Cistanòsid de Cistanche Herba millora el dany reproductiu masculí induït per la hipòxia mitjançant la supressió de l'estrès oxidatiu-Ⅱ

Efectes de Cis sobre la viabilitat de cèl·lules GC-1 induïda per la hipòxia in vitro.

Per investigar si Cis pot prevenir els efectes inhibidors de la hipòxia sobre la viabilitat de les cèl·lules GC{{{0}}, es va realitzar un assaig CCK-8. Les cèl·lules GC-1 es van tractar amb diferents subtipus (Cis-A, B, C, H) i intervals de concentració (0.02 μM, 0,2 μM, 2 μM) de Cis durant 72 h. Una comparació del grup model amb el grup DMSO va mostrar que DMSO no va promoure directament la viabilitat de les cèl·lules GC{{10}} (figura 2A). Tanmateix, les viabilitats cel·lulars es van restaurar notablement (P <0.05) amb tractaments Cis. En comparació amb el grup model, Cis-A, Cis-B, Cis-C i Cis-H van mostrar certs efectes protectors sobre el dany induït per la hipòxia a la viabilitat de les cèl·lules GC-1, i Cis-B va mostrar el més significatiu. efecte (figura 2A). Els efectes protectors de Cis a 0,2 μM eren significativament superiors als efectes protectors de Cis a 0,02 μM, mentre que la diferència entre 2 μM i 0,2 μM no era òbvia, cosa que indica que el restaurat La viabilitat cel·lular GC-1 induïda per Cis va demostrar un augment depenent de la dosi en el rang de concentració des de 0.02-0,2 μM (figura 2A). Per tant, segons les necessitats experimentals, es va seleccionar 0, 2 μM Cis com a concentració òptima en els següents experiments in vitro. Per confirmar encara més si les cèl·lules germinals estaven realment protegides per la tinció de Cis, FCM i Ki-67 es va realitzar per avaluar l'alteració de la proliferació de cèl·lules GC-1 després del tractament amb Cis. Amb el tractament Cis, es va reduir la proporció de cèl·lules GC-1 a la fase G1. En canvi, més cèl·lules van entrar a la fase S, cosa que suggereix que el tractament amb Cis podria augmentar l'índex de proliferació de cèl·lules germinals (P <0, 01; Figura 2B). Les estadístiques del cicle cel·lular GC-1 es mostren a la figura 2Bb. Els resultats de la tinció de Ki-67 també van mostrar que el tractament amb Cis-A, Cis-B, Cis-C i Cis-H va millorar significativament la proporció de cèl·lules positives Ki{-67-de la GC induïda per la hipòxia{{54} } cèl·lules in vitro (figura 2C).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

El mecanisme de Cis protegeix les cèl·lules germinals de la hipòxia in vitro.

Per investigar si els efectes protectors de Cis a les cèl·lules GC-1 estaven relacionats amb l'eliminació d'excés de ROS, es va utilitzar el colorant fluorescent DCFH-DA per detectar els nivells de ROS a cada grup. Com es mostra a les figures 3A i 3B, el tractament amb DMSO no va canviar el contingut intracel·lular de ROS o el nivell de LPO en comparació amb el grup model. Tanmateix, els nivells de ROS a les cèl·lules GC-1 es van reduir notablement als grups tractats amb Cis (figura 3A). A més, també es va observar una disminució de LPO a les cèl·lules GC-1 sotmeses a Cis (figura 3B).

Per explorar encara més el mecanisme pel qual Cis protegeix les cèl·lules germinals de lesions hipòxiques, es van realitzar anàlisis de tinció de TUNEL i Western blot per avaluar l'apoptosi. La tinció de TUNEL (figura 3C) va mostrar una apoptosi significativa en els grups model i DMSO. Tanmateix, es van observar menys cèl·lules apoptòtiques amb el tractament Cis, la qual cosa va indicar que el tractament amb Cis va reduir l'apoptosi de les cèl·lules GC-1. A més, es va mesurar l'expressió de PARP, Caspase-3, Bax i Bcl-2 per corroborar el mecanisme molecular. Tal com es presenta a la figura 3D, la caspasa -3 i el PARP es van activar a les cèl·lules GC-1 sota hipòxia, i aquesta activació es va inhibir pel tractament Cis. A més, la proporció de Bax/Bcl-2 va ser més alta en el grup model que en el grup control, i el tractament amb Cis va reduir la proporció de Bax/Bcl-2 (figura 3D). Aquestes dades van indicar que Cis tenia una capacitat potencial per atenuar el dany oxidant induït per la hipòxia, i aquest efecte protector es podria aconseguir reduint l'acumulació de ROS i inhibint l'activació de la via d'apoptosi relacionada amb Caspasera.

El mecanisme enzimàtic que inhibeix el sistema operatiu implica eliminadors de radicals lliures com la glutatió reductasa (GR), la glutatió peroxidasa (GPx) i la superòxid dismutasa (SOD) [23]. El mecanisme enzimàtic que inhibeix el sistema operatiu té un paper essencial en la prevenció del dany oxidatiu a les cèl·lules i els teixits [23]. Per validar encara més el mecanisme potencial de la inhibició de Cis del sistema operatiu induït per la hipòxia a les cèl·lules GC-1, es van mesurar les activitats de GR, GPx i SOD. Els resultats van revelar que les activitats GR, GPx i SOD totes significativament (P <0.01, figura 3E) van disminuir sota hipòxia en comparació amb els grups control, i el tractament amb Cis va restaurar notablement les seves activitats en Cèl·lules GC-1 exposades a la hipòxia (P <0, 05, figura 3E), cosa que suggereix que aquests compostos podrien activar el poderós sistema antioxidant endogen.

CISTANCHE TUBULOSA PER ESTIMULAR LA PRODUCCIÓ D'Espermatozoides PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Efectes de Cis sobre la reproducció en rates induïdes per hipòxia hipobàrica.

Per determinar els efectes de la hipòxia hipobàrica en rates mascles, primer vam provar les alteracions morfològiques dels testicles en rates induïdes per la hipòxia hipobàrica. Els resultats de la tinció amb HE van mostrar que al grup control, les cèl·lules espermatogèniques normals en diverses etapes estaven disposades de manera ordenada des de la membrana basal fins al lumen, i els espermatozoides madurs eren visibles als llums dels túbuls (figura 4A). En comparació amb els controls, es van observar alteracions patològiques del teixit testicular al grup model, la membrana basal de les cèl·lules epitelials testiculars es va disposar de manera fluixa, l'epiteli espermatogènic era extremadament prim i el nivell i el nombre de cèl·lules germinals es van reduir notablement (Figura 4A) . Tanmateix, el tractament amb Cis va millorar notablement la histologia del dany testicular induït per la hipòxia hipobàrica in vivo (figura 4A). També vam mesurar el pes corporal, el pes dels testicles, el pes de l'epidídim i el pes de la glàndula vesícula seminal, cosa que va fer que es calculés l'índex d'òrgans reproductors (la relació òrgan reproductor/pes corporal). Tal com es mostra a la figura 4B-D, l'índex d'òrgans reproductors (testicles, epidídim i glàndula vesícula seminal) va ser notablement inferior al grup model (P <{7}}.01) que al grup control. Tanmateix, l'efecte de la hipòxia hipobàrica sobre l'índex d'òrgans reproductius de les rates es va revertir amb el tractament Cis (figura 4B-D).

A continuació, també es va mesurar l'activitat enzimàtica de l'acrosoma i la taxa d'esperma en viu de l'esperma de rata mascle per dilucidar el dany de la funció testicular. Tal com es mostra a la figura 4E, 4F, l'activitat enzimàtica de l'acrosoma i la motilitat dels espermatozoides eren més baixes a les rates del grup model que al grup control (P <0.01). Tanmateix, en comparació amb les rates del grup model, l'activitat de l'enzim acrosoma es va restaurar en rates tractades amb 8 mg/kg/d de Cis (P <0, 05) (figura 4D). A més, com es mostra a la figura 4F, el tractament amb Cis tambéaugmentar la taxa d'esperma en viu; totes les rates tractades amb 8 mg/kg/dia de Cis van mostrar un augment significatiu de la taxa d'esperma en viu (55,83 ± 6,03%, P <0.05; 69.{ {8}} ± 2,29%, P <0,01, 52,33 ± 3,40%, P <0,05 i 53,67 ± 2,25%, P <0,05 respectivament) en comparació amb les rates model (43,83 ± 4,01%); .

En conjunt, aquests resultats van suggerir que l'entorn hipòxic hipobàric va provocar alteracions morfològiques testiculars, pèrdua de pes dels òrgans reproductors i danys a la funció testicular en rates mascles, i Cis podria protegir eficaçment els òrgans reproductors dels danys induïts per la hipòxia.

Efectes de Cis sobre el sistema operatiu en els testicles de rates induïdes per hipòxia hipobàrica.

Es van mesurar els nivells de ROS i LPO als testicles de rates per analitzar els efectes de Cis sobre el sistema operatiu induït per la hipòxia hipobàrica. L'anàlisi de ROS va revelar que, en comparació amb el grup control, els nivells de ROS als testicles del grup model van augmentar significativament (P <0.01 Figura 5A). Per contra, la LPO es va elevar de manera espectacular als testicles (P <{7}}.01) sota hipòxia hipobàrica en comparació amb condicions normòxiques (figura 5B). Tanmateix, el tractament amb Cis va alterar els canvis anteriors (P <0, 05), en què Cis-B va exercir millors efectes que altres Cis (figura 5A, 5B). Cis semblava protegir els testicles reduint el sistema operatiu en condicions hipòxiques hipobàriques in vivo.

A més, es van realitzar anàlisis d'apoptosi per avaluar encara més el mecanisme pel qual Cis protegia contra la lesió de la funció testicular induïda per la hipòxia hipobàrica. Els resultats de la tinció de TUNEL (figura 5C) van mostrar que existia una apoptosi significativa al grup model en comparació amb el grup control. Tanmateix, després del tractament amb Cis (8 mg/kg/d), es van produir menys cèl·lules apoptòtiques (P <0.05) (figura 5C). Les dades de Western blot també van mostrar que la hipòxia i el tractament hipobàric van donar lloc a l'activació de la caspasa -3 i la PARP i un augment de la relació Bax/Bcl-2 al teixit testicular, cosa que indica un augment de l'apoptosi (figura 5D). A més, diferents tipus deTractament cisva reduir significativament l'apoptosi al teixit testicular (figura 5D). De la mateixa manera, l'anàlisi IHC del teixit testicular va mostrar resultats similars (figura suplementària 1).

Per verificar el mecanisme del sistema operatiu reduït amb Cis provocat per la hipòxia hipobàrica, vam provar encara més les activitats de GR, GPx i SOD al teixit testicular. Com es mostra a la figura 5E, en comparació amb el grup control, el tractament amb hipòxia hipobàrica va reduir significativament les activitats de GR, GPx i SOD (P <0.01). Tanmateix, el tractament amb Cis va restaurar les activitats enzimàtiques (GR, GPx i SOD) del teixit testicular en rates tractades amb hipòxia hipobàrica (P <0, 05). En conclusió, Cis semblava protegir els testicles activant un potent mecanisme de defensa enzimàtic antioxidant endògena en condicions d'hipòxia hipobàrica.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discussió

A les zones de gran altitud, se sap que la hipòxia hipobàrica afecta diversos sistemes humans, inclòs el sistema reproductor masculí [4, 20]. Les investigacions experimentals recents estan orientades a comprendre els mecanismes de com la hipòxia hipobàrica afecta el sistema reproductor masculí. En aquest estudi, es va investigar l'efecte terapèutic de l'extracte de Cis de Cistanches Herba sobre el dany reproductiu induït per la hipòxia. Els resultats van demostrar que Cis pot protegir el sistema reproductor masculí del dany hipòxic reduint l'acumulació de ROS induïda per la hipòxia i el sistema operatiu millorant l'activitat dels enzims antioxidants endògens.

Els ROS són radicals lliures derivats de l'oxigen que tenen un paper vital en la fisiologia i la patologia humana. Les dosis baixes de ROS són essencialscapacitació espermàtica, la reacció de l'acrosoma i la fusió espermatozoides-oòcits [24, 25]. Tanmateix, l'acumulació excessiva de ROS sovint provoca danys a les cèl·lules germinals i les cèl·lules estromals, donant lloc a infertilitat masculina [26]. Les ROS poden danyar fàcilment les membranes cel·lulars, els àcids nucleics, les proteïnes, els enzims i altres macromolècules biològiques mitjançant la peroxidació. A més, també provoquen danys cel·lulars i de l'ADN potencials quan superen la capacitat de transport d'antioxidants. L'evidència acumulada recolza el paper fonamental de les ROS en la patogènesi de la fertilitat masculina [27, 28]. La producció de ROS està regulada per la tensió d'oxigen. En condicions hipòxiques, l'oxigen disponible a l'entorn disminueix i la viscositat de la sang augmenta, afectant així molts processos metabòlics dependents de l'oxigen de l'organisme [29, 30]. Tanmateix, la pressió atmosfèrica més baixa a altituds elevades provoca un retorn venós pobre i una disminució de la quantitat d'oxigen transportada pel torrent sanguini a totes les cèl·lules de l'organisme, la qual cosa augmenta encara més la hipòxia d'òrgans i cèl·lules [29, 30]. Així, l'exposició a gran altitud dóna lloc a una sèrie de respostes fisiològiques hipòxiques, inclosa la producció i acumulació de ROS, quan la demanda d'oxigen supera l'oferta vascular. Com s'ha esmentat anteriorment, l'acumulació de ROS condueix a una varietat d'efectes intracel·lulars, el més crític dels quals és provocar OS a les cèl·lules.

OS es refereix a un desequilibri entre les reaccions d'oxidació i reducció, que condueix a la generació d'excés d'oxidants o molècules que accepten un electró d'un altre reactiu, que al seu torn produeix ROS [31, 32]. S'entén bé que el sistema operatiu pot ser provocat per una sèrie de factors endògens i exògens, inclosa l'exposició a gran altitud. Els espermatozoides són cèl·lules especialment susceptibles al sistema operatiu donat els seus sistemes de reparació cel·lulars inadequats i l'alt contingut d'àcids grassos poliinsaturats en la membrana plasmàtica [33]. Els teixits testiculars i epidídims no són una excepció, ja que s'ha observat la presència d'OS greus en espermàtides rodones de rates sotmeses a hipòxia [4]. El sistema operatiu afecta l'estabilitat de l'ADN, posant en perill la integritat del material genètic dels gàmetes [34-36]. No obstant això, s'ha confirmat que un alt nivell de dany a l'ADN en els gàmetes masculins condueix a l'activació de la senyalització d'apoptosi, que es tradueix en una reducció del recompte d'espermatozoides epidídims i un augment del percentatge de cèl·lules defectuoses [28, 37]. En el present estudi, la hipòxia va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules GC-1 mitjançant la inducció de l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular. Més important encara, l'anàlisi de FCM va mostrar un augment significatiu dels nivells de ROS després de l'estimulació de la hipòxia, amb una taxa d'apoptosi augmentada i una activació més alta de la proporció de caspasa-3, PARP i Bax/Bcl-2, cosa que indica que ROS podria activar-se. apoptosi mitjançant l'activació de la via de senyalització de la caspasa durant el dany a la fertilitat induït per la hipòxia. Les troballes actuals van demostrar que la hipòxia va provocar una acumulació excessiva de ROS, causant danys oxidatius a les cèl·lules reproductives. Per tant, és significatiu identificar nous antioxidants que puguin servir com a enfocament eficaç per alleujar la lesió de fertilitat induïda per la hipòxia.

Per protegir-se del sistema operatiu, existeix un complex sistema antioxidant al cos, format principalment per factors enzimàtics. En condicions fisiològiques, el contingut de ROS i el sistema antioxidant mantenen un cert equilibri. Tanmateix, la sobreproducció de ROS esgota el sistema antioxidant dels espermatozoides, donant lloc al sistema operatiu, que causa danys a l'ADN dels espermatozoides i provoca taxes de fertilitat i embaràs més baixes [23]. Així, per abordar la sobreproducció de ROS i els efectes nocius relacionats a nivell cel·lular en el sistema reproductor masculí, s'han provat diferents estratègies antioxidants [23]. Actualment, la literatura relativa a l'ús de compostos amb activitat antioxidant imillora de la funció dels espermatozoidesés extens. És important destacar que la majoria dels informes descriuen una millora en els paràmetres de l'esperma després de la ingesta oral d'antioxidants, inclòsmillores en la concentració d'espermatozoidesi la motilitat o una disminució del dany a l'ADN [38]. Així, un nombre creixent d'uròlegs prescriuen antioxidants orals per a la infertilitat a causa de problemes relacionats amb el sistema operatiu [39]. Aquests antioxidants inclouen principalment carnitines, vitamines, zinc, melatonina i compostos naturals [23, 40]. Actualment, amb el desenvolupament de la tecnologia d'extracció de fàrmacs, també s'està considerant un nombre creixent d'extractes de TCM per mitigar la infertilitat masculina perquè aquests antioxidants poden reduir els efectes destructius del sistema operatiu [41]. Yüce A. et al. va informar el 2013 que la canyella té efectes beneficiosos sobre l'equilibri oxidatiu i antioxidant en els testicles i la qualitat de l'esperma [42]. Zhang L et al. va demostrar que la curcumina millora significativament la motilitat dels espermatozoides en pacients i disminueix l'H2O2 [43]. A més, també s'ha demostrat que una varietat d'altres extractes de plantes com ara nabius, crocus sativus, llavors de magrana i te verd protegeixen el sistema reproductor mitjançant mecanismes antioxidants [27, 44-47). Cistanches Herba és un TCM important que posseeix un perfil de seguretat favorable i àmplies funcions medicinals per al tractament de la infertilitat, entre altres condicions [13]. Els estudis farmacològics moderns han demostrat que Cistanches Herba posseeix diverses activitats, com ara activitats antioxidants, antiinflamatòries, hepatoprotectores i anti-neurodegeneratives [13, 48]. Per tant, els extractes, les fraccions o els compostos de Cistanches Herba poden tenir característiques antioxidants potencials per al tractament de la infertilitat.

Les substàncies actives de les plantes que milloren la fertilitat inclouen diversos grups químics com ara PhG, saponines, compostos volàtils oxigenats i alcaloides [41]. Els estudis d'activitat farmacològica dels PhG han demostrat que els PhG presenten una àmplia gamma de bioactivitats, com ara l'antioxidació, la neuroprotecció antiradiació i la millora de la funció sexual [49, 50]. Entre aquestes activitats, l'antioxidació està cridant l'atenció gradualment. S'ha informat que alguns components únics o fraccions de PhGs inhibeixen l'apoptosi de cèl·lules germinals induïda per diversos productes químics, i les seves capacitats d'antioxidació in vitro també s'han demostrat in vivo en diversos models animals [51, 52]. Aquests resultats indiquen que els PhG podrien ser un candidat atractiu per atractament de la infertilitat masculina. Cis és un PhG actiu que es pot aïllar de Cistanches Herba. En el present estudi, vam explorar els efectes de Cis sobre cèl·lules tractades amb hipòxia o un model de rata i vam investigar els mecanismes moleculars subjacents. Cis va mostrar activitats protectores sobre la disminució de la viabilitat induïda per la hipòxia i l'augment de l'apoptosi a les cèl·lules GC-1, i també va mostrar un efecte protector sobre el dany induït per la hipòxia en el sistema reproductor de rates in vivo. Es va observar una disminució significativa de les activitats GR, GPx i SOD sota hipòxia en comparació amb els grups normoxics, mentre que les activitats específiques de GR, GPx i SOD van augmentar significativament en testicles o cèl·lules GC-1 tractades amb Cis. Cis semblava protegir els testicles i les cèl·lules GC-1 en condicions hipòxiques millorant les activitats dels enzims antioxidants.

Els antioxidants enzimàtics funcionen principalment eliminant anions superòxid, evitant així la peroxidació lipídica i el dany de l'ADN per prevenir la infertilitat. Els mecanismes antioxidants enzimàtics tenen un paper crucial en la prevenció del dany oxidatiu [23]. El mecanisme enzimàtic contra el sistema operatiu inclou eliminadors de radicals lliures i enzims dependents del glutatió, inclosos GR, GPx i SOD [12]. S'entén que els enzims antioxidants són essencials per al sistema reproductor masculí. En l'estudi actual, l'efecte de les activitats enzimàtiques antioxidants reduïdes sota hipòxia hipobàrica va anar acompanyat d'un augment de ROS i LPO al grup model, que és coherent amb els informes anteriors [12]. No obstant això, l'administració de Cis va provocar una recuperació de les activitats enzimàtiques antioxidants a les cèl·lules GC-1 i als testicles de rates, cosa que va permetre generar estratègies per administrar Cistanches Herba per prevenir els danys induïts per la hipòxia hipobàrica, com es va suggerir anteriorment. Tot i que els resultats actuals van mostrar que el tractament amb Cis va disminuir parcialment el dany de les cèl·lules germinals induïts per la hipòxia a les rates, es necessiten més investigacions per desvelar la imatge completa dels seus efectes protectors reproductius. Per exemple, el mecanisme específic de Cis afecta l'activitat dels enzims antioxidants. A més, hi ha la qüestió de si algun altre mecanisme també podria ser pertinent, ja que Cis només es va recuperar parcialment del dany reproductiu causat per la hipòxia. Finalment, també s'ha de considerar si Cis té un efecte directe de promoció del creixement sobre les cèl·lules germinals.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER AL MANTENIMENT DE L'ACTIVITAT Espermatozoide PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Conclusions

En general, els resultats d'aquest estudi emfatitzen el potencial de Cis com a antioxidant per al tractament del dany reproductiu masculí induït per la hipòxia. Cis pot protegir contra el dany reproductiu masculí induït per la hipòxia restaurant l'activitat enzimàtica antioxidant, reduint el sistema operatiu induït per ROS, augmentant simultàniament la viabilitat cel·lular i disminuint l'apoptosi. És important destacar que els subtipus Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C i Cis-H) estudiats en aquest estudi van mostrar un cert efecte protector sobre el sistema reproductor, i Cis-B va mostrar l'efecte més significatiu. Per tant, especulem que Cis podria ser un bon candidat antioxidant per atractament del dany reproductiu masculí induït per la hipòxia, tot i que el mecanisme subjacent precís requereix més investigació.