Cistanòsid de Cistanche Herba millora el dany reproductiu masculí induït per la hipòxia mitjançant la supressió de l'estrès oxidatiu-Ⅰ

Introducció

Actualment, aproximadament 48,5 milions (15%) de parelles en edat reproductiva a tot el món es veuen afectades per la infertilitat, entre les quals el 40-50% dels casos s'atribueixen a la infertilitat masculina, una condició que està fortament associada amb factors ambientals i d'estil de vida. L'evidència suggereix que la susceptibilitat dels testicles dels mamífers a la baixa pressió d'oxigen és un factor causant d'algunes formes d'infertilitat masculina. Com s'ha demostrat en estudis anteriors, l'espermatogènesi es veu afectada i es redueix amb l'exposició a la hipòxia hipobàrica.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Per explorar el mecanisme subjacent, els estudis han demostrat que l'exposició a la hipòxia hipobàrica augmenta la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS). ROS té un paper important en el sistema reproductor masculí. A nivells baixos, són necessaris per a la capacitació dels espermatozoides, la reacció acrosoma i la fusió espermatozoides-oòcits [10]. Tanmateix, l'excés de ROS pot induir danys a l'ADN nuclear/mitocondrial dels espermatozoides i danys peroxidatius de la membrana plasmàtica, que al seu torn són factors etiològics importants per a laaugment del risc d'infertilitat masculina. Així, l'acumulació de ROS induïda per la hipòxia podria ser una de les causes d'infertilitat masculina.

Cistanches Herba, una planta medicinal parasitària perenne, està àmpliament distribuïda en zones àrides i utilitzada àmpliament per les seves activitats farmacològiques. Entre tots els continguts efectius deCistanches Herba, els PhG s'han considerat com el principal component actiu. Fins ara, s'han aïllat 34 PhGPlantes de cistanches. Cistanòsid(Cis), un PhG actiu aïllat deCistanches Herba, ha rebut atenció pels seus efectes antioxidants.

Tenint en compte els efectes antioxidants de Cis i el paper de les ROS en la infertilitat masculina induïda per la hipòxia, Cis es considera un potencial candidat a fàrmac per al tractament deinfertilitat masculina induïda per hipòxia. Tanmateix, pocs informes han abordat els efectes antioxidants de Cis extret de Cistanches Herba en el tractament de la infertilitat masculina induïda per la hipòxia o les vies de senyalització implicades. En aquest estudi, es van construir models experimentals d'hipòxia in vitro i in vivo i es van avaluar els components dels efectes de diferents Cis.

Materials i mètodes

Cultiu cel·lular i reactiu

La línia cel·lular d'espermatogònies de ratolí GC-1spg (GC-1) es va comprar a la American Type Culture Collection (ATCC) i es va cultivar en DMEM (Invitrogen, EUA) complementada amb un 10% de sèrum fetal boví, 1% L-glutamina (100 mM), penicil·lina (100 U/mL) i estreptomicina (100 ug/mL) a 37 graus en una incubadora humidificada amb un 5% de CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) es va comprar a Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Xina).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Assaig de viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va provar mitjançant l'assaig del kit de recompte de cèl·lules {{0}} (CCK-8). En resum, les cèl·lules GC-1 es van sembrar en plaques de 96-pous a 1,5 × 103 per pou i es van cultivar a 37 graus durant 24 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb diferents concentracions (20%, 15%, 10%, 5%) d'oxigen o diferents concentracions (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-). C, Cis-H) durant el temps requerit. Aleshores, es va descartar el sobrenedant i es van detectar la viabilitat cel·lular mitjançant un kit CCK-8 (Dojindo Japó). L'absorbància de cada pou es va mesurar a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (BioRad USA). Finalment, les viabilitats cel·lulars es van calcular segons la fórmula següent: Viabilitat cel·lular=(grup ODexperimental - grup ODblank)/ (ODcontrol grup - ODblank grup) × 100%.

Anàlisi Western blot

Les cèl·lules o teixits recollits es van homogeneïtzar al tampó RIPA per extreure proteïnes (RIPA Beyotime Xina; Cocktail Roche Switzerland). Es van recollir sobrenedants i es va provar la concentració de proteïnes pel mètode BCA (Beyotime). Aproximadament 40 ug de les proteïnes extretes de cada mostra es van separar mitjançant SDS-PAGE i es van electrotransferir a una membrana de filtre de nitrocel·lulosa (NC) (Beyotime Xina). Les membranes del filtre NC es van bloquejar amb llet sense greix al 5% durant 1,5 h i es van incubar amb anticossos específics (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl{-2 1:1000, anti-Bax 1). :1000, anti-GAPDH 1:1000 tots els anticossos es van comprar a Cell Signaling Technology, EUA) durant la nit a 4 graus. A continuació, es van incubar totes les membranes NC amb l'anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de rave picant durant 1, 5 h a temperatura ambient i es van fer imatges amb un sistema d'imatge (Tannon, Xina).

Detecció del cicle cel·lular

Es va realitzar un assaig citomètric de flux (FCM) per analitzar el cicle cel·lular. Les cèl·lules es van tractar en diferents condicions durant 72 h i es van collir. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS, es van fixar en etanol al 75% i es van tacar amb iodur de propidi (PI). Per a cada mostra, es van recollir i analitzar 1 × 104 cèl·lules mitjançant citometria de flux (FACS Calibur, BD Biosciences). A continuació, es va calcular la proporció de cèl·lules de fase G1/S/G2 i l'índex de proliferació [Fase (S+G2)/Fase (G1+S+G2) × 100%].

Tinció de Ki-67

Les cèl·lules es van cultivar en un plat confocal i es van tractar amb hipòxia o diferents subtipus de Cis durant 72 h. Després de fixar totes les cèl·lules amb un 4% de paraformaldehid, es van incubar amb un anticòs anti-Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). A continuació, es van incubar totes les cèl·lules amb un anticòs IgG anti-conill conjugat CY-3-(1:200, Boster, Xina) i una solució DAPI (1, 0 ug/mL, Beyotime). La fluorescència es va observar amb un microscopi confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japó).

EXTRACTE DE TUBULOSA DE CISTANCHE DE NIVEL SUPERIOR PER A AMPLIAR EL PHGS DE LA TESTOSTERONA 75% ECH 30% ACT 12%

Detecció de ROS

La FCM es va introduir per mesurar els nivells de ROS intracel·lulars mitjançant DCFH-DA. Les cèl·lules en suspensió es van sembrar en 6-plaques de pous i es van sotmetre a diferents tractaments. Després de 72 h de tractament, les cèl·lules es van suspendre en DMEM sense sèrum amb 10 μM de DCFH-DA (Beyotime). A continuació, es va determinar el contingut de ROS mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència en un sistema de citometria de flux Beckman Coulter amb una longitud d'ona d'excitació de 488 nm i una longitud d'ona d'emissió de 525 nm [18].

Determinació de la peroxidació lipídica (LPO)

Es va realitzar l'assaig de substàncies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBARS) per detectar LPO. Tots els passos operatius es van realitzar segons les instruccions (Sigma USA). Les concentracions es van calcular mitjançant un coeficient d'extinció molar d'1,56×105/(M·cm), que es va obtenir utilitzant malondialdehid com a estàndard. Els resultats s'expressen en nmol d'equivalents de MDA/mg de proteïna.

Determinació de l'activitat enzimàtica

Les activitats enzimàtiques es van provar mitjançant kits d'assaig que inclouen glutatió reductasa (GR), glutatió peroxidasa (GPx) i superòxid dismutasa (SOD). Tots els passos operatius es van realitzar segons les instruccions subministrades (Institut de Bioenginyeria Nan Jing Jian Cheng Xina).

Animals i Protocol Experimental

Es van obtenir rates Wistar mascles madures (180-220 g, 8 w d'edat) del centre d'animals de la Quarta Universitat de Medicina Militar, Xi'an, Xina. El permís d'ús dels animals es va obtenir del Comitè d'Ètica de la Universitat (número de referència: 20190506). L'experiment amb animals es va dur a terme d'acord amb les directrius universitàries per a la cura i l'ús d'animals de laboratori.

Es va permetre a totes les rates adaptar-se durant aproximadament 1 setmana abans de l'inici de l'experiment. Després de l'aclimatació, les rates es van distribuir aleatòriament en 6 grups amb 5 animals a cada grup. Les rates del grup control es van criar a pressió normal (PO2: 20%; pressió de l'aire: 101,3 kPa), mentre que les rates del model i els grups tractats amb Cis es van criar en una cambra d'oxigen a baixa pressió (pressió interna de 61,6 kPa). , equivalent a una alçada de 4000 metres sobre el nivell del mar: 14,55%) per simular un entorn hipòxic d'altitud. Totes les rates tenien accés lliure al menjar i l'aigua en gàbies de plàstic a 22 ± 2 graus i condicions d'humitat amb un cicle de llum/foscor automàtic de 12-h. Les rates del model i dels grups tractats amb Cis van romandre en condicions hipobàriques, però es van transferir a condicions normobàriques cada 96 h, moment en què se'ls va proporcionar menjar i aigua i es van netejar les gàbies. La durada de la transició d'hipobàric a hipobàric va ser d'aproximadament 2 h. Tots els grups de tractament es van tractar amb el Cis corresponent (8 mg/kg/d) mitjançant sonda oral durant 8 setmanes, mentre que les rates control i model es van tractar amb un volum igual d'aigua.

Després de 8 setmanes, les rates es van sacrificar sota anestèsia. Es van separar i pesar testicles, epidídim i vesícules seminals i es va calcular l'índex d'òrgans d'acord amb la fórmula següent: (pes de l'òrgan/pes de l'animal) × 100%. Posteriorment, es van recollir espermatozoides a l'epidídim i es va provar la seva motilitat i l'activitat enzimàtica de l'acrosoma. De la mateixa manera, es van recollir teixits testiculars per a estudis histopatològics i detecció de ROS, LPO i activitat enzimàtica antioxidant.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT CISTANCHE HERB AUMENTA LA PODER SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Avaluació de la taxa d'espermatozoides vius

L'epidídim es va incisar amb unes tisores quirúrgiques i la suspensió d'esperma es va preparar en solució salina normal. Per avaluar la taxa d'esperma en viu, es van barrejar acuradament 5 μL de la suspensió d'esperma amb un volum igual de taca d'eosina-Y. Després es van comptar els espermatozoides amb un microscopi de llum. Les taxes d'espermatozoides vius es van avaluar calculant tant els espermatozoides tacats (espermatozoides morts) com els espermatozoides no tacats (espermatozoides vius).

Determinació de l'activitat enzimàtica de l'acrosoma espermàtic

El test d'activitat enzimàtica de l'acrosoma espermàtic es va utilitzar per avaluar els enzims de l'acrosoma espermàtic [19]. Els resultats de cada grup es van calcular mitjançant la fórmula següent: Activitat enzimàtica de l'acrosoma (μIU)=(grup ODExperiment - grup ODBlank)/(247,5 × 10) × 106.

Resultats

Efectes de la hipòxia a les cèl·lules GC-1

Per determinar els efectes de la hipòxia sobre les cèl·lules germinals, primer vam examinar els canvis en la viabilitat cel·lular després del tractament amb hipòxia amb diferents concentracions d'oxigen (20%, 15%, 10% i 5%) per a 1, 3, 5. , i 7 dies, respectivament. Els resultats de l'assaig CCK-8 van mostrar que, en comparació amb el grup control (concentració d'oxigen del 20%), les cèl·lules exposades a la hipòxia presentaven una disminució significativa de la viabilitat (P <0, 01; Figura 1A). A més, la seva taxa de supervivència era inversament proporcional a la concentració d'oxigen i va disminuir encara més amb el temps d'inducció. Per evitar un efecte citotòxic excessiu, es van seleccionar una concentració d'oxigen del 10% i un temps d'inducció de 3-dia com a criteris del model hipòxic per als experiments in vitro posteriors.

Posteriorment, es va realitzar una tinció de FCM i immunofluorescència per avaluar encara més l'alteració de la proliferació de cèl·lules GC{{0}} sota tractament amb hipòxia. Els resultats van mostrar que la hipòxia podria induir l'aturada de cèl·lules GC-1 a la fase G1, reduint així l'entrada cel·lular a la fase S i inhibint la replicació de l'ADN. Així, la hipòxia va reduir significativament l'índex de proliferació de les cèl·lules GC-1 (P <0, 01; Figura 1B). La tinció positiva de Ki-67 és un altre biomarcador específic de les cèl·lules en proliferació. Per tant, també vam examinar la proporció de cèl·lules Ki-67-positives amb o sense tractament amb hipòxia. En comparació amb el grup control, el tractament amb hipòxia va reduir notablement les cèl·lules Ki-67-positives, tal com es mostra a la figura 1C.

A continuació, vam tenir com a objectiu investigar el mode d'inhibició de la viabilitat cel·lular GC{{0}} induïda per la hipòxia. Tal com s'informa a la literatura, el nivell de ROS va augmentar a mesura que les rates estaven exposades a un entorn hipòxic hipobàric [8, 20]. Per tant, es van mesurar els nivells de ROS endògens a les cèl·lules GC-1 mitjançant l'assaig FCM. Els resultats van mostrar nivells més alts de ROS sota hipòxia en comparació amb el grup d'oxigen normal (P <0, 01; Figura 1D). La ROS acumulada causa un deteriorament marcat de l'ADN, que al seu torn provoca l'activació de la via de l'apoptosi cel·lular i podria ser el principal factor etiològic per a l'augment del risc d'infertilitat masculina [21, 22]. A continuació, vam detectar l'efecte d'activació apoptòtica de la hipòxia a les cèl·lules GC-1 mitjançant la tinció de TUNEL. Tal com es mostra a la figura 1E, el tractament amb hipòxia va provocar un augment de la fluorescència de TUNEL en comparació amb el grup control, cosa que indica un augment de l'apoptosi al grup model.

Com que el dany cel·lular induït per ROS sol ser causat pel sistema operatiu, vam provar encara més el sistema operatiu de les cèl·lules GC-1. Tal com es presenta a la figura 1F, els nivells de LPO de cèl·lules GC-1 del grup model van augmentar notablement en comparació amb els nivells de LPO de cèl·lules GC-1 del grup control. Aquestes troballes van suggerir que la lesió de cèl·lules GC-1 induïda per la hipòxia podria estar relacionada amb el sistema operatiu, que és induït per l'acumulació de ROS.