Cistanche Tubulosa indueix l'apoptosi mediada per espècies d'oxigen reactiu de cèl·lules de càncer de còlon humà primàries i metastàtiques

INTRODUCCIÓ

El càncer colorectal és un dels càncers més freqüents a tot el món (Brenneret al., 2014), i la seva incidència augmenta constantment amb uns 2,4 milions de casos estimats el 2035, a causa de la dieta i estil de vida moderns, juntament amb la reducció de l'activitat física. Els esforços actuals no són suficients per combatre l'epidèmia actual de càncer colorectal i, per tant, calen enfocaments nous per a una prevenció i un tractament efectius, inclosos els canvis en l'estil de vida en combinació amb intervencions alternatives més segures, com araFitoterapèutica (Weidneret al., 2015). La fitoteràpia, l'ús de plantes medicinals per tractar malalties, ha estat una part inevitable de la història humana antiga. Les plantes medicinals s'han utilitzat durant molt de temps com a fonts de tractament alternatives per al càncer, representant més del seixanta per cent dels agents anticancerígens utilitzats en la medicina convencional (Balunas i Kinghorn, 2005; Saibu).et al., 2015). Alguns dels exemples més coneguts inclouen extractes deCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) i Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg i Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Es va demostrar que diversos extractes d'herbes i fitoquímics exerceixen efectes antitumorals en el càncer colorectal atribuïts a la inducció de la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i a l'apoptosi associada de cèl·lules canceroses com en el cas dels extractes deMelissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Entre els candidats a fitoterapèutics,Cistanche tubulosa, una planta del desert paràsit Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) que es troba àmpliament distribuïda a les regions àrides i semiàrides d'Àfrica, Àsia i la regió mediterrània, s'ha demostrat que té propietats medicinals valuoses. Cistanche tubulosa s'ha utilitzat àmpliament en la medicina tradicional i es suggereix que té efectes curatius en la deficiència renal, la leucorrea mòrbida, la metroràgia, la infertilitat femenina i el restrenyiment senil (Jiang et al., 2009). A més dels seus usos medicinals tradicionals, hi ha importants Les propietats de Cistanche Tubulosa s'han estudiat intensivament durant l'última dècada, incloent efectes vasorelaxants (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotectors (Morikawa et al, 2010), antihiperglucèmics i hipolipidèmics (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa també es va suggerir com un potent potenciador del sistema immunitari, un promotor de la formació òssia i un agent anti-envelliment i anti-fatiga (Xu et al., 2014). A més, s'ha demostrat que l'extracte de Cistanche tubulosa bloqueja la deposició d'amiloide en el model de malaltia d'Alzheimer (Wu et al., 2015). Malgrat els seus diversos usos terapèutics, encara no s'ha estudiat l'efecte de Cistanche Tubulosa com a agent anticancerígen potencial.

En el present treball, hem investigat l'efecte anticancerígen de Cistanche Tubulosa en dues línies cel·lulars de càncer de còlon primari i dos metastàtics i els mecanismes potencials subjacents a aquest efecte.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALS I MÈTODES

Recollida i preparació d'extracte vegetal

Les mostres de Cistanche tubulosa es van recollir de les zones desèrtiques de Qatar l'any 2014 i l'herbatòleg va confirmar l'autenticitat de la planta. Les mostres de vals s'arxiven al Departament de Toxicologia i Polivalent de l'ADLQ. Les mostres de plantes assecades al sol es van triturar amb Retsch Knife Mill Grindomix GM300 en pols fina. Es van extreure vint grams de pols amb 200 ml d'aigua ultrapura durant la nit a 37 graus en un agitador rotatiu a 200 rpm. El cruExtractes de Cistanche tubulosa (CTE)es van centrifugar durant 30 min a 8000 rpm per acumular compostos no solubles, es va recollir el sobrenedant i es va liofilitzar amb un liofilitzador Labconco Freezone 6 plus. L'extracte sec es va reconstituir en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM, SIGMA, Alemanya) a una concentració de 20 mg/ml i es va filtrar estèril a través d'un filtre de membrana de 0,2-micres.

Línies cel·lulars i manteniment cel·lular

Les línies cel·lulars de carcinoma de còlon humà CaCo2, SW620 i LoVo es van obtenir del Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Alemanya), mentre que la línia cel·lular HCT 116 va ser un regal amable del Departament de Ciències Biològiques i Ambientals de la Universitat de Qatar. CaCo2 i HCT11 es van derivar del lloc primari del carcinoma de còlon mentre que SW620 i LoVo es van derivar del lloc metastàtic. Les cèl·lules SW620, HCT116 i LoVo es van cultivar i es van mantenir al medi DME mentre que les cèl·lules CaCo2 es van mantenir al mitjà essencial mínim d'Eagle (EMEM, SIGMA, Alemanya). Les cèl·lules es van cultivar com a monocapa cultivada a 37 graus en un medi respectiu complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS, SIGMA, Alemanya) i un 1% de penicil·lina/estreptomicina (SIGMA, Alemanya) en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de diòxid de carboni.

Assaig de viabilitat cel·lular

L'assaig {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]{-2,{5-difeniltetrazoli (MTT) es va utilitzar per avaluar l'activitat citotòxica de CTE de la mateixa manera que es va descriure anteriorment (Jaganjac et al., 2010). La densitat de sembra de cèl·lules CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo cultivades en plaques de 96-pou va ser de 104 cèl·lules per pou. Les cèl·lules es van xapar en un medi respectiu complementat amb un 10% de FBS 24 hores abans del tractament. Després de 24 hores, es va eliminar el medi i les cèl·lules es van tractar amb 0, 0, 25, 0, 5, 1 i 2 mg/ml de CTE durant 24, 48 i 72 hores a 37 graus en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de CO2. Després del tractament CTE, es va eliminar el medi i es van afegir 40 µL de solució MTT (0, 5 mg/mL) a cada pou.

Després de 3 h d'incubació, es va eliminar la solució MTT, el producte de formazà es va dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO, SIGMA, Alemanya) i es va mesurar l'absorbància a 590 nm amb un lector de microplaques (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Suïssa) .

Assaig d'apoptosi

L'apoptosi a les cèl·lules CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo es va detectar mitjançant PE Annexin V Apoptosi Detection Kit I amb 7-Amino-Actinomicina D ({7-AAD) com a colorant vital (Becton Dickinson International, Bèlgica) segons les instruccions del fabricant. Breument, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 24-pous a una densitat de 5 × 104 cèl·lules/pou en un medi respectiu complementat amb un 10% de FBS durant 24 hores abans de l'addició de CTE (0, 0, 5). , o 1 mg/ml). Després de la incubació de 24 CTE, les cèl·lules es van collir, es van rentar dues vegades amb solució salina freda tamponada amb fosfat i es van tenyir amb ficoeritrina (PE) Annexina V i 7-AAD durant 15 minuts a temperatura ambient a la foscor. Les cèl·lules tacades es van analitzar en 1 hora mitjançant citometria de flux mitjançant FACS. Citòmetre de flux Aria III i programari FACSDiva (Becton Dickinson) a un cabal baix amb un mínim de 104 cèl·lules. El tractament de les cèl·lules durant 4 hores amb camptotecina 6 µM (SIGMA) es va utilitzar com a control positiu per a l'assaig.

Producció intracel·lular de ROS

La producció intracel·lular de ROS es va examinar mitjançant 2,7- diacetat de diclorodihidrofluoresceïna (DCFH-DA, SIGMA, Alemanya). DCFH-DA és una sonda no fluorescent, que s'oxida amb ROS intracel·lular al compost fluorescent 2, 7- diclorofluoresceïna (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). El test DCFH DA es va realitzar de la mateixa manera que hem descrit abans (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Breument, la densitat de sembra de cèl·lules CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo cultivades en 96-plaques negres va ser de 104 cèl·lules per pou. Les cèl·lules es van xapar en un medi respectiu complementat amb un 10% de FBS durant 24 hores. Abans del tractament, les cèl·lules es van incubar amb 10 µM de DCFH-DA a 37 graus durant 30 min en un 5% de CO2 / 95% d'aire. A continuació, es van rentar les cèl·lules i es van tractar amb 0, 0, 5 i 1 mg/mL de CTE en el medi sense vermell de fenol. La formació intracel·lular de ROS es va controlar contínuament durant 25 hores a 37 graus i un 5% de CO2 mitjançant un lector de microplaques amb fluorescència superior i mòdul de control de gas (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suïssa). La intensitat de la fluorescència es va mesurar amb una longitud d'ona d'excitació de 500 nm i detecció d'emissions a 529 nm. Les unitats arbitràries, unitats de fluorescència relativa (RFU), es basaven directament en la intensitat de la fluorescència.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ RENOL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generació de superòxids mitocondrials

La capacitat del CTE per induir la generació de superòxids per part dels mitocondris es va estimar mitjançant la sonda MitoSOX Red (Life Technologies) i Hoechst 33342 per a la tinció nuclear (Life Technologies) dirigida a mitocondris. Les cèl·lules CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo es van sembrar en plaques 96-pous a una densitat d'104 cèl·lules per pou en un medi respectiu complementat amb un 10% de FBS durant 24 hores . A continuació, es van carregar les cèl·lules amb 4 µM de MitoSOX i 2 µM de Hoechst 33342 durant 20 min, es van rentar l'excés de colorant i es van tractar els pous amb 0, 0, 5 i 1 mg/mL de CTE durant 24 hores a 37 graus i 5% de CO2. La intensitat de la fluorescència es va mesurar amb una longitud d'ona d'excitació de 510 nm i detecció d'emissions a 580 nm per a MitoSOX i una longitud d'ona d'excitació de 350 nm i detecció d'emissions a 461 nm per Hoechst 33342 mitjançant un lector de microplaques amb fluorescència superior PRO, Tefinite 200 ( AG, Suïssa)

Anàlisi estadística

Les estadístiques descriptives es van mostrar com a mitjana +/− SD. La importància de les diferències entre grups es va avaluar mitjançant la prova t de Student i la prova de la Chi quadrat. Quan es van comparar més de dos grups, vam utilitzar ANOVA unilateral amb proves post hoc adequades. S'ha utilitzat l'SPSS 11.01 per a Microsoft Windows. Les diferències amb P inferior a 0,05 es van considerar estadísticament significatives.

RESULTATS

L'efecte de CTE sobre la proliferació de línies cel·lulars de càncer de còlon humà es mostra a la figura 1. Totes les concentracions de CTE provades van mostrar un fort efecte inhibidor sobre la línia cel·lular CaCo2 de manera depenent del temps i de la concentració (figura 1A). Setanta-dues hores de tractament amb CTE van inhibir el creixement de cèl·lules CaCo2 en més d'un 60% en comparació amb el control (p <0.{05 per a totes les concentracions). També es va detectar un impacte significatiu del tractament amb CTE en el creixement de les cèl·lules HCT116 en tots els punts del temps a les dues concentracions més altes (1 mg/mL i 2 mg/mL), assolint una reducció superior al 70% en la darrera concentració (figura 1B, p <0,05). Tot i que les dues concentracions més baixes de CTE (0,25 i 0,5 mg/mL) van reduir significativament el creixement de les cèl·lules HCT116 després de 24 hores (p.<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). La inhibició de la proliferació depenent del temps i de la concentració amb CTE es va confirmar encara més a les cèl·lules LoVo en més d'un 60% a la concentració més alta (p <0.05) (Figura 1C), i les quatre concentracions de CTE provades van reduir el creixement de les cèl·lules SW620 després de 48 hores (figura 1D, p <0,05 per a tots). Després de 72 hores de tractament, el mateix efecte es va observar només per a les dues concentracions més altes (p < 0, 05), mentre que les concentracions de 0, 25 i 0, 5 mg/mL no van mostrar cap efecte significatiu en comparació amb el control (p > 0, 05). L'impacte del tractament CTE de 0, 5 i 1 mg/mL en la inducció de l'apoptosi es va provar més a les quatre línies cel·lulars (figura 2). Es va detectar un augment del nombre de cèl·lules en l'apoptosi primerenca a HCT116 i LoVo després d'un tractament de 24-hora amb 0,5 mg/ml (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:Efecte deCistanche tubulosasobre la viabilitat de les línies cel·lulars de càncer de còlon. La viabilitat cel·lular mesurada mitjançant l'assaig MTT de cèl·lules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 es presenta com a percentatge de la línia cel·lular de càncer de còlon control no tractada. Es donen els valors mitjans (± SD) per a 5 rèpliques de l'experiment representatiu: (*) significació p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2: L'extracte d'aigua de Cistanche tubulosa indueix apoptosi en cèl·lules humanes de càncer de còlon. Les anàlisis de citometria de flux Annexin-V-FITC de cèl·lules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 es presenten com a percentatge de la línia cel·lular de càncer de còlon control no tractada. Es donen els valors mitjans (± SD) per a 3 rèpliques de l'experiment representatiu: (*) significació p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 3: L'extracte d'aigua de Cistanche tubulosa indueix la producció intracel·lular de ROS depenent del temps i de la dosi. La producció de ROS mesurada per l'assaig DCFH-DA a les cèl·lules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 es presenta com a valors RFU mitjans (± SD) per als respectius 5- rèplicats de un experiment representatiu. (*) Significat pàg<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Fig. 4: L'extracte d'aigua de Cistanche tubulosa indueix la producció de superòxid mitocondrial a les cèl·lules humanes de càncer de còlon. La intensitat de fluorescència de la sonda MitoSOX Red dirigida a mitocondris a les cèl·lules A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 es presenten com a percentatge de la línia cel·lular de càncer de còlon de control no tractada. Es donen els valors mitjans (± SD) per a 5 rèpliques de l'experiment representatiu: (*) significació p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISCUSSIÓ

Tot i que estudis anteriors han informat de nombroses propietats medicinals de Cistanche tubulosa, aquest és el primer informe del seu efecte antiproliferatiu en cèl·lules malignes. Els compostos bioactius de Cistanche tubulosa extrets amb aigua, un dissolvent altament polar, van mostrar una forta bioactivitat anticancerígena. Anteriorment hem comparat l'eficiència de Cistanche tubulosa solubilitzada en aigua amb altres dissolvents com el metanol i l'acetat d'etil, però els extractes d'aigua van mostrar les activitats anticancerígenes més prometedores (dades no mostrades).

Hem demostrat la capacitat del CTE a 1 mg/mL i 2 mg/mL per inhibir el 60% del creixement de les línies cel·lulars de càncer de còlon primari i metastàsic, revelant un paper potencialment important deCistanche tubulosacom a tractament del càncer de còlon. En comparació amb les cèl·lules normals, les cèl·lules canceroses es caracteritzen generalment per una alteració de l'homeòstasi redox i una estratègia comuna de les teràpies anticancerígenes actuals és augmentar l'estrès oxidatiu cel·lular (Yang et al, 2013). Tot i que els nivells fisiològicament baixos de ROS tenen un paper important com a molècules de senyalització, la producció excessiva de ROS pot contribuir a la inestabilitat i la malignitat del càncer (Liou i Storz, 2010). Paradoxalment, aquest desequilibri en l'homeòstasi redox cel·lular fa que les cèl·lules canceroses siguin més vulnerables a la mort cel·lular induïda per ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira i Hay, 2013). L'efecte antiproliferatiu del CTE informat en aquest estudi pot estar mediat per diversos mecanismes extra i intracel·lulars de compostos coneguts i desconeguts dins de l'extracte, dirigint-se a múltiples vies que tenen un paper essencial en l'apoptosi. Per diferenciar entre diferents modes de mort cel·lular, vam investigar el mecanisme potencial responsable de la citotoxicitat induïda per CTE observada.

EXTRACTE DE CISTANCHE TUBULOSA Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Les nostres dades indiquen que CTE augmenta la producció intracel·lular de ROS i, en conseqüència, la mort cel·lular induïda per ROS. L'estat Redox de la cèl·lula també té un paper crucial en la regulació de l'apoptosi i la cadena de transport d'electrons mitocondrials és un dels principals llocs de generació de ROS cel·lular (Trachootham et al., 2008). A més, el ROS intracel·lular podria provocar apoptosi cel·lular tant per vies dependents dels mitocondris com per vies independents (Sinha et al., 2013). De fet, les nostres dades també indiquen que l'externalització de la fosfatidilserina induïda per CTE és un efecte comú en l'apoptosi, tant en línies cel·lulars de càncer primàries com metastàtiques, cosa que suggereix que el mecanisme de mort induïda per CTE està mediat per l'apoptosi en lloc de la necrosi. L'activació de l'apoptosi a les cèl·lules canceroses és una estratègia correctiva i molts fàrmacs anticancerígens poden exercir efectes apoptòtics a les cèl·lules canceroses.

Per tant, els compostos o extractes amb activitats pro-apoptòtiques en cèl·lules canceroses són potencialment útils en la investigació de fàrmacs anticancerígens (Wong, 2011). Per determinar si l'efecte pro-apoptòtic induït per CTE està mediat pel mecanisme ROS induït per mitocondris, es va mesurar la producció de superòxid mitjançant una sonda fluorescent dirigida a mitocondris en cèl·lules tractades amb CTE. Les nostres dades mostren clarament que el CTE estimula la producció de superòxid mitocondrial, cosa que suggereix que l'activitat anticancerígena de Cistanche tubulosa està, almenys en part, mediada pel mecanisme ROS induït per mitocondris.

CONCLUSIONS

En conclusió, les nostres dades suggereixen que l'extracte d'aigua de la planta del desert Cistanche tubulosa pot representar un candidat prometedor per a un enfocament anticancerígen en combinació amb altres teràpies convencionals per a la prevenció i el tractament del càncer de còlon. També demostrem que la toxicitat de l'extracte vegetal contra les cèl·lules canceroses està mediada per l'augment de la producció intracel·lular de ROS i, almenys en part, per l'apoptosi dependent dels mitocondris. S'estan realitzant estudis addicionals per aïllar i caracteritzar els components biològicament actius individuals responsables de l'activitat anticancerígena.

Es necessiten més investigacions per avaluar l'ús potencial d'aquest extracte com a agent quimiopreventiu eficaç i per entendre els mecanismes d'acció sobre les cèl·lules canceroses de còlon a nivell molecular. També es necessiten estudis preclínics i clínics addicionals per confirmar els efectes beneficiosos per a la salut observatsCistanche tubulosa per a la prevenció del càncer.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE MILLORA LA MEMÒRIA ANTI-FATIGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%