentre que 30-300 µM EcH va provocar una vasorelaxació aguda a l'endoteli. anells intactes de manera depenent de la concentració i millora de la producció de cGMP al múscul llis del cos cavernós dels anells aòrtics contrets per la fenilefrina (7). En obrir els canals NO-cGMP-PKG-BKca a les cèl·lules musculars llises, 100 o 300 µM EcH va suprimir la contracció induïda per la noradrenalina a les artèries pulmonars de les rates, especialment en els anells denudats d'endoteli (8). Les cèl·lules endotelials són reguladores clau de la funció cardiovascular i, en diversos casos, s'ha trobat que la relaxació dependent de l'endoteli es devia a una substància transferible, com el NO, alliberada de l'endoteli (9). Tanmateix, el mecanisme molecular aigües amunt de la producció de NO induïda per EcH a les cèl·lules endotelials vasculars requereix una investigació addicional.

A l'endoteli vascular, la generació de NO està mediada principalment per la NO sintasa endotelial (eNOS). Diversos grups han demostrat que la via de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) activa la serina treonina proteïna cinasa B (Akt), que provoca la fosforilació directa d'eNOS a la serina 1177 (Ser1177) (10). El receptor d'andrògens (AR) és un membre de la subfamília de receptors nuclears s3, que modifica canònicament l'expressió gènica. La localització AR a les caveolas de la membrana cel·lular està implicada

la regulació no genòmica de la funció de les cèl·lules endotelials o l'expressió gènica mitjançant la activació de la cascada c-Src/PI3K/Akt, que finalment resulta en la fosforilació d'eNOS i la producció de NO (11). A les cèl·lules endotelials aòrtiques humanes, s'ha informat que la testosterona activa la senyalització PI3K/Akt i indueix ràpidament la producció de NO a causa de la interacció directa de AR i la subunitat p85 de PI3K al sistema cardiovascular (12). Es va informar que EcH agreuja els símptomes relacionats amb la deficiència hormonal i exerceix els seus efectes semblants als andrògens a causa de la unió competitiva a l'AR en lloc de la testosterona (2). Per tant, el present estudi va plantejar la hipòtesi que la via PI3K/Akt pot estar implicada en la producció de NO mitjançant la fosforilació d'eNOS depenent d'AR induïda per EcH. L'objectiu del present estudi va ser avaluar els efectes següents de l'EcH: i) Inducció de la producció de NO i fosforilació d'eNOS; ii) implicació de l'AR en la fosforilació d'eNOS; i iii) activació de la via PI3K/Akt en cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana (HUVEcs), un model experimental molt conegut per estudiar la regulació de les funcions de les cèl·lules endotelials i l'angiogènesi (13).

Materials i mètodes

Productes químics i reactius.EcH (puresa, 92,5 per cent) es va obtenir dels estàndards nacionals de referència de fàrmacs de l'Institut Nacional per al control d'aliments i drogues. Els anticossos contra p-Akt (Ser473; cat. núm. ab8805), Akt (cat. núm. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. núm. ab184154) i eNOS (cat. núm. ab76198) es van comprar a Abcam. Els inhibidors de nilutamida i IcI 182780 es van obtenir de Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME es va comprar a Adamas-Beta, Ltd., i la wortmannina es va comprar a Pribolab.

Cèl·lula cultura i drogues tractament.Els HUVEcs es van obtenir de Sciencell Research Laboratories Inc. i es van cultivar en medi de cèl·lules endotelials (EcM; Sciencell Research Laboratories) amb un 5% (v/v) de sèrum fetal boví (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) i un 1% de cèl·lules endotelials. suplement de creixement (ECGS) a 37˚C (5 per cent de CO2 i 95 per cent d'humitat) (14). En arribar a la confluència, les cèl·lules es van digerir amb tripsina i es van xapar en EcM amb un 1% de FBS i un 1% d'EcGS. Per a tots els experiments, els HUVEcs es van xapar a una concentració d'1x104/ml i es van fer créixer fins a arribar a la confluència. Abans del tractament amb EcH o altres estimuladors, les cèl·lules es van incubar en EcM sense vermell de fenol sense FBS i EcGS durant 6 h per induir

aturada del creixement. En els experiments inhibidors, els HUVEcs es van preincubar amb diversos antagonistes o inhibidors, incloent 10 µM nilutamida, 10 µM IcI 182780, 0,5 mM L-NAME o 5 µM wortmannin, durant 30 min, amb o sense ECH, a 37˚C. En tots els grups, inclòs el control, es va utilitzar dMSO com a dissolvent a concentracions iguals del 0,001 per cent.

Mesurament de intracel·lular NO producció.

Els canvis relatius en la concentració de NO citosòlic en HUVEcs es van controlar mitjançant la sonda fluorescent de NO DAF-FM (Cayman Chemical Company), tal com es va informar anteriorment (12). Breument, les cèl·lules es van carregar amb diacetat DAF-FM 5 µM durant 20 min a 37 °C en una placa de microtitulació negra i es van esbandir diverses vegades amb PBS (pH 7, 4). La fluorescència es va determinar a longituds d'ona d'excitació i emissió de 495 i 515 nm, respectivament, mitjançant un lector de microplaques fluorescents (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) i un microscopi invertit compacte (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Occidental tacar anàlisi.Com es va informar anteriorment (15), les monocapes confluents de cèl·lules es van rentar dues vegades en PBS fred i es van lisar amb tampó RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). La concentració de proteïnes en el sobrenedant es va mesurar mitjançant el mètode d'assaig d'àcid bicinconínic (16). Posteriorment, es van carregar 30 µg de proteïna per carril, es van separar mitjançant gels de poliacrilamida al 10% i es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè. Les membranes es van bloquejar amb un 5% de llet desnatada durant 1 h a 25 °C. Després de la incubació amb anticossos monoclonals contra Akt (1:1, dilució000), p-Akt (dilució 1:500), eNOS (1:2, dilució000) o p-eNOS (1 : 1, 000 dilució) a 4 °C durant la nit, les membranes es van rentar amb TBST (que contenia un 0,1 per cent de Tween-20) 4 vegades durant ~ 15 min per rentat a 25 °C. Posteriorment, les membranes es van incubar amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant (1:5, dilució 000; anticòs anti-ratolí, núm. cat. A0216, o anticossos anti-conill, núm. cat. A0208, Beyotime Institute). de biotecnologia) durant 1 h a 25˚C, i es va detectar mitjançant un kit de quimioluminescència millorat (núm. cat. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Les intensitats de les bandes es van quantificar mitjançant el programari d'anàlisi de gel Image J, versió 1.8.0_112 (Instituts Nacionals de Salut).

Petita interferint (si) ARN preparació i transfecció.Els ARN llargs de doble cadena van ser sintetitzats per l'ARNm objectiu de l'AR i el receptor d'estrògens (ER) amb seqüències que es mostren a la taula I. Les condicions per a la derrota de siRNA van implicar la transfecció de HUVEC a un 70 per cent de confluència mantinguda en no antimicrobians. medi de cultiu en plats de cultiu recoberts de col·lagen de 60 mm. La transfecció de 5 nM AR-siRNA o 10 nM ER -siRNA amb el reactiu Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) es va realitzar per separat, segons els protocols del fabricant. L'eficiència de la transfecció es va avaluar mitjançant l'anàlisi quantitativa de PcR de transcripció inversa (RT-qPcR), tal com s'ha informat anteriorment (17). Les condicions de termocicle eren les següents: 10 min a 95˚C; 40 cicles de 95˚C durant 5 segons i 60˚C durant 1 min, i una corba de fusió a 95˚C durant 15 segons, 60˚C durant 1 min i 95˚C durant 15 segons; es van realitzar tres rèpliques biològiques independents per a cada mostra. Els experiments posteriors es van realitzar 48 h després de la transfecció. Els parells de primer es van dissenyar utilitzant el programari Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) amb les seqüències següents: AR endavant, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' i inversa, 5'-GAcTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER endavant, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' i enrere, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; i GAPdH cap endavant, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' i cap enrere, 5'-GGGGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Estadístic anàlisi.Totes les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard. Les comparacions estadístiques entre grups es van realitzar mitjançant la prova Kruskal-Wallis o ANOVA bidireccional amb la prova post hoc de Tukey per a comparacions múltiples. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultats

ECH indueix NO producció i eNOSfosforilació.Com es mostra a les figures 2A i B, 1 µM ECH va augmentar significativament la producció intracel·lular de NO en HUVEcs en comparació amb les cèl·lules de control negatiu, mentre que l'efecte estimulador d'EcH es va atenuar al nivell de control mitjançant el pretractament amb L-NAME. Per obtenir la concentració òptima, es va provar la fosforilació d'eNOS als 60 min després del tractament amb EcH a concentracions.

de {{0}}, 0.01, 0.1, 1 i 10 µM. Els resultats van revelar que EcH a concentracions de 0, 01-10 µM pot induir significativament la fosforilació d'eNOS a Ser 1177 de manera dependent de la concentració, amb la fosforilació màxima d'eNOS observada a la inducció d'EcH de 10 µM (Fig. 2c i d). A més, es va examinar la fosforilació d'eNOS a Ser1177 mitjançant l'anàlisi de Western blot als 0, 5, 15, 30, 60 i 120 min després de la incubació amb 1 µM EcH. Es va observar que la fosforilació d'eNOS es va desencadenar ràpidament per EcH als 5 min, i va continuar augmentant fins als 30 min d'incubació (Fig. 2E i F). Posteriorment, malgrat el tractament amb EcH, la magnitud relativa de la fosforilació d'eNOS es va mantenir estable a partir dels 30 min; per tant, EcH no va afectar l'expressió total d'eNOS (Fig. 2c i E).

AR media induït per ECH NO producció i eNOSels efectes interferents de l'AR-siRNA-1 i l'ER -siRNA-2 van ser els més reeixits per inhibir l'expressió d'AR i ER en HUVEcs en el present estudi (Fig. 3). Posteriorment, es va aplicar un antagonista per a l'anàlisi de la inhibició de la funció AR i siRNA per a l'anàlisi de la pèrdua de funció de l'AR per avaluar la implicació de l'AR en l'activació d'eNOS induïda per EcH i la producció de NO. Com es mostra a la figura 4A, 1 µM ECH va augmentar significativament la producció de NO en HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH s'activa el PI3K/Akt camí.En el present estudi, la fosforilació d'Akt a Ser473 es va provar 60 min després de la incubació d'EcH a concentracions de 0, 0.01, 0.1 , 1 i 10 µM. Els resultats van indicar que EcH (0.01-10 µM) pot induir significativament la fosforilació Akt. Els nivells d'expressió relativa de p-Akt van assolir el màxim a 1 i 10 µM de tractament amb EcH (Fig. 5A i B). A més, es va examinar la fosforilació Akt mitjançant l'anàlisi de western blot als 0, 5, 15, 30, 60 i 120 min després de l'addició d'1 µM EcH als cultius HUVEc. Com es mostra a les figures 5c i d, EcH va augmentar ràpidament la fosforilació d'Akt després de 5 min d'incubació, i es va observar el nivell màxim de proteïna de p-Akt als 60 min. Per contra, EcH no va afectar l'expressió total d'Akt (Fig. 5A i c). A més, per investigar l'efecte potencial de la via PI3K sobre la fosforilació d'eNOS, els HUVEcs es van tractar prèviament amb l'inhibidor de PI3K wortmannina abans de l'aplicació d'EcH. Es va trobar que la wortmannina reduïa la producció de NO induïda per EcH als nivells de referència (Fig. 5E). Es va observar un fenomen similar mitjançant la microscòpia de fluorescència en examinar la fluorescència DAF-FM induïda per EcH (Fig. 5F). A més, la wortmannina pot tenir la capacitat d'abolir la fosforilació ràpida d'eNOS en HUVEcs (Fig. 5G i H). Els resultats esmentats suggereixen que EcH pot activar la fosforilació d'eNOS i la producció de NO mitjançant la via PI3K/Akt.

Discussió

EcH és un compost natural aïllat d'HerbaCistanche, amb diverses propietats farmacològiques. Anteriorment es va demostrar que EcH exercia un efecte de relaxació vascular depenent de l'endoteli obrint canals NO-cGMP-PKG-BKca a les cèl·lules musculars llises dels vasos sanguinis (7, 8). Les troballes actuals proporcionen evidència que l'ECH va exercir l'activació d'eNOS depenent de l'AR per induir la producció de NO amb la implicació de la via de senyalització PI3K/Akt a les cèl·lules endotelials vasculars.

Com a capa més interna de la paret del vas, l'endoteli pot detectar i respondre ràpidament als canvis en el flux sanguini, donant lloc al seu torn a la transmissió del senyal a les cèl·lules musculars llises subjacents per tal de regular el to vascular (18). S'ha informat àmpliament que existeixen múltiples compostos vasodilatadors derivats de l'endotelial, amb la substància més prototípica.sent NO, format a partir de la isoforma endotelial d'eNOS, que resulta en fosforilació (19). En condicions normals, l'eNOS roman inactiu quan s'uneix a la caveolina i s'activa amb la següent successió d'esdeveniments a l'endotelial.cèl·lules: i) eNOS es dissocia de la caveolina-1 i s'associa amb ca2 més /caM; ii) la proteïna de xoc tèrmic (HSP)90 promou eNOSdimerització i afavoreix una formació estèrica per reclutar Akt; i iii) la calcineurina desfosforila Thr495 per reforçar l'estat d'activació (20). En el present estudi, la producció de NO es va incrementar significativament en els HUVEC tractats amb 1 µM ECH. Aquest fenomen va ser similar als resultats anteriors, on EcH va augmentar l'alliberament de NO i va estimular la síntesi de cGMP en anells aòrtics toràcics de rata (7). A més, dos llocs de fosforilació, Ser1177 i Thr495, semblen ser especialment importants per regular l'activitat d'eNOS (20), i el present estudi va revelar que EcH va induir la fosforilació aguda d'eNOS a Ser1177 de manera dependent de la concentració. A més, els estímuls associats als efectes sobre els nivells de proteïna eNOS determinen principalment l'estabilitat de l'ARNm d'eNOS, i si l'estímul es manté durant un període de temps més llarg, la transcripció de l'ARNm d'eNOS es produeix mitjançant la proteïna quinasa activada per mitogen i el factor nuclear κB (20). En conjunt, aquestes observacions indiquen que l'activació d'eNOS a Ser1177 és responsable de la síntesi de NO induïda per EcH.

A més, un nombre creixent d'estudis ha demostrat que la RA s'expressa en cèl·lules endotelials en diversos teixits humans, cosa que suggereix un paper potencial dels andrògens i els seus anàlegs, que actuen mitjançant processos mediats per AR, en la modulació de l'endotelial humà. homeòstasi cel·lular (21). A la via PI3K/Akt no clàssica, AR pot activar PI3K interaccionant directament amb la subunitat reguladora PI3K p85 (22). El present estudi va demostrar que un antagonista AR o siRNA AR va disminuir la producció de NO i la fosforilació d'eNOS induïda per EcH en HUVEcs. S'ha informat anteriorment que els estrògens indueixen la fosforilació d'eNOS i estimulen la producció de NO mitjançant l'activació clàssica d'ER a les cèl·lules endotelials (23), i l'administració d'ECH millora significativament l'expressió d'ER a l'úter (24). Tanmateix, en el present estudi, l'efecte de l'AR va ser més destacat en comparació amb el de l'ER sobre l'activació d'eNOS induïda per EcH i la producció de NO. A més, es va observar que EcH va provocar una producció aguda de NO en qüestió de minuts mitjançant l'activació d'eNOS implicada en AR en HUVEcs, que és coherent amb la naturalesa no genòmica de la resposta a les cèl·lules endotelials. L'AR s'associa amb proteïnes de bastida, incloses HSP90, HSP70 i la cinasa Src, al citoplasma, i es pot transportar a la membrana des del complex AR dins dels 5 minuts del tractament amb testosterona (23). A partir de l'estratègia de "pesca objectiu", es va identificar HSP90 com l'objectiu acoblat a PhGs, cosa que indicava que EcH pot facilitar la dissociació de l'AR de les proteïnes de bastida (25). Un altre estudi va suggerir que, a l'hipotàlem, EcH pot combinar-se amb la butxaca AR dels aminoàcids Met-894 i Val{-713 i inhibir el transport de AR citoplasmàtica al nucli (26). Tanmateix, el mecanisme subjacent a través del qual EcH media la translocació citoplasmàtica de l'AR a la membrana requereix més investigacions. Per tant, calen més investigacions per dilucidar el mecanisme mitjançant el qual EcH aconsegueix l'activació d'eNOS depenent de AR i com es pot associar amb la unió a HSP90 a les cèl·lules endotelials vasculars.

La via PI3K/Akt és una de les cascades de senyalització més importants, l'activació de la qual s'indueix produint fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfat per unir el domini d'homologia de pleckstrin N-terminal del Ser/ Thr kinase Akt. Això facilita el reclutament d'Akt a la membrana plasmàtica (27). La via PI3K/Akt pot tenir un paper important en el control de la relaxació dependent del NO induïda per EcH.

El present estudi va revelar que la producció de NO induïda per EcH es va reduir significativament quan les cèl·lules es van incubar amb l'inhibidor de PI3K wortmannina. Un informe anterior va demostrar que 15 mg/kg d'EcH activaven la via de senyalització PI3K/Akt en cèl·lules de medul·la òssia suprimides per 5-fluorouracil (28). En el present estudi, els inhibidors de PI3K van disminuir significativament la fosforilació d'eNOS induïda per EcH a Ser1177. A més, l'activitat Akt estava regulada predominantment per vies reguladores aigües amunt, especialment la fosforilació depenent de PI3K a Ser473 (20). En el present estudi, EcH va induir la fosforilació Akt a Ser473 de manera dependent de la dosi; de la mateixa manera, un estudi anterior va demostrar que 5, 10 o 20 µM d'EcH exercien un efecte cardioprotector contra el tractament d'anòxia/reperfusió d'una manera dependent de la dosi mitjançant la regulació potencial de p-Akt i SLc8A3 (29). La regulació transcripcional del gen Akt segueix sent desconeguda en gran mesura (30); per tant, el present estudi es va centrar en els efectes reguladors post-transcripcionals d'EcH sobre Akt. Tenint en compte les troballes esmentades anteriorment, es va inferir que l'aplicació d'EcH a HUVEcs pot conduir a l'activació de la via PI3K/Akt, que fosforila eNOS i, posteriorment, augmenta la producció de NO.

En conclusió, EcH és un producte natural que s'aïlla principalment d'HerbaCistanche.El mecanisme potencial subjacent a la producció de NO induïda per EcH a les cèl·lules endotelials pot incloure el següent (Fig. 6): i) EcH actua com un lligand funcional de l'AR que es localitza a les caveolas de la membrana cel·lular; ii) PI3K s'uneix al domini hidrofòbic d'Akt a Ser473 i facilita el reclutament d'Akt a la membrana cel·lular; iii) el reclutament de les cascades PI3K/Akt desencadena la fosforilació d'eNOS depenent de AR; i iv) la generació de NO està mediada per eNOS a les cèl·lules endotelials. L'observació que EcH indueix la producció de NO mitjançant la fosforilació d'eNOS depenent de l'AR amb la implicació de la via PI3K/Akt pot contribuir a una millor comprensió dels efectes vasorelaxants d'EcH. A més, l'EcH dirigit a les vies NO derivades de l'endotelial pot ser degut a efectes no genòmics. Per tant, el present estudi pot ajudar a dilucidar els mecanismes a través dels quals EcH exerceix els seus efectes farmacològics per prevenir malalties cardiovasculars.

Agraïments

No aplicable.

Finançament

El present estudi va comptar amb el suport de la National Natural Science Foundation de la Xina (subvenció núm. 81503333).

Disponibilitat de dades i materials

Els conjunts de dades generats i analitzats durant el present estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.

dels autors aportacions

LG i XL van concebre i dissenyar els experiments. dL i YZ van realitzar els experiments. WZ i JG van analitzar les dades. LG va redactar el manuscrit. XL va revisar i editar el manuscrit. Tots els autors van llegir i aprovar el manuscrit final.

1202 GUet al: L'ECINACÒSID INDUIX LA PRODUCCIÓ D'ÒXID NÍTRIC PER LA RUTA PI3K/AKT DEPENDIENT DE L'AR

Ètica aprovació i consentiment a participar

No aplicable.

Pacient consentiment per publicació

No aplicable.

Competint interessos

Els autors declaren que no tenen interessos en competència.

Referències

1. Comissió de la farmacopea xinesa:CistancheHerba. A: Farmacopea de la República Popular de la Xina 1. barbeta. Med. Ciència. Press, Beijing, pàg. 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X i Zhang X: Echinacoside iCistanche tubulosa(Schenk)R. Wight millora el dany testicular i espermàtic induït pel bisfenol A en rates mitjançant enzims esteroidogènics regulats per l'eix de les gònades. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B i Ma X: Echinacoside, un producte natural inestimable en el tractament de trastorns neurològics i altres. Molècules 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S i Muraoka O: oligoglicòsids feniletanoides i oligosucres acilats amb activitat vasorelaxant deCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S i Murad F: L'òxid nítric activa la guanilat ciclasa i augmenta els nivells de guanosina 3':5'-monofosfat cíclic en diverses preparacions de teixits. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y i Ge RL: efecte antiproliferatiu de l'equinacòsid a les cèl·lules musculars llises de l'artèria pulmonar de rata sota hipòxia. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ i Tu PF: l'echinacòsid provoca una relaxació dependent de l'endoteli en anells aòrtics de rata mitjançant una via NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y i Ge RL: L'echinacòsid indueix la vasorelaxació de l'artèria pulmonar de rata obrint el NO-cGMP-PKG- Canals BKca i reducció dels nivells intracel·lulars de ca2 plus. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y i Higashi Y: Avaluació de la vasodilatació independent de l'endoteli: de la metodologia a les perspectives clíniques. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J i derivat de cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana contra lesions induïdes per l'estrès oxidatiu: implicació de les vies de senyalització PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y i Okabe T: Src quinasa media l'activació no genòmica depenent del receptor d'andrògens de la cascada de senyalització que condueix a la sintasa d'òxid nítric endotelial . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y i Okabe T: activació dependent del receptor d'andrògens de l'òxid nítric sintasa endotelial a les cèl·lules endotelials vasculars: paper del fosfatidilinositol {{3} }quinase/Akt pathway.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F i Reno F: proliferació i migració dependents del NO induïda per la vitamina d en HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X i Xu X: la sobreexpressió de la proteïna desacoblada 2 inhibeix l'apoptosi alta induïda per glucosa de les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z i Bing S: Icariin retarda la senescència cel·lular endotelial induïda per homocisteïna que implica l'activació de la via de senyalització PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ i Klenk dc: Mesura de proteïnes mitjançant àcid bicinconínic. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H i Liu X: biosíntesi de triterpenoides i la resposta transcripcional provocada per l'òxid nítric en la fermentació submergidaGanoderma lucidum. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY i Gutterman dd: hiperpolarització derivada de l'endoteli i vasodilatació coronària: rols diversos i integrats dels àcids epoxieicosatrienoics, peròxid d'hidrogen i unions gap. Microcirculation 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK i Gutterman dd: la comunicació és clau: Mecanismes de senyalització intercel·lular en vasodilatació. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B i debret R: detecció del microentorn de l'endoteli que condueix a una vasodilatació mediada per òxid nítric: una revisió dels senyals nerviosos i biomecànics. Òxid nítric 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS i Smith GJ: receptor d'androgens en cèl·lules endotelials humanes. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H i Gui YT: L'acció no genòmica dels andrògens està mediada per la fosforilació ràpida i la regulació del tràfic de receptors d'andrògens. Cell Physiol Biochem 43: 223-236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP i Ghedini Pc: L'activació de la via PI3K/Akt mediada pels receptors d'estrògens té en compte les estrones induïdes. activació vascular de la senyalització cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z i Li P: activitat antiosteoporòtica de l'equinacòsid en rates ovariectomitzades. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y i Tu PF: identificació d'objectius farmacològics i anàlisi de l'eficàcia dels glucòsids feniletanoides deCistancsHerba basat en l'estratègia 'target fishing'. chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM i Zhang X: L'echinacòsid augmenta la quantitat d'esperma en rates dirigint-se al receptor d'andrògens hipotalàmics. Ciència Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J i Woodgett JR: Proteïna quinasa B (c-Akt): un mediador multifuncional de l'activació de la fosfatidilinositol 3-quinasa. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y i Qian J: L'echinacòsid millora la funció hematopoètica en ratolins de mielosupressió induïda per 5-FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W i Zhou H: efectes protectors de l'echinacòsid contra lesions d'anòxia/reperfusió a les cèl·lules H9c2 mitjançant la regulació positiva de p-AKT i SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P i Su Y: el paper crític d'Akt en la funció cardiovascular. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.