Combinació d'agent de contrast de microbombolles amb irradiació làser polsada per al lliurament de fàrmacs transdèrmics Part1

Resum: El procés optodinàmic de cavitació de microbombolles (MB) induïda per làser en líquids s'utilitza en diverses aplicacions mèdiques. Tanmateix, rarament s'estima com la radiació làser incident interacciona amb els MB com a agent de contrast d'ultrasò quan el líquid ja conté MBs estables. El present estudi va investigar l'eficiència de la cavitació mediada per làser de MBs amb closca d'albúmina per millorar el lliurament de fàrmacs transdèrmics. Primer es van avaluar diferents tipus i condicions de cavitació inercial de MB mediada per làser. Es va seleccionar un làser polsat fraccionat de CO2 per combinar-lo amb MB en els experiments in vitro i in vivo. La penetració cutània in vitro de l'arbutina després de 2 h va ser 2 vegades més gran en el grup que combinava un làser amb MBs que en el grup control. En experiments amb animals petits, l'efecte blanquejador a la pell dels ratolins C57BL/6J del grup que combinava un làser amb MB a la pell més arbutina penetrant va augmentar (significativament) un 48.0 per cent els dies 11 i 5. 0,0 per cent el dia 14, i després va tendir a estabilitzar-se durant la resta del període experimental de 20-dia. Els resultats actuals indiquen que la combinació d'un làser de CO2 amb MBs amb closca d'albúmina pot augmentar la permeabilitat de la pell per millorar el lliurament de -arbutina per inhibir la melanogènesi en ratolins sense danyar la pell.

Segons estudis rellevants,cistancheés una herba comuna coneguda com "l'herba miracle que allarga la vida". El seu component principal éscistanòsid, que té diversos efectes com araantioxidant, antiinflamatori, ipromoció de la funció immune. El mecanisme entre cistanche iblanqueig de la pellrau en l'efecte antioxidant deglucòsids de cistanche. La melanina a la pell humana es produeix per l'oxidació de la tirosina catalitzada pertirosinasa. La reacció d'oxidació requereix la participació de l'oxigen, de manera que els radicals lliures d'oxigen del cos esdevenen un factor important que afecta la producció de melanina. Cistanche conté cistanòsid, que és un antioxidant i pot reduir la generació de radicals lliures al cos, per tantinhibint la producció de melanina.

Feu clic a Cistanches Herba per blanquejar

per a més informació:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Introducció

La cavitació fa referència a la formació de cavitats en un líquid i normalment es produeix quan el líquid està sotmès a canvis ràpids de pressió. Aquests canvis de pressió es poden induir mitjançant molts mètodes diferents, iniciant-se la cavitació acústica quan l'amplitud de la pressió acústica aplicada supera un determinat llindar [1]. La cavitació acústica implica la formació, creixement, pulsació i col·lapse de microbombolles (MB) en líquids durant la sonicació per ones d'ultrasò d'alta intensitat (EUA). Es creu que aquests fenòmens són els responsables de la barreja, la fragmentació, l'erosió, la humectació, la sonocapilar i altres efectes que tenen diverses aplicacions industrials pràctiques [1].

La cavitació induïda pels EUA dels agents de contrast MB també té un paper important tant en aplicacions mèdiques diagnòstiques com terapèutiques. Els agents de contrast dels EUA són MBs estabilitzats i recoberts que s'injecten intravascularment per millorar la resolució de la imatge diagnòstica dels EUA [2]. Hi ha proves de nombrosos estudis que la presència d'agents de contrast de MB a la sang pot disminuir el llindar de diversos efectes biològics induïts pels EUA tant in vitro com in vivo, com l'hemòlisi, la ruptura capil·lar i la sonoporació [3]. Alguns estudis han indicat que la presència d'agents de contrast de MB a la sang redueix significativament el llindar de contraccions cardíaques prematures induïdes pels EUA [4,5]. La ressonància de MBs (cavitació estable) dóna lloc a emissions harmòniques no lineals que es poden utilitzar en imatges de contrast específiques de MB. La cavitació inercial i la destrucció de MBs poden induir fortes tensions mecàniques que augmenten les permeabilitats de les membranes cel·lulars i la barrera hematoencefàlica per millorar el lliurament d'agents terapèutics. En els nostres estudis anteriors, hem aplicat la cavitació inercial de MBs induïda pels EUA per millorar el lliurament de fàrmacs transdèrmics (TDD), ja que es va trobar que la cavitació inercial provocava una millora de la permeabilitat de l'estrat còrnia molt més gran en comparació amb la cavitació estable [6–8] .

La irradiació làser és un enfocament alternatiu per millorar la penetració de fàrmacs i, per tant, facilitar el lliurament de fàrmacs a la pell o a través de ella. Quan un pols làser amb una intensitat per sobre d'un determinat llindar se centra en un líquid, la vaporització explosiva del líquid també pot induir la cavitació MB [9,10]. La naturalesa agressiva de la cavitació induïda per làser ha fet que s'utilitzi en una àmplia gamma d'aplicacions, com ara la lisi cel·lular, la poració de la membrana cel·lular i la cirurgia ocular [11]. Recentment s'han demostrat estratègies per millorar de manera segura l'aparició de cicatrius postoperatòries, atròfiques i d'acne mitjançant làsers ablatius fraccionats i no ablatius [12]. El resurfacing de la pell amb làser ablatiu proporciona les millores clíniques més grans, però la recuperació postoperatòria triga diverses setmanes [13]. Els procediments làser no ablatius poden ser més adequats per als pacients que no poden o no volen tolerar una curació postoperatòria prolongada. Tanmateix, la infecció prèvia per herpes simple es pot reactivar després de la remodelació de la pell amb làser no ablatiu a causa de la calor intensa produïda pel làser o una altra font de llum [13].

S'han desenvolupat alguns mètodes per reduir la calor produïda per la irradiació làser, com l'ús de peces de mà de refrigeració per contacte o dispositius criogènics dinàmics capaços de lliurar brots d'esprai de refrigeració de durada variable [14]. Tanmateix, encara no hi ha consens sobre quin mètode de refredament és més eficaç durant el tractament. A més, a diferència dels EUA, el mecanisme subjacent als efectes de la cavitació induïda per làser amb MB recoberts estabilitzats en líquids no està clar.

2. Materials i Mètodes

2.1. Producció de MB amb closca d'albúmina

Els MB amb closca d'albúmina es van preparar segons el procediment utilitzat en els nostres estudis anteriors [7, 15]. En resum, es van generar MBs amb closca d'albúmina per sonicació en 10 ml d'una solució que contenia 140 mg d'albúmina (Octapharma, Viena, Àustria) i gas perfluorocarboni en solució salina fisiològica (pH 7,4, { {21}}.9 per cent de clorur de sodi) utilitzant un sonicador (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, EUA) durant 2 min. El nombre de MB d'albúmina plens de perfluorocarboni a la solució es va mesurar mitjançant el dispositiu MultiSizer III (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA) amb una sonda d'obertura de 30- µm i límits de mesura de 0,6-20 µm. La distribució de la mida de la suspensió es va mesurar en funció de la dispersió de la llum dinàmica (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, Regne Unit), que va revelar que els MB amb closca d'albúmina tenien un diàmetre d'1,02 ± 0,11 µm (mitjana ± SD) i una concentració d'1,40. × 108 MBs/ml.

2.2. Interrupció de MB induïda per làser 

Estudis anteriors han suggerit que la interrupció de MB mediada pels EUA (és a dir, cavitació inercial) és necessària per a una TDD eficaç [8,16,17]. El present estudi va mesurar l'eficiència de la interrupció de MB quan s'utilitzen diferents tipus de làsers en diferents condicions. La concentració de MBs es va ajustar a 2,8 × 107 MBs/mL (dilució cinc vegades) i 1,4 × 107 MBs/mL (dilució deu vegades) en un tub Eppendorf, i la irradiació es va proporcionar amb quatre tipus de làser: làser d'ions d'argó refrigerat per aire. (515 nm, ona contínua), làser de fibra de supercontinu (1064 nm, ona polsada), làser Nd: YAG (532 nm, ona polsada) i làser fraccionat de CO2 (10.600 nm, ona polsada). Les condicions detallades per als diferents tipus de làsers es mostren a la taula 1.

Un exemple de la configuració òptica es mostra a la figura 1. El canvi de temperatura durant la irradiació làser es va mesurar mitjançant un termòmetre (Optris LS, Optris, Berlín, Alemanya). Després, després de l'exposició al làser, es van afegir 100 µL de la solució MB a un portaobjectes de microscopi per a l'observació. El nombre de MB en imatges de microscòpia de llum abans i després de la irradiació làser es va convertir en imatges en escala de grisos de 8-bits mitjançant MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, EUA) per facilitar les observacions de la interrupció de MB. La taxa de destrucció de MB es va quantificar segons les àrees danyades mitjançant l'equació següent:

2.3. Profunditat de penetració a la pell de porc

2.4. Penetració cutània in vitro per solució d'arbutina

Es va recollir una mostra de pell de porc de {{0}}mm de gruix amb un ganivet Humby, es va netejar acuradament amb PBS i es va tallar en trossos quadrats (2 cm × 2 cm). Les zones circulars de les mostres de pell amb un radi d'1,5 cm i una alçada de 5 mm es van envoltar amb gel per evitar fuites quan la mostra es carregava amb 5{{30}}0 µL de MB. Després d'irradiar la mostra set vegades (les condicions es mostren a la taula 1) amb un làser fraccionat de CO2, es va provar la penetració de la pell mitjançant cèl·lules de difusió Franz estàtiques sobre una àrea de 2, 14 cm2 segons el disseny experimental que hem descrit anteriorment [7]. La temperatura del conjunt de difusió es va mantenir a 37 ◦C. -arbutina (30 mg/ml, 500 µL, 4-hidroxifenil- -D-glucopiranòsid, massa molecular=272, 25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) va ser aplicat a la cara epidèrmica de la pell i ocluït amb parafilm (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, EUA). El compartiment de difusió del receptor que mirava al costat dèrmic es va omplir amb 12 ml de PBS (pH 7, 4), que es va agitar amb una barra magnètica que girava a 600 rpm. Les solucions de prova que no contenien MB es van filtrar a través d'un filtre de microporos de 0,2-µm (Nalgene, Rochester, NY, EUA) o un filtre de microporos de 0,22-m (Millex, Darmstadt, Alemanya). Es van prendre alíquotes (200 µL) de la solució del receptor a les 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 i 24 hores, i es van substituir pel mateix volum de solució de receptor fresca.

2.5. Anàlisi HPLC de -arbutina

Es va utilitzar una columna Inspire™ C18 (250 mm × 4,6 mm, mida de partícula de 5 µm; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, EUA) per mesurar les concentracions d'arbutina. El sistema HPLC estava equipat amb una bomba binària (PU-2089, Jasco, Tòquio, Japó), i la longitud d'ona del detector d'ultraviolats (UV) (UV-2075, Jasco) es va establir en 280 nm. La fase mòbil constava de metanol: aigua destil·lada (pH 5,5, 70:30 v/v) [18] a una velocitat similar de 0,6 ml/min. Totes les mostres a analitzar es van injectar a un volum de 20 µL. El temps de retenció de -arbutina va ser d'uns 4,3 minuts.

2.6. Tractaments amb animals

El contingut de melanina dels organoides es va investigar en el model de ratolí C57BL/6J [19]. Es van obtenir ratolins de cinc setmanes amb un pes de 20 a 25 g de Bio Lasco (Taipei, Taiwan). El protocol experimental va ser aprovat pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals del Centre Mèdic de Defensa Nacional, Taipei, Taiwan. Els procediments per a la cura dels animals complien les directrius i normatives institucionals (homologació núm. IACUC-17-092). Al llarg dels experiments, els animals es van allotjar en gàbies d'acer inoxidable en una habitació amb aire condicionat amb la temperatura mantinguda entre 25 i 28 ◦ C i amb cicles alternatius de llum i foscor de 12 h cadascun.

Els animals es van aclimatar durant 7 dies abans de l'experiment. Després de treure'ls el cabell d'una àrea de 2 cm × 2 cm, es va mesurar el color de la pell amb un cromàtic (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tòquio, Japó). A continuació, els animals van ser exposats a radiació ultraviolada B (UVB) (G8T5E, Sankyo, Tòquio, Japó) per induir hiperpigmentació (dosi d'energia total per exposició=1 J/cm2, longitud d'ona=306 nm, tres vegades per cada exposició). setmana durant 2 setmanes), i després es va tornar a mesurar el color de la pell.

Els animals es van dividir en els cinc grups següents (n {{0}} per grup, tractament aplicat un cop cada 3 dies durant 20 dies): (1) cap tractament (grup C); (2) aplicació de -arbutina penetrant sola (300 µg/mL, 0,2 mL/cm2) (grup A); (3) làser irradiant la pell directament amb l'aplicació d'arbutina penetrant (300 µg/mL, 0,2 mL/cm2) (grup L més A); (4) làser que irradia la pell coberta per solució salina i amb aplicació d'arbutina penetrant (300 µg/mL, 0,2 mL/cm2) (grup L més S més A); i (5) làser que irradia la pell combinat amb MBs a la pell i amb l'aplicació d'arbutina penetrant (300 µg/mL, 0,2 mL/cm2) (grup L més MBs més A). El canvi de color de la pell induït per cadascun dels tractaments es va avaluar en moments predeterminats mitjançant el cromàmetre. L'índex de lluminositat, L [20], es va calcular cada dia de mesura abans i després del tractament.

2.7. Estudi histològic

Es van prendre mostres de teixit de la pell (aproximadament 8 mm × 8 mm) de la zona de tractament immediatament després dels experiments i es van emmagatzemar en una solució de formalina al 10%. Es va aplicar la tinció d'hematoxilina i eosina (HE; Sigma-Aldrich) i les mostres van ser analitzades per un dermatopatòleg expert (HWG). Algunes altres mostres es van tenyir amb nitrat de plata Fontana-Masson (Kojima Chemical, Kashiwabara, Japó) durant 30 minuts a 60 ◦ C, i després es van rentar amb aigua destil·lada i es van fixar en una solució de tiosulfat de sodi al 5% (Duksan, Seül, Corea) durant 2 min, abans de tornar a rentar amb aigua destil·lada. A continuació, es van tacar les mostres amb una solució vermella nuclear ràpida (Fluka, Buchs, Suïssa) durant 5 minuts i es van rentar dues vegades amb aigua destil·lada. Finalment, les mostres es van deshidratar en un 95 per cent seguit d'un 100 per cent d'etanol i després es van rentar dues vegades amb xilè (Duksan) [21].

2.8. Anàlisi estadística

Les dades obtingudes es van analitzar estadísticament mitjançant la prova t de Student. Un valor de probabilitat de p < 0,05 es va considerar indicatiu d'una diferència significativa.

3. Resultats

3.1. Interrupció de MB induïda per làser

A la figura 2 es mostren imatges de microscòpia de MBs cinc vegades diluïts sense i amb irradiació per un làser continu (ion d'argó refrigerat per aire) de 10,8 mW i un làser polsat (fibra supercontinu) de 10,8 mW durant 60, 120 i 180 s. les taxes de destrucció del làser polsat van augmentar un 17,66 per cent, un 20,52 per cent i un 39,05 per cent en comparació amb el làser continu a 60, 120 i 180 s, respectivament. La figura 3 mostra l'eficàcia de destrucció de MB diluïts cinc i deu vegades quan s'utilitza un làser polsat Nd: YAG a 60, 120 i 180 s. Les taxes de destrucció de MB diluïts cinc i deu vegades van ser del 72,46% i del 78,59%, respectivament, als 60 s, 88,06%, 96,10% als 120 s, 85,22% i 98,80% als 180 s. La figura 4 mostra l'eficàcia de destrucció de MB diluïts deu vegades per ser irradiats una, tres i set vegades pel làser polsat fraccionat de CO2 clínic. La taxa de destrucció va augmentar amb el temps d'irradiació, essent prop del 100 per cent durant set vegades la irradiació, de manera que aquesta condició es va utilitzar en els experiments in vitro i in vivo posteriors.

per a més informació: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501