Cistanche Glyside Rg1 millora la fibrosi hepàtica induïda per l'envelliment mitjançant la inhibició de l'inflamasoma NOX4/NLRP3 en ratolins SAMP8

Resum.Envellimentsovint s'acompanyalesió hepàticaifibrosi, que finalment condueix a un descens defunció hepàtica. No obstant això, el mecanisme delesió hepàtica induïda per l'envellimentifibrosiencara no s'entén del tot, segons el que sabem, i actualment no hi ha opcions de tractament efectives disponibles per a l'envelliment del fetge. S'ha informat que Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) exerceix potents efectes anti-envelliment a causa de la seva potent activitat antioxidant i antiinflamatòria. El present estudi pretenia investigar l'efecte protector i el mecanisme d'acció subjacent de Rg1 alesió hepàtica induïda per l'envellimentifibrosiensenescència acceleradaRatolins propensos a ratolí 8 (SAMP8) tractats durant 9 setmanes.

Feu clic aquí per obtenir més informació sobre el tractament antienvelliment de Cistanche per al fetge

Els resultats histopatològics van mostrar que la disposició dels hepatòcits estava desordenada, es va produir una degeneració semblant a vacúols a la majoria de cèl·lules i col·lagen IV i TGF- Els nivells d'expressió 1, que es van detectar mitjançant immunohistoquímica, també es van regular significativament al grup SAMP8. El tractament amb Rg1 va millorar notablementlesió hepàtica i fibrosi induïda per l'envelliment, i va reduir significativament els nivells d'expressió de col·lagen IV i TGF- 1. A més, els resultats de la tinció de dihidroetilè i del western blotting van mostrar que el tractament amb Rg1 va reduir significativament els nivells d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i IL-1. , i va regular a la baixa els nivells d'expressió de NADPH oxidasa 4 (NOX4), p47phox, p22phox, fosforilat-NF-κB, caspasa-1, proteïna semblant a mota associada a l'apoptosi que conté un domini de reclutament de caspasa C-terminal i el domini de la pirina de la família NLR que conté inflammasoma 3 (NLRP3), que es van regular significativament als teixits hepàtics de ratolins SAMP8 ancians. En conclusió, els resultats del present estudi suggereixen que Rg1 es pot atenuarlesió hepàtica i fibrosi induïda per l'envellimentreduint l'estrès oxidatiu de ROS mediat per NOX4 i inhibint l'activació de l'inflamsoma NLRP3.

Introducció

La fibrosi hepàtica és un procés dinàmic associat a la deposició i reabsorció contínua de la matriu extracel·lular, principalment col·lagen fibril·lar (3), que sovint és el primer pas en la distorsió i disfunció arquitectònica que impedeix el funcionament normal del fetge (4). Si no es tracta, la fibrosi hepàtica pot provocar cirrosi hepàtica avançada i hepatoma (4). L'evidència acumulada ha suggerit que la susceptibilitat a la fibrosi hepàtica i l'hepatitis augmenta significativament amb l'edat (5). Per tant, segueix sent de gran importància estudiar l'envelliment del fetge i els mecanismes subjacents associats per proporcionar noves estratègies per prevenir la fibrosi hepàtica relacionada amb l'envelliment.7

receptor de reconeixement de caspasa-1 i proteïna semblant a la molla associada a l'apoptosi que conté un domini de reclutament de caspasa C-terminal (ASC). Segons la troballa d'estudis anteriors, es va descobrir que l'inflamsoma NLRP3, un tipus d'inflamsoma expressat de manera ubiqua en nombrosos teixits, inclòs el fetge, estava implicat en l'evolució de la fibrosi hepàtica i la progressió de la lesió hepàtica i la malaltia hepàtica relacionada amb l'edat. 20-22). Quan s'activa per diversos irritants, com ATP i cristalls de colesterol, així com patògens bacterians, virals i fúngics (23,24), l'inflamsoma NLRP3 respon a la inflamació afavorint la maduració d'una sèrie de citocines proinflamatòries, com la IL-1. i IL-18 (25). A més, s'ha informat que l'acumulació excessiva de ROS va activar l'inflamsoma NLRP3 al fetge durant el procés d'envelliment, i finalment va provocar una malaltia hepàtica associada a l'envelliment (26).

Materials i mètodes

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 per cent; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) un cop al dia durant 9 setmanes. Els grups SAMP8 i SAMR1 es van tractar amb aigua destil·lada durant 9 setmanes. Després de 9 setmanes de tractament, es van sacrificar sis ratolins de cada grup mitjançant una luxació cervical. Els fetges es van collir i emmagatzemar a -80˚C per al seu ús posterior en experiments de western blotting o col·locats

tom (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) a -20˚C. Les seccions es van rentar amb PBS i es van incubar amb una solució Hoechst 33258 de 5 mg/l (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) a temperatura ambient durant 5 min. A continuació, les seccions es van segellar amb un agent d'extinció anti-fluorescència (Beyotime Institute of Biotechnology) i es van visualitzar mitjançant un microscopi de fluorescència (Olympus IX72; Olympus Corporation; augment, x400). El programari Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) es va utilitzar per detectar la densitat mitjana de fluorescència vermella a partir de tres camps de visió seleccionats aleatòriament a cada secció per indicar la producció de ROS.

Examen patològic del teixit hepàtic.

Els canvis morfològics al fetge es van examinar mitjançant H&E, àcid periòdic-Schiff (PAS) i les tècniques de tinció de tricrom de Masson. La tinció H&E és el mètode més comú per observar els canvis patològics en els teixits (38). Breument, es van fixar mostres de fetge en un 4% de paraformaldehid durant 24-48 h, es van deshidratar i es van incrustar en parafina, i després es van tallar en seccions de 5 µm de gruix. Les seccions hepàtiques (n=4) es van desparafinar en xilè i es van rehidratar en sèries d'alcohol graduades (etanol anhidre, etanol al 85%, etanol al 75%), després es van tacar amb hematoxilina durant 3 min i eosina durant 30 segons. Tots aquests passos es van realitzar a temperatura ambient. Les seccions es van segellar amb resina neutra i es van observar amb un microscopi de llum (Olympus IX72; Olympus Corporation; augment, x200).

Tinció d'immunohistoquímica.

Les seccions incrustades en parafina (n=4) es van desparafinar i es van rehidratar, segons el mètode descrit per a la tinció d'H&E. A continuació, es van incubar les seccions amb un 3 per cent d'H2O2 durant 10 minuts a 37 °C per bloquejar l'activitat de la peroxidasa endògena abans de ser submergidas en tampó de citrat de sodi bullint durant 7 minuts en un forn de microones per a la recuperació d'antigen. Les seccions es van incubar posteriorment amb sèrum de cabra al 10 per cent (núm. cat. C0265; Beyotime Institute of Biotechnology) a 37 °C durant 30 min per bloquejar la unió no específica. A continuació, les seccions es van incubar amb els anticossos primaris següents a 4 °C durant la nit: Anti-col·lagen policlonal de conill IV (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; núm. cat. BS1072), anti-NLRP3 policlonal de conill (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; núm. cat. BS90949) i anti-TGF-1 policlonal de conill (1:100; Abcam; núm. cat. ab92486).

Western blotting.

La proteïna total es va extreure dels teixits hepàtics (n{{0}}) mitjançant el tampó de lisi RIPA (núm. cat. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) i una màquina automàtica de mòlta ràpida de mostres (Jinxing Industrial Development Co., Ltd .) a 65 Hz durant 60 segons a 4˚C. La proteïna total es va quantificar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA i les proteïnes (20 µg) es van separar mitjançant un 8-15 per cent de SDS/PAGE. Les proteïnes separades es van transferir posteriorment a membranes PVDF (MilliporeSigma) i es van bloquejar amb un 5% de llet desnatada en tampó TBS-0, 05% Tween-20 (TBST) durant 1 h a temperatura ambient. A continuació, es van incubar les membranes amb els següents anticossos primaris durant la nit a 4 °C: Anti‑NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; núm. cat. BS90949), anti‑ASC (1:1). ,000; BIOSS; núm. cat. bs-67412-R), anti-caspasa-1(1:1,000; Abcam; núm. cat. ab1872), anti-IL-1 (1:500; Abcam;núm. cat. ab9722), anti‑NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology,Inc.; núm. cat. BS60435), anti‑p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; núm. cat. BS4852), anti‑p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; núm. cat. BS60290), anti‑NF‑κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;

Després de la incubació d'anticossos primaris, les membranes es van rentar amb TBST tres vegades (10 min cada vegada) i es van incubar amb IgG anti-conill de cabra conjugada amb HRP (1:10,000; Affinity Biosciences; cat. núm. S. 0001) i anticossos secundaris d'IgG anti-ratolí de cabra (1:10.000 Affinity Biosciences; cat. núm. S0002) durant 1 h a temperatura ambient. Les bandes de proteïnes es van visualitzar mitjançant un kit ECL (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) i un sistema d'imatge Bioshine Chemi (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology). La densitat òptica de cada banda es va semiquantificar mitjançant el programari ImageJ 1.53a (Instituts Nacionals de Salut) i es va normalitzar a l'expressió GAPDH.

Anàlisi estadística.

Totes les dades es presenten com a mitjana ± SD de Major que o igual a 3 experiments independents. Es va utilitzar el programari GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.) per realitzar les anàlisis estadístiques. Es va realitzar un ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Tukey per comparar diferències entre grups. P< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultats

explorar si Rg1 alleuja la fibrosi hepàtica relacionada amb l'envelliment, es va mesurar la deposició de col·lagen als teixits del fetge mitjançant la tinció de Masson. Els resultats van mostrar que les zones positives blaves van augmentar significativament als teixits hepàtics del grup SAMP8 en comparació amb el grup SAMR1 (Fig. 2A i B). Tanmateix, en comparació amb el grup model SAMP8, els nivells de deposició de col·lagen es van reduir significativament en els grups de tractament de tempol, apocinina i Rg1 (5 i 10 mg/kg) (Fig. 2A i B). A més, es van mesurar els nivells d'expressió de col·lagen IV i TGF-1 en teixits hepàtics mitjançant tinció immunohistoquímica.

Els resultats de les tincions de col·lagen IV van revelar que el col·lagen IV s'expressava a nivells baixos en els teixits hepàtics del grup SAMR1 (Fig. 3A i C). Tanmateix, en comparació amb el grup SAMR1,

El tractament amb Rg1 redueix la producció de ROS i l'expressió de NOX4 al fetge dels ratolins SAMP8. ROS és un factor important en el desenvolupament de la fibrosi hepàtica (41). En el present estudi, es va utilitzar una sonda ROS, DHE, per detectar el nivell de producció de ROS als teixits hepàtics. Els resultats van mostrar que hi havia nivells baixos de producció de ROS als teixits hepàtics del grup SAMR1. No obstant això, en comparació amb el grup SAMR1, els nivells de producció de ROS van augmentar significativament en el grup SAMP8 (Fig. 4A i B), mentre que en comparació amb el grup SAMP8, el tractament amb tempol, apocinina i Rg1 (5 i 10 mg/kg) significativament. va reduir els nivells de producció de ROS als teixits hepàtics (Fig. 4A i B). Per confirmar l'efecte de NOX4 sobre l'acumulació de ROS durant l'envelliment, es van analitzar els nivells d'expressió de proteïnes relacionades amb NOX4. Els resultats van demostrar que, en comparació amb el grup SAMR1, els nivells d'expressió de NOX4, p22phox i p47phox als teixits del fetge estaven significativament regulats al grup SAMP8 (Fig. 5A-D).

Tanmateix, en comparació amb el grup SAMP8, el tractament amb tempol, apocinina i Rg1 (5 i 10 mg/kg) va reduir significativament els nivells d'expressió de NOX4, p22phox i p47phox als teixits hepàtics durant l'envelliment (Fig. 5A-D). Aquestes dades van suggerir que el tractament amb Rg1 pot millorar la lesió per estrès oxidatiu induïda per ROS als teixits hepàtics mitjançant la inhibició de NOX4 durant l'envelliment en ratolins.