Mètodes de genètica combinatòria per descobrir combinacions reguladores d'alt ordre i enginyeria de motors genètics per a la diferenciació neuronal

Submergir-se en la recerca de factors de diferenciació cel·lular efectius

Els investigadors encara s'esforcen per trobar millors terapèutiques per revertir o frenar la progressió de trastorns neurològics com la malaltia de Parkinson, la malaltia d'Alzheimer i la malaltia de Huntington. Aquests trastorns són el resultat de la mort de cèl·lules neuronals en diferents parts del cervell. Els medicaments o tractaments utilitzats per alleujar els símptomes dels pacients no estan ben establerts.

Feu clic a cistanche tubulosa en pols per a la neuroprotecció

No recuperen els teixits neuronals danyats i poden provocar efectes secundaris no desitjats. Per tant, un nombre creixent d'estudis consideren les cèl·lules mare com a terapèutica prometedora, a causa de les seves capacitats d'autorenovació i flexibilitat de diferenciació en llinatges cel·lulars desitjats per a l'empelt al pacient per recuperar els teixits neuronals perduts.

Tanmateix, abans que les cèl·lules mare es puguin utilitzar clínicament per tractar trastorns neurològics, encara hi ha àrees que requereixen una millor comprensió per desbloquejar tot el seu potencial. Les cèl·lules mare són regeneratives i mal·leables, amb la propensió a convertir-se en qualsevol tipus de cèl·lula donada la combinació adequada de factors per impulsar la diferenciació. Tanmateix, hi ha una gran complexitat en la gran xarxa de factors.

És important determinar les combinacions de factors de transcripció (TF), molècules petites i/o factors de creixement per aconseguir la sinergia òptima per diferenciar les cèl·lules mare incloses les cèl·lules mare embrionàries (ESC) i les cèl·lules mare pluripotents induïdes a la velocitat més ràpida, donant lloc a en la població més pura d'un llinatge neuronal. Tanmateix, hi podria haver una manera estratègica de detectar aquests factors d'una manera més rendible i eficient en el temps.

Això ajudaria a optimitzar els protocols ja establerts que encara són laboriosos o per a una més caracterització de subtipus neuronals com les neurones espinoses mitjanes, les neurones sensorials i les neurones serotoninèrgiques. Continua sent un repte perfilar de manera integral els impulsors del destí neuronal i definir com aquests elements interactuen entre ells a la xarxa reguladora.

Alguns grups han utilitzat nous enfocaments de cribratge d'alt rendiment per dilucidar la xarxa reguladora del destí cel·lular i han proporcionat informació informativa sobre els factors que impulsen la conversió i la supervivència neuronal. Liu et al. (2018) van utilitzar l'activació CRISPR (CRISPRa) per buscar TF o factors d'unió a l'ADN que promouen el destí neuronal dels ESC. Tanmateix, el treball es va limitar a estudiar factors individuals o combinacions per parelles.

Un altre cribratge sistemàtic va ser realitzat per Tsunemoto et al. (2018), que va investigar la relació entre els TF. La majoria dels seus TF únics seleccionats no van mostrar cap efecte a l'estudi, però, van identificar 76 combinacions de TF per parelles per promoure la diferenciació de fibroblasts de ratolí a neurones induïdes.

En particular, els seus resultats no tenien certa coherència amb estudis anteriors, com ara no detectar el transportador actiu de dopamina Slc6a3 en neurones induïdes, possiblement a causa de la pèrdua de factors addicionals. Un altre estudi va determinar els gens essencials per mantenir o millorar la supervivència de les neurones mitjançant la realització d'un cribratge basat en la interferència CRISPR (CRISPRi) (Tian et al., 2019). I de nou, es van limitar a la detecció d'ARNs únics.

Es requereixen estudis addicionals per a un cribratge imparcial d'altres factors genètics i per augmentar el nombre de combinacions de factors, ja que s'ha demostrat que es pot requerir un còctel de més de dos factors en diferents contextos per impulsar de manera eficient la diferenciació i la reprogramació.

Un bon exemple és la combinació d'Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc que és necessària per regular la xarxa de senyalització del desenvolupament per a la pluripotència dels ESC (Takahashi i Yamanaka, 2006). En sistemes tan complexos, hi ha una necessitat de caracteritzar de manera exhaustiva les funcions de les combinacions genètiques d'ordre alt d'una manera de gran rendiment, i el mètode Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) pot ser capaç de fer-ho.

Mètode CombiGEM per a una pantalla d'alt rendiment, d'ordre elevat i sistemàtica de combinacions de factors

CombiGEM no només ofereix una manera sistemàtica de realitzar pantalles agrupades a gran escala, sinó que també té la capacitat d'acoblar les biblioteques genètiques combinatòries d'alt ordre (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). El procés d'un pot permet a l'usuari examinar multitud de combinacions genètiques; 1-manera, 2-manera, 3-manera i, en teoria, biblioteques de n vies.

Això proporciona una alternativa ràpida al procés convencional de creació i prova de combinacions d'interès de candidats individuals. Tot i que també es van desenvolupar diverses altres estratègies combinatòries de cribratge CRISPR per estudiar combinacions genètiques per parelles (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020; ), CombiGEM ofereix una oportunitat única per avaluar les interaccions entre tres o més combinacions genètiques.

Per exemple, si l'usuari vol utilitzar CRISPRa o CRISPRi per sobreexpressar o reprimir, respectivament, una llista de combinacions de TF candidates, es podria filtrar una biblioteca de codis de barres de combinacions d'sgRNA orientades a TF mitjançant CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) tal com es mostra a la figura 1.

Mitjançant l'ús de passos de lligadura d'un sol pot, la biblioteca d'ARNsg i els seus respectius codis de barres s'incorporen a un vector de destinació lentiviral que informa de l'expressió d'una proteïna fluorescent després de l'activació d'un promotor específic del tipus de cèl·lula neuronal, com ara la tubulina 1. La biblioteca de sgRNAs i un vector lentiviral separat que alberga el Cas9 enzimàticament deficient, ja sigui fusionat amb un activador transcripcional o un repressor es pot lliurar a les cèl·lules inicials desitjades.

Amb el temps, a mesura que les cèl·lules comencen a diferenciar-se, només les cèl·lules semblants a neurones induïdes expressaran fluorescència, i aquestes cèl·lules es poden aïllar mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència per recuperar les seves combinacions de TF que alberguen mitjançant la seqüenciació de codis de barres.

Per obtenir una millor comprensió de les combinacions que impulsen llinatges cel·lulars específics, aquestes cèl·lules també es poden sondar per a reporters o marcadors de llinatge cel·lular coneguts en funció de la preferència de les etapes de diferenciació que l'usuari decideixi estudiar. La classificació cel·lular activada magnèticament es podria utilitzar per separar les cèl·lules d'interès en funció de les expressions dels marcadors de la superfície cel·lular.

La seqüenciació d'ARN d'una sola cèl·lula es podria acoblar al cribratge combinatori CRISPR com a lectura per perfilar el tipus i els nivells de regulació a l'alça o a la baixa del gen i la combinació de TF dirigits es pot determinar mitjançant les lectures de codi de barres (Replogle et al., 2020). Es podrien utilitzar imatges d'alt contingut per controlar els canvis de morfologia cel·lular des de les etapes primerenques fins a les posteriors del desenvolupament de les neurones.

La rellevància fisiològica o la funcionalitat de les cèl·lules similars a les neurones induïdes es pot determinar mitjançant l'etiquetatge immunocitoquímic específic per a la maduració de les neurones, com NeuN, TUJ1 i MAP2, i mesures electrofisiològiques. Com s'ha esmentat anteriorment, els estudis han combinat TF i molècules petites per manipular el destí cel·lular.

CombiGEM també es pot utilitzar per identificar combinacions de molècules petites que poden mantenir l'autorenovació de les cèl·lules mare, induir la diferenciació del llinatge cel·lular o facilitar la reprogramació augmentant l'eficiència i substituint potencialment factors genètics. CombiGEM també es pot aplicar determinant primer els objectius de molècules petites de les vies de senyalització, els factors epigenètics o del procés cel·lular.

Aleshores, mitjançant el disseny d'una biblioteca de sgRNA per activar o inactivar els objectius farmacològics, es poden identificar les combinacions efectives de petites molècules per millorar la diferenciació o la reprogramació. Aquest concepte queda ben reflectit en els estudis que hem realitzat anteriorment per descobrir combinacions diana de fàrmacs contra el càncer i la malaltia de Parkinson (Zhou et al., 2020).

L'ús de CombiGEM no només es limita a les pertorbacions basades en CRISPR, sinó que també es podria aplicar a altres factors reguladors d'ADN o ARN per estudiar les pantalles de pèrdua de funció amb interferència d'ARN, així com les de guany de funció amb l'expressió. de microRNAs (Wong et al., 2015) i marcs de lectura oberts humans verificats per seqüència, com els reportats a la biblioteca humana TFome (Ng et al., 2020).

Mètode CombiSEAL per a l'enginyeria d'alt rendiment de factors de transcripció

Trobar la combinació ideal de factors genètics naturals encara pot suposar reptes, com ara limitar-se a TF caracteritzats del genoma amb coneixements previs sobre la seva expressió i papers en la diferenciació. Els estudis han demostrat que l'enginyeria de TF o la generació de factors de transcripció artificials obre una nova via d'opcions per accelerar la taxa de diferenciació a través de vies alternatives, superant la dependència de l'expressió de prerequisits d'altres cofactors endògens dins de la xarxa reguladora del gen, o substituint del tot. TF naturals amb altres més eficients (Jauch, 2018).

Això permet als investigadors adaptar els factors necessaris segons les seves necessitats experimentals. Proposem que si es pretén dur a terme una mutagènesi d'alt rendiment en múltiples llocs a un TF que comprèn diferents dominis, CombiSEAL podria resultar ser una plataforma útil (Choi et al., 2019). El mètode CombiSEAL reuneix fragments d'ADN que codifiquen aminoàcids que s'etiqueten combinatòriament amb codis de barres (figura 1).

Figura 1 ｜ Mètodes CombiGEM i CombiSEAL per detectar factors genètics efectius de diferenciació. Un exemple del mètode CombiGEM és l'acoblament de múltiples ARNs expressats a partir de la mateixa construcció, i les combinacions d'ARNsg es representen pels seus codis de barres concatenats. El mètode CombiSEAL inclou mutacions introduïdes en diverses parts d'una proteïna, com ara factors de transcripció, indicats com P1, P2, P(n) i P(n més 1). I les combinacions de mutacions es reflecteixen pels seus corresponents codis de barres concatenats. L'usuari pot aplicar les configuracions a altres sistemes de lliurament d'ADN i, en aquesta representació, s'utilitzen vectors lentivirals. Les estratègies de cribratge es poden dur a terme mitjançant un format agrupat i, en aquest exemple, la identificació de poblacions cel·lulars que es diferencien a un llinatge de neurones específic es detecta mitjançant l'activació del promotor per a l'expressió de proteïnes fluorescents, etiquetat com a fluorescència X al diagrama. La seqüenciació de nova generació (NGS) dels codis de barres del conjunt de cèl·lules desxifrarà les dianes d'ADN o les variants transcripcionals. Una anàlisi rigorosa dels factors que impulsen la diferenciació de diferents tipus de neurones podria utilitzar mètodes basats en matrius, com ara el sondeig de cèl·lules amb marcadors de llinatge cel·lular seguit d'una classificació cel·lular activada per magnètica (MACS) en plaques de diversos pous, que es poden seguir amb imatges d'alt contingut. Alternativament, la seqüenciació d'ARN unicel·lular (RNA-Seq) permet a l'usuari perfilar les expressions gèniques de les cèl·lules amb els fenotips desitjats i podria recuperar els codis de barres per identificar combinacions d'ARNsg o combinacions de mutació de les variants clau. FACS: classificació cel·lular activada per fluorescència.

CombiSEAL comença amb les primeres parts de secció de la proteïna on es desitja la mutagènesi. L'usuari pot generar qualsevol nombre de variants per a cada secció, després etiquetar-les amb codis de barres per identificar la posició i la combinació de mutacions. A continuació, cada grup de seccions s'assembla seqüencialment inserint-les en un vector de destinació que alberga la seqüència de proteïnes de tipus salvatge modificada amb enzims IIS de tipus flanquejant a la regió de la mutagènesi prevista.

Aquest esquema de fusió sense cicatrius d'enllaçar múltiples parts d'una proteïna és important per evitar afegir aminoàcids no desitjats a la proteïna. El mètode CombiSEAL permet determinar les seqüències d'aminoàcids del grup seleccionat de variants d'interès d'una manera més eficient i rendible, evitant la necessitat de seqüenciacions de lectura llarga sobre tota la proteïna per identificar els tipus de mutacions i on es troben a través de la proteïna. proteïna.

Aquesta configuració metòdica permet una anàlisi més fàcil realitzant una seqüenciació d'alt rendiment del conjunt de codis de barres concatenats curts que dedueix la combinació de tipus i posicions de mutacions d'aminoàcids, o altres modificacions desitjades, com ara l'intercanvi, la inserció i la supressió de dominis, que s'havien fet. dissenyat i instal·lat inicialment al TF

Conclusió

En comparació amb els mètodes d'assaig i error, s'han fet avenços en l'ús d'enfocaments més sistemàtics per determinar els factors o combinacions essencials necessaris per impulsar la conversió d'un tipus de cèl·lula en un llinatge neuronal. No obstant això, ha mancat la capacitat d'identificar combinacions d'ordre superior i aquí proposem que el mètode CombiGEM pugui abordar aquestes limitacions.

CombiGEM utilitza un sistema de lligadura d'un pot amb codi de barres per reunir combinacions d'ordre superior de factors d'unió a l'ADN per orientar l'ADN d'una sola vegada, eludint el procés de múltiples rondes de cribratge per reduir el nombre de visites a una mida manejable per a validacions posteriors. . A més, els TF naturals menys eficients es poden substituir per TF artificials o dissenyats per regular millor l'expressió gènica. Descrivim un mètode de mutagènesi de proteïnes, CombiSEAL, que permetrà als usuaris crear grans grups de variants del factor de transcripció mitjançant l'assemblatge senzill de múltiples mutacions de llocs etiquetades amb codis de barres dins de la proteïna i els seus diferents dominis.

Això accelerarà i reduirà el cost dels procediments de cribratge per recuperar la informació sobre els tipus de mutacions de les variants d'interès. Esperem que els mètodes proposats puguin ajudar a comprendre i ampliar les possibilitats de promoure la regeneració neuronal i que puguin ser àmpliament aplicables a altres àrees de recerca.

El mecanisme de l'efecte neuroprotector de Cistanche

S'ha demostrat que el cistanche té efectes neuroprotectors mitjançant diversos mecanismes:

1. Efectes antiinflamatoris: Cistanche conté compostos que s'ha demostrat que inhibeixen la inflamació en diverses parts del cervell, que poden ajudar a protegir les neurones dels danys.

2. Efectes antioxidants: Cistanche conté compostos que tenen fortes propietats antioxidants. Els antioxidants ajuden a protegir les neurones dels danys causats pels radicals lliures i l'estrès oxidatiu.

3. Regulació dels neurotransmissors: S'ha demostrat que Cistanche regula certs neurotransmissors, com la serotonina i la dopamina, que poden ajudar a protegir les neurones i millorar la funció cognitiva.

4. Estimulació del factor neurotròfic: S'ha demostrat que Cistanche estimula la producció de factors neurotròfics, com el factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF), que pot afavorir el creixement i la supervivència de les neurones.

En general, aquests mecanismes treballen conjuntament per protegir les neurones dels danys, promoure el seu creixement i supervivència i millorar la funció cognitiva.

Referències

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) La mutagènesi combinatòria optimitza en massa les activitats d'edició del genoma de SpCas9. Mètodes Nat 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimització d'AsCas12a per a pantalles genètiques combinatòries en cèl·lules humanes. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Combinacions de fàrmacs sinèrgics per al càncer identificades en una pantalla CRISPR per a interaccions genètiques per parelles. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Reprogramació del destí cel·lular mitjançant l'enginyeria de factors de transcripció natius. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Enzims Cas9 per a pantalles genètiques combinatòries. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) Una biblioteca completa de factors de transcripció humans per a l'enginyeria del destí cel·lular. Nat Biotechnol doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Pantalles CRISPR unicel·lulars combinatòries mitjançant captura directa d'ARN guia i seqüenciació dirigida. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et al. (2017) Pantalles combinatòries CRISPRCas9 per al mapeig de novo d'interaccions genètiques. Mètodes Nat 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Inducció de cèl·lules mare pluripotents de cultius de fibroblasts embrionaris i adults de ratolí per factors definits. Cel·la 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) Plataforma basada en interferències CRISPR per a pantalles genètiques multimodals en iPSC humà - neurones derivades. Neurona 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai per a l'activació i inhibició simultània de gens per promoure la condrogènesi de les cèl·lules mare i la regeneració òssia calvaria. Àcids nucleics Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Genètica combinatòria d'ordre elevat massivament paral·lela a cèl·lules humanes. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Cribratge CRISPR-Cas9 amb codi de barres multiplexat habilitat per CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Una pantalla CRISPR combinatòria de tres vies per analitzar les interaccions entre objectius drogables. Representant cel·lular 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*