Lamivudina millora la disminució cognitiva dels ratolins SAMP8: integració en l'avaluació farmacològica Vivo i la farmacologia de xarxa

Resum

Els inhibidors de la transcriptasa inversa com la lamivudina (3TC) tenen un paper importantanti edat, però els seus efectes sobremalalties neurodegeneratives causades per l'envellimentno estan clars, especialment sobre les funcions delsistema nerviós com la cognició. En aquest estudi, vam administrar 3TC a ratolins propensos a la senescència 8 (SAMP8) per perfusió gàstrica (100 mg/kg) durant 4 setmanes. Els nostres resultats van mostrar que 3TC va millorar significativamentestat d'envelliment dels ratolins SAMP8, especialment la disminució de la capacitat cognitiva avaluada per la prova del laberint aquàtic de Morris. Per investigar més els mecanismes moleculars demillora de l'estat d'envellimentde ratolins SAMP8 per 3TC, el qPCR i els mètodes de tinció de teixits es van utilitzar per estudiar els teixits cerebrals (és a dir, l'hipocamp i l'escorça) dels ratolins, mentre que l'anàlisi de farmacologia de xarxa es va aplicar per investigar els objectius potencials de 3TC. Els resultats van mostrar que els nivells d'ARNm dels gens es relacionaven amb l'element intercalat llarg-1, la resposta a l'interferó de tipus 1, el fenotip de secreció associada a la senescència iMalaltia d'Alzheimera l'hipocamp i al còrtex dels ratolins SAMP8 es van augmentar a causa desenescència, però aquesta tendència es va invertir parcialment per 3TC. Els resultats dels estudis histològics van mostrar que el 3TC va reduir la mort de les neurones de l'hipocamp, mentre que els resultats de l'anàlisi de la farmacologia de la xarxa van indicar que el 3TC pot exercir la seva influència a través de múltiples vies, inclosa la senyalització d'estrògens i les vies de senyalització d'interacció lligand-receptor PI3K/Akt. que hem comprovat mitjançant experiments in vitro. Aquestes troballes proporcionen evidència del potencial terapèutic del 3TC en el tractament de malalties neurodegeneratives.

PARAULES CLAUenvelliment, capacitat cognitiva, lamivudina, lun element intercalat-1, malalties neurodegeneratives

Efecte Cistanche d'herbes xinesesInhibidors de la transcriptasa inversa Sobre l'anti-envelliment

1|INTRODUCCIÓ

Fins ara, l'envelliment i les malalties neurodegeneratives, com araMalalties d'Alzheimer (AD) o Parkinsonvinculats a l'envelliment, estan en augment a causa dels canvis demogràfics globals.1,2 el declivi cognitiu representa un greu obstacle per aconseguir una vida llarga i saludable. Durant dècades, s'han dedicat esforços considerables a la recerca de medicaments que es puguin utilitzar per tractar la degeneració cognitiva amb l'envelliment.3 En els darrers anys, l'element llarg intercalat-1 (L1) ha guanyat una atenció creixent com a novetat potencial. objectiu per estudiar la senescència.4 L'L1 pertany a la família més abundant de retrotransposons de repetició terminal no llarga amb ~500,000 còpies, que comprenen ~17% del genoma humà. El gen L1 consta d'un operó amb dos marcs de lectura oberts (ORF1 i ORF2), tots dos necessaris per a la retrotransposició5–7. lamivudina (2'-3'-desoxi-3'-tiocitidina, 3TC).8

L1 actiu pot sintetitzar ADNc fora de la cromatina i després reinserir-lo al genoma catalitzat per ORF1p, alterant finalment l'expressió d'altres gens i donant lloc a malalties associades a la inestabilitat genòmica.9,10 L'hoste generalment inhibeix l'activitat transposable de L1 mitjançant una sèrie. de regulacions, com ara la modificació epigenètica i la regulació del factor limitant de l'hoste.11,12 La transposició de L1 generalment només es produeix en cèl·lules germinals o cancerígenes, mentre que estudis recents han demostrat que L1 també és molt activa al sistema nerviós central o a les cèl·lules envellides, tot i que els mecanismes neuronals subjacents de L1 no estan clars.13 Els estudis han demostrat que els factors (per exemple, TREX1, RB1 i FOXA1) relacionats amb el mecanisme de monitorització de L1 són disfuncionals en la senescència cel·lular, donant lloc a l'activació de L1. TREX1 és un exonuclear 3' que degrada els ADN invasors estrangers i la seva pèrdua s'ha associat amb l'acumulació d'ADNc L1 citoplasmàtic.14 S'ha demostrat que RB1 s'uneix a elements repetitius, inclosos els elements L1, i afavoreix la seva heterocromatinització.15 I FOXA1 és regulat a l'alça a les cèl·lules senescents13 i unit a la regió central de la L1 5' UTR. L'activat L1 activa encara més la resposta d'interferó de tipus I (IFN-I), que indueix la inflamació mitjançant l'ADNc de transcripció inversa i manté el fenotip de secreció associada a la senescència (SASP). Per tant, com a factor important en la inflamació asèptica causada per l'envelliment, la L1 es considera un objectiu important per al tractament de malalties relacionades amb l'envelliment. En els ratolins grans tractats amb 3TC, l'acumulació de factors inflamatoris es millora mitjançant la inhibició de la transcripció extracel·lular de L1 en teixits musculars i altres.16 Fins ara, els estudis dels efectes dels inhibidors de la transcriptasa inversa sobre les funcions del sistema nerviós són escassos. Recentment, s'han trobat milers de variants d'ADNc genòmic (gencDNA) en el cervell de pacients morts amb MA, com a resultat de la reinserció de variants característiques d'empalmament d'ARN al genoma.17 Aquest fenomen es considera una causa important de la MA. Els factors que causen la generació de gencDNA inclouen la transcripció, la destrucció de l'ADN, la transcriptasa inversa i l'envelliment.

Els estudis han demostrat que el procés de formació de gencDNA es bloqueja mitjançant l'ús d'inhibidors nucleòsids de la transcriptasa inversa en línies cel·lulars d'ovari de hàmster xinès (CHO) amb activitats endògenes de transcriptasa inversa. durant molt de temps es va desenvolupar l'AD.20 Per tant, especulem que el 3TC, com a inhibidor de la transcriptasa inversa, pot ser un fàrmac potencial per al tractament del deteriorament cognitiu i les malalties neurodegeneratives causades per l'envelliment. Es va demostrar que els ratolins propensos a l'acceleració de la senescència 8 (SAMP8), com a model per estudiar l'envelliment humà i les malalties relacionades amb l'edat, mostren moltes característiques que se sap que es produeixen en les primeres etapes de les malalties neurodegeneratives, com ara l'augment de l'estrès oxidatiu, la neuroinflamació i la cognició. Per tant, en aquest estudi es van seleccionar ratolins SAMP8 com a model animal ideal per a malalties neurodegeneratives causades per l'envelliment. Ens vam centrar en els efectes cognitius del 3TC en ratolins d'envelliment prematur i en les vies moleculars associades a l'envelliment, proporcionant evidència del paper dels inhibidors de la transcriptasa inversa en el tractament de malalties neurodegeneratives a causa de l'envelliment. A més, vam aplicar el mètode de farmacologia de xarxa per predir els objectius del 3TC, construir xarxes i analitzar les funcions i vies biològiques relacionades amb el 3TC.

2|SECCIÓ EXPERIMENTAL 2.1 |

Animals Els ratolins SAMP8 mascles d'{0}}setmanes d'edat i els ratolins R1 accelerats per la senescència normal (SAMR1) proporcionats per la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Tianjin es van utilitzar després d'un període d'aclimatació de 1-setmanes. El protocol experimental amb animals va ser aprovat pel Comitè d'Ètica Animal de l'Hospital Provincial de Shandong i es va realitzar basant-se en la Guia dels Instituts Nacionals de Salut (NIH) per a la cura i l'ús d'animals de laboratori. Els ratolins es van mantenir en gàbies autoclaus i es van donar menjar i aigua estèrils. Els pesos corporals dels ratolins es van registrar cada dia. A la figura 1A es mostra un diagrama de flux dels experiments realitzats en aquest estudi. Un cop finalitzats els experiments, els ratolins van ser sacrificats per inhalació d'èter dietílic.

2.2|Preparació i tractament de 3TC

Els medicaments es van preparar recentment el dia de cada experiment. El 3TC comprat a MCE (Xangai, Xina) es va dissoldre en DMSO fins a una concentració final de 2 mmol/L. A continuació, la solució de reserva es va diluir fins a la concentració de treball utilitzant aigua potable amb la concentració final de DMSO inferior al 0,1 per cent. Es van establir tres grups de ratolins: un grup control tractat amb solució de vehicle (aigua potable), un grup de prova tractat amb 3TC i el grup SAMR1 que va rebre vehicle utilitzat com a altre grup de control per a l'envelliment. El grup de prova va rebre per via oral 3TC a una dosi de 100 mg/kg per dia. Tots els ratolins van ser alimentats per administració intragàstrica durant 4 setmanes (figura 1B).

FIGURA 1 Disseny experimental i efectes del 3TC en la millora de la pèrdua de pes relativa a causa de les puntuacions de classificació de l'envelliment i la senescència. (A) Diagrama de flux dels experiments farmacològics per estudiar l'efecte del 3TC sobre la capacitat cognitiva dels ratolins SAMP8. (B) Presentació esquemàtica del calendari d'experiments amb animals. (C) El flux de treball conceptual per predir les interaccions medicament-objectiu mitjançant Pharmmapper que mostra, d'esquerra a dreta, l'estructura molecular de 3TC, el diagrama estructural 3D de 3TC i el model de farmàcòfor predit amb la unió de 3TC al receptor d'estrògens amb el més alt normalitzat. puntuacions d'ajust. (D) El patró de creixement del pes corporal en cada grup de ratolins. (E) Canvis en les puntuacions de qualificació abans i després del tractament de 3TC. Vehicle SAMR1 més: 44-ratolins SAMR1 d'una setmana d'edat tractats amb vehicle durant 4 setmanes. Vehicle SAMP8 més: 44-ratolins SAMP8 d'una setmana d'edat tractats amb vehicle durant 4 setmanes. SAMP8 més 3TC: 44-ratolins SAMP8 d'una setmana d'edat tractats amb 3TC durant 4 setmanes. Prova t de l'estudiant: *p < 0.05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. ns: cap significació estadística. Els asteriscs negres representen una comparació amb el grup de vehicles SAMR1 plus. Els asteriscs vermells representen una comparació amb el grup de vehicles SAMP8 plus. La línia blava marca el grup SAMP8 més 3TC a l'edat de 44 i 48 setmanes.

2.3|Sistema de puntuació de qualificació

El grau de senescència dels ratolins es va avaluar mitjançant un sistema de qualificació descrit anteriorment.22 Cada categoria de puntuacions conté cinc nivells, que van des de 0 fins a 4, amb la puntuació més alta del grau indicant el grau més alt de senescència de l'animal. . Les puntuacions de cada categoria van ser avaluades per separat per quatre experimentadors experimentats que estaven cecs a les condicions del tractament (taula complementària S1).

.2.4|Prova del laberint d'aigua de Morris

Els estudis de laberints d'aigua de Morris es van realitzar segons el protocol de Morris, incloent un experiment de navegació d'orientació i proves de sondes.23 El laberint d'aigua era una piscina circular (120 cm de diàmetre equipada amb una plataforma de 10 cm de diàmetre) i s'omplia d'aigua a 25 cm. ± 1 grau. Els ratolins van ser entrenats per trobar la plataforma sota la superfície de l'aigua en un minut. Si el ratolí no trobava la plataforma en 60 s, se'l va guiar a la plataforma i se'l permetia romandre durant 20 s. Cadascun dels ratolins es va entrenar cinc vegades al dia, separats els uns dels altres durant 15 minuts. En cada assaig, la posició inicial era diferent, en un ordre pseudoaleatori. El sisè dia de la prova, es va retirar la plataforma i l'animal va entrar al laberint aquàtic des d'un punt oposat al quadrant del laberint on hi havia la plataforma durant l'entrenament i es va permetre explorar el laberint durant 60 s. El camí de natació i la quantitat de temps que els ratolins van passar buscant el laberint van ser gravats per la càmera de vídeo i analitzats mitjançant EthoVision XT (Noldus Software). Cada grup estava format per un mínim de vuit animals.

2,5|Extracció d'ARN i PCR quantitativa

L'ARN total es va extreure dels teixits de l'hipocamp i corticals dels ratolins després dels tractaments amb TRIzol Reagent (Invitrogen) segons el protocol del fabricant. Cada mostra d'ARN (1 ug) es va transcriure inversament per generar ADNc mitjançant el kit de transcripció inversa d'ADNc (Takara) i després es va amplificar per PCR mitjançant el kit TaKaRa Taq (Takara). Els conjunts de primers es descriuen a la taula complementària S2.

2,6|Preparació de teixits

Els animals van ser anestesiats amb èter dietílic i els seus cervells es van recollir després de la perfusió transcàrdica amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i una solució de paraformaldehid al 4%. Els teixits cerebrals es van eliminar i es van fixar en paraformaldehid durant més de 2 dies. Els cervells fixos es van incrustar en parafina amb el teixit de l'hipocamp seccionat amb un gruix de 5 μm.

2,7|Tinció d'hematoxilina i eosina (H & E).

La morfologia del cervell es va analitzar mitjançant mètodes de tinció d'hematoxilina i eosina (H & E). Les seccions de parafina dels teixits de l'hipocamp es van desparafinar i es van deshidratar amb un gradient d'alcohol d'una sèrie de concentracions. La tinció HE es va realitzar mitjançant un kit de tinció H & E (Solarbio) segons les instruccions del fabricant. Després d'haver estat immersos en etanol i xilè, les seccions es van muntar amb resina i es van observar al microscopi de llum (Olympus).

2,8|Tinció de Nissl

Es va utilitzar el mètode de tinció de Nissl (Biyuntian) per detectar la lesió neuronal a les seccions dels teixits de l'hipocamp. Les seccions es van incubar amb una taca de Nissl durant 30 min i es van rentar amb etanol al 95%. Les cèl·lules tacades es van comptar i es van fotografiar amb un microscopi de llum (Olympus). Es van comptar les cèl·lules en tres camps no superposats seleccionats aleatòriament a cada diapositiva del teixit de l'hipocamp amb l'índex de supervivència definit com el nombre de neurones supervivents/nombre total de neurones.

2,9|Tinció de TUNEL

Es van incubar seccions de teixits de l'hipocamp amb una solució de proteinasa K durant 15 min seguits d'incubació amb la barreja de reacció TUNEL (Beyotime). Després de rentar-se tres vegades amb PBS, les seccions es van muntar amb una solució de muntatge que contenia el colorant nuclear DAPI i es van observar mitjançant un microscopi de fluorescència convencional o un microscopi de fluorescència làser confocal.

2.10|Construcció de la base de dades target de 3TC

La base de dades objectiu de 3TC es va construir a partir de dues bases de dades. En primer lloc, es van identificar els objectius potencials de 3TC mitjançant el mapa gènic farmacodinàmic invers basat en la base de dades Pharmmapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Chembiodraw va convertir tots els components químics al format ".mol2" i es van penjar a la base de dades Pharmmapper (figura 1C). Les molècules amb una puntuació d'ajust normalitzat superior a 4.0 es van identificar com a objectius potencials de 3TC. En segon lloc, es va utilitzar la base de dades ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) per consultar les activitats biològiques d'objectius o compostos. Les proteïnes verificades com a derivades de l'Homo sapiens es van identificar com a objectius potencials de 3TC.

2.11|Anàlisi de la interacció de proteïnes diana i construcció de xarxes

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 es van seleccionar a la configuració dissenyada després d'eliminar els duplicats.

Per investigar exhaustivament els mecanismes moleculars de 3TC, les xarxes PPI es van construir mitjançant la versió 3.6 del programari Cytoscape.0.(http://www.cytoscape.org/). L'anàlisi de graus dels nodes es va realitzar amb el Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape) per examinar els gens del concentrador a les xarxes amb el valor de centralitat de proximitat, el valor de centralitat d'intermediació i el valor de centralitat de grau establerts a {{6 }}.2, 450 i 50, respectivament.

2.12|Enriquiment i cribratge de vies de senyalització per a 3TC

Es va dur a terme l'anàlisi d'enriquiment d'ontologia gènica (GO) amb processos biològics, components cel·lulars i funcions moleculars de dianes potencials per a l'anotació de funcions biològiques basades en una base de dades bioinformàtica DAVID (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Les vies metabòliques de KEGG es van anotar a partir de les bases de dades de l'Enciclopèdia de gens i genomes de Kyoto (KEGG) mitjançant el servidor d'anotació automàtica KEGG en línia (http://www.genome.jp/kegg/)

2.13|Vinculació de 3TC als objectius previstos

Els fitxers d'estructura SDF del compost 3TC es van obtenir al lloc web de Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). El programari OpenBabel2.3.2 va transformar el fitxer SDF en un fitxer PDB i les proteïnes receptores ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) i EGFR (PDBID:6S9C) es van obtenir de la base de dades del Protein Data Bank (www.wwpdb). .org). Es va utilitzar el programari PYMOL2.3.4 per eliminar l'aigua i els lligands de les proteïnes receptores. L'estudi d'acoblament es va realitzar mitjançant AutoDock Vina (1.1.2), que és un programari d'acoblament molecular de codi obert desenvolupat per Scripps. Es va utilitzar el programari d'eines per modificar les quatre proteïnes del receptor i es va utilitzar l'ordre Grid Box del programa Grid per obrir l'eina Grid Option per analitzar cada proteïna del receptor. L'espaiat de la gelosia es va establir a 1 i el centre de la butxaca es va establir com a centre del lloc d'enquadernació.

2.14|Cultiu i tractament cel·lular

Les línies cel·lulars neuronals de l'hipocamp del ratolí HT22 es van comprar a la Shanghai Cell Biotechnology Company. Les cèl·lules HT22 es van cultivar en DMEM complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS). Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 6-pous 1 dia abans dels tractaments experimentals. La senescència de les cèl·lules va ser induïda per formaldehid (FA), comprat a Sigma-Aldrich, com es va descriure anteriorment.24 Les cèl·lules HT22 es van dividir en tres grups, inclòs el grup FA tractat amb 30 µmol/L FA durant 24 h, el FA/3TC. grup tractat amb 30 µmol/L FA i 50 µmol/L 3TC, i el grup control cultivat sense FA ni 3TC.

2,15|Immunofluorescència i microscòpia

Es va eliminar el medi i es van fixar les cèl·lules amb una solució de paraformaldehid al 2% durant 1 h a temperatura ambient. L'experiment d'immunofluorescència es va dur a terme tal com s'ha descrit anteriorment.25 Els anticossos utilitzats en aquest estudi van incloure l'anticòs anti LINE-1 ORF1p (1:1000; Sigma-Aldrich) amb l'anticòs secundari Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) . Les cèl·lules es van incubar amb DAPI (dilució 1:500; Thermo Fisher Scientific) durant 1 min per etiquetar els nuclis. Després d'afegir l'agent de muntatge anti-fluorescència, es van observar les cèl·lules mitjançant un microscopi confocal (Nikon). 2,16|Anàlisi Western blot

Les expressions d'EGFR, p-AKT1 (Active Akt1: fosforilat a S473) i ADRB2 es van mesurar mitjançant anàlisi Western blot. La proteïna total es va recollir de les cèl·lules després de diversos tractaments. Es va realitzar Western blot tal com es va descriure anteriorment.26 Els anticossos utilitzats en aquest estudi incloïen un anticòs anti-EGFR (1:500; Sigma-Aldrich), un anticòs anti-pAKT1 (1:1000; Sigma-Aldrich) i un anticòs anti-ADRB2 (1:200; Sigma-Aldrich) amb anticòs secundari anti-conill (1:1.000; Invitrogen). Després del rentat, les taques es van desenvolupar amb el sistema de detecció ECL Western blotting (Amersham, Aylesbury, Regne Unit).

2.17|Anàlisi de dades i estadístiques

Cada experiment es va repetir almenys tres vegades i es va considerar vàlid amb els assaigs mostrant resultats similars. Els resultats es van presentar com a mitjana ± desviació estàndard (DE). La diferència significativa es va determinar mitjançant la prova t de Student amb p < 0,05.

Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: més 86 15292862950