La comparació entre QPCR i RNA-seq revela els reptes de quantificar l'expressió HLA Part 1

Resum

Els loci de classe I i II de l'antigen leucòcit humà (HLA) són elements essencials de la immunitat innata i adquirida. Les seves funcions inclouen la presentació d'antigen a les cèl·lules T que condueixen a respostes immunes cel·lulars i humorals i la modulació de les cèl·lules NK. La seva influència excepcional en els resultats de la malaltia ara s'ha posat de manifest en estudis d'associació a tot el genoma. Els exons que codifiquen el solc d'unió al pèptid han estat el focus principal per determinar els efectes de l'HLA sobre la susceptibilitat/patogènesi de la malaltia. Tanmateix, els nivells d'expressió de HLA també s'han implicat en els resultats de la malaltia, afegint una altra dimensió a l'extrema diversitat d'HLA que afecta la variabilitat de les respostes immunes entre individus.

Hi ha una estreta relació entre els antígens leucòcits i la immunitat. L'antigen leucòcit es refereix a la molècula de la superfície dels glòbuls blancs humans, que pot identificar i distingir diferents tipus de cèl·lules i patògens. És una part important del sistema immunitari humà i un important regulador de la resposta immune.

Les diferències en els antígens leucòcits poden donar lloc a diferents respostes immunitàries i susceptibilitat a la malaltia. Per exemple, certs antígens de leucòcits estan associats amb malalties autoimmunes, malalties infeccioses i tumors. L'expressió de certs antígens leucòcits també està relacionada amb la funció i la quantitat de cèl·lules immunitàries.

Per tant, entendre les característiques moleculars de la superfície de leucòcits d'un individu és de gran importància per avaluar l'estat immune de l'individu i el risc i el pronòstic de la malaltia. Al mateix temps, també és propici per a la formulació de tractaments personalitzats i mesures preventives. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la immunitat. Cistanche té un efecte significatiu en la millora de la immunitat. Cistanche és ric en diverses substàncies antioxidants, com la vitamina C i carotenoides. Aquests ingredients poden eliminar els radicals lliures, reduir l'estrès oxidatiu i millorar la resistència del sistema immunitari.

Feu clic en pols d'extracte de cistanche tubulosa

Per estimar l'expressió HLA, els estudis immunogenètics tradicionalment es basen en la PCR quantitativa (qPCR). L'adopció de tecnologies alternatives d'alt rendiment com l'ARN-seq s'ha vist obstaculitzada per problemes tècnics a causa del polimorfisme extrem en els gens HLA. Recentment, però, s'han desenvolupat múltiples mètodes bioinformàtics per estimar amb precisió l'expressió HLA a partir de dades d'ARN-seq. Això obre una oportunitat emocionant per quantificar l'expressió HLA en grans conjunts de dades, però també planteja preguntes sobre si els resultats d'ARN-seq són comparables als de qPCR. En aquest estudi, analitzem tres classes de dades d'expressió dels gens HLA de classe I per a un conjunt d'individus coincidents: (a) RNA-seq, (b) qPCR i (c) expressió HLA-C de la superfície cel·lular. Hem observat una correlació moderada entre les estimacions d'expressió de qPCR i ARN-seq per a HLA-A, -B i -C ({{10}}.2 Menys o igual a rho Menys o igual a 0,53 ). Parlem dels factors tècnics i biològics que cal tenir en compte en comparar quantificacions per a diferents fenotips moleculars o utilitzar diferents tècniques.

Paraules clau

HLA · Expressió · PCR · ARN-seq.

Introducció

L'expressió gènica proporciona un fenotip molecular que es troba en una posició intermèdia entre la variació genètica i fenotips complexos, com ara l'estat de la malaltia. Comprendre la base genètica de l'expressió gènica pot ser estratègic per establir vincles entre la variació genètica i els fenotips complexos (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), inclosa la susceptibilitat a malalties autoimmunes i infeccioses. Tot i que l'estudi de la variació genètica en els loci de l'antigen leucòcit humà (HLA) i dins de la regió del complex major d'histocompatibilitat (MHC) en general, s'ha utilitzat per disseccionar la base genètica de diverses malalties complexes (Trowsdale i Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), la inclusió de fenotips moleculars, en particular els associats a l'expressió gènica, és relativament recent (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

La regió MHC humana del cromosoma 6p21 mostra una alta densitat de gens, amb patrons únics de desequilibri d'enllaç (LD) i polimorfisme extrem (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). La regió MHC conté els loci HLA de classe I i II que codifiquen molècules implicades en l'activació i modulació de la resposta immune. Les molècules HLA de classe I s'expressen per la majoria de cèl·lules nucleades i generalment presenten pèptids intracel·lulars a les cèl·lules CD8 més T. En canvi, les molècules HLA de classe II s'expressen principalment per cèl·lules presentadores d'antigen professionals i presenten antígens exògens a les cèl·lules CD4 més T que es van interioritzar per endocitosi. Les molècules de classe I també són reconegudes pels receptors de les cèl·lules assassines naturals (NK), els receptors semblants a les immunoglobulines de les cèl·lules assassines (KIR), que afecta tant l'educació com l'activació de les cèl·lules NK (Colonna i Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). L'aparellament de diferents alotips HLA de classe I i molècules específiques de KIR influeix en l'activitat de les cèl·lules NK (i un subconjunt de cèl·lules CD8 més T), donant lloc a riscos diferencials de càncer, malalties infeccioses i autoimmunitat (revisat a Kulkarni et al. 2008).

Les associacions de malalties HLA s'han atribuït principalment a diferències específiques d'al·lel en la presentació de l'antigen, a causa dels extensos polimorfismes al solc d'unió al pèptid. Tanmateix, els nivells d'expressió HLA contribueixen a algunes de les associacions observades entre els polimorfismes HLA i els resultats de la malaltia. El nivell d'expressió HLA és un modificador important de l'autoimmunitat i de la força de la resposta immune mediada per HLA al càncer i les infeccions (revisat a René et al. 2016).

Hi ha múltiples exemples d'associacions entre els nivells d'expressió HLA i els resultats d'infecció viral. Està ben documentat, per exemple, que nivells d'expressió HLA-C més alts, tant a nivell d'ARNm com de proteïnes a la superfície cel·lular, s'associen amb un millor control del VIH-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), mentre que l'expressió HLA-A elevada s'associa amb un control deteriorat del VIH (Ramsuran et al. 2018). La infecció per SARS-CoV-2 regula a la baixa l'expressió del gen HLA-C (Loi et al. 2022) i l'expressió HLA classe I a la superfície cel·lular (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), així com la classe HLA Expressió gènica II, incloent HLA-DPA1, -DPB1, -DRA i -DRB1 (Wilk et al. 2020).

A més, hi ha associacions entre els nivells d'expressió HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) i HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) amb l'eliminació del VHB; Expressió HLA-DRA amb susceptibilitat a la infecció per virus de la grip A dels ratpenats en línies cel·lulars humanes (Karakus et al. 2019); i àmplies associacions entre variants reguladores i nivells d'expressió als gens HLA de classe II, inclosos HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 i -DRB5 amb resposta d'anticossos contra múltiples virus prevalents (Kachuri et al. 2020).

Els nivells d'expressió dels loci HLA també estan associats amb l'autoimmunitat (vegeu Johansson et al. 2022 per a una revisió). S'han associat els nivells d'expressió HLA-C a la superfície cel·lular (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), així com els nivells d'HLA-G a la superfície cel·lular i al plasma (da Costa Ferreira et al. 2021). amb risc de malaltia inflamatòria intestinal. Es va observar un augment de l'expressió HLA-B27 a la superfície cel·lular entre els pacients amb espondilitis anquilosant (Cauli et al. 2002), així com l'expressió global de HLA de classe I entre els pacients amb malaltia de Graves (Weider et al. 2021). Els nivells d'expressió HLA classe II també influeixen en el risc de patir condicions autoimmunes.

L'expressió gènica HLA-DQA1 i -DRB1 i l'expressió de molècules DQ i DR a la superfície cel·lular s'incrementen en monòcits de sang perifèrica de pacients amb vitiligen (Cavalli et al. 2016); les variants reguladores associades amb una expressió gènica HLA-DQA1, -DQB1 i -DRB1 més alta i l'expressió DQ i DR a la superfície cel·lular s'associen amb el risc de lupus eritematós sistèmic (Raj et al. 2016); L'expressió del gen HLA-DRB5 és més alta en pacients amb esclerodèrmia amb malaltia pulmonar intersticial (Odani et al. 2012); Els al·lels HLA-DRB1 específics estan molt expressats en pacients amb artritis reumatoide (Houtman et al. 2021); i una expressió més alta de DRB1*15:01 s'associa amb el risc d'esclerosi múltiple (Alcina et al. 2012). Per tant, entendre la variació de l'expressió HLA entre individus i els mecanismes que regulen els nivells d'expressió HLA serà clau per descobrir la base genètica dels fenotips de la malaltia.

Tradicionalment, l'expressió HLA s'ha estimat mitjançant tècniques basades en anticossos per als nivells d'expressió a la superfície cel·lular (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) o per PCR quantitativa (qPCR o RT-PCR) per als nivells de transcripció d'ARNm (Bettens et al. 2013). al 2014; Ramsuran et al 2015, 2017). És un repte comparar els resultats entre estudis o fins i tot comparar diferents loci HLA dins del mateix estudi, ja que s'utilitzen diferents procediments experimentals per a cada anàlisi i per a cada locus HLA, que poden donar lloc a diferents eficiències d'amplificació en qPCR o afinitats d'anticossos en citometria de flux.

Les tecnologies d'alt rendiment com l'ARN-seq proporcionen estimacions d'expressió per a tots els gens del genoma, inclosos els gens HLA, permetent així l'avaluació de l'expressió HLA en un context de tot el genoma. Tanmateix, aquestes tecnologies comporten molts reptes quan s'utilitzen per estimar els nivells d'expressió dels gens HLA. A més dels biaixos ben documentats associats als assajos d'ARN-seq (per exemple, efectes per lots, preparació de biblioteques, contingut de GC ('t Hoen et al. 2013), la dificultat per estimar els nivells d'expressió dels gens HLA resulta del fet que la quantificació implica l'alineació de lectures breus a un genoma de referència, que no proporciona una representació completa de la diversitat al·lèlica HLA.

Per tant, algunes lectures poden no alinear-se a causa d'un gran nombre de diferències pel que fa al genoma de referència (Brandt et al. 2015). A més, els gens HLA formen part d'una família de gens formada després de successives rondes de duplicacions i sovint contenen segments que són molt similars entre paràlegs, donant lloc a alineaments creuats entre gens i quantificació esbiaixada dels nivells d'expressió. Aquestes dificultats van motivar el desenvolupament de canonades computacionals (vegeu Johansson et al. 2022 per a una revisió) que expliquen la diversitat HLA coneguda en el pas d'alineació i s'ha demostrat que proporcionen nivells d'expressió precisos per als gens HLA (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2012; 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

Tot i que tant els enfocaments RNA-seq com qPCR estimen l'expressió HLA quantificant l'abundància de transcripcions, els mètodes impliquen diferents procediments de processament experimental i bioinformàtic. Segons el nostre coneixement, no s'ha realitzat una comparació quantitativa dels resultats de l'ARN-seq amb els derivats de la qPCR per als gens HLA. En aquest estudi, hem intentat comparar diferents tècniques i fenotips moleculars per a la quantificació de l'expressió HLA de classe I, tenint en compte que cap tècnica es pot considerar un estàndard d'or. Per reduir l'efecte de la variació tècnica i biològica en la comparació de diferents estudis, vam realitzar un assaig d'ARN-seq en un conjunt de 96 individus per als quals estaven disponibles estimacions d'expressió de qPCR (per a HLA-A, -B, -C) i per a un subconjunt del qual també estava disponible l'expressió de superfície cel·lular basada en anticossos HLA-C. La quantificació d'ARN-seq es va realitzar amb un pipeline adaptat a HLA que permet una estimació precisa de l'expressió, minimitzant el biaix dels enfocaments estàndard que es basen en un únic genoma de referència.

Materials i mètodes

Mostres

Es van obtenir mostres de sang de 96 donants de sang sans inscrits al programa de donants voluntaris del Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR). Es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els subjectes i es van anonimitzar les mostres mitjançant procediments aprovats per l'IRB de l'Institut Nacional del Càncer. L'ARN es va extreure de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) acabades d'aïllar mitjançant el kit RNeasy Universal (Qiagen). L'ARN es va tractar amb DNAsa lliure de RNAsa per a l'eliminació de l'ADN genòmic. L'ARN total extret de les PBMC es va quantificar mitjançant HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Totes les mostres que mostraven una puntuació de qualitat de l'ARN superior a 8 es van utilitzar en les anàlisis d'expressió gènica.

Mecanografia HLA

Els al·lels HLA es van determinar mitjançant la seqüenciació de Sanger. A més, vam executar HLApers (Aguiar et al. 2019) i Kourami (Lee i Kingsford 2018) per inferir al·lels HLA directament a partir de RNAseq i vam comprovar si hi havia acord amb les trucades basades en la seqüenciació de Sanger. Si tenim en compte les trucades consistents entre HLApers i Kourami, només vam observar 10 discordances amb les trucades de Sanger de 288 comparacions (3 loci × 96 individus). La majoria d'ells (n=5) van mostrar suport de l'ARN-seq per a un al·lel molt proper al determinat per la seqüenciació de Sanger, per la qual cosa vam optar per mantenir les trucades basades en ARN-seq. Per a 3 genotips, observem trucades homozigotes de RNA-seq probablement perquè no s'expressava un al·lel i vam mantenir les trucades de la seqüenciació de Sanger. Això no afecta l'estimació de l'expressió, ja que cap lectura no s'alinea amb l'al·lel no detectat mitjançant RNA-seq. Per a un genotip, vam observar un bon suport per a una trucada heterozigota mentre que la seqüenciació de Sanger es va anomenar homozigot. En aquest cas, vam mantenir la trucada basada en RNA-seq, ja que explicava millor les lectures observades. Per a una trucada al·lel, vam considerar un error de les trucades basades en RNA-seq a causa d'una cobertura de lectura insuficient.

PCR quantitativa (qPCR)

Els nivells de transcripció d'ARNm de HLA per a HLA-A, -B i -C es van mesurar mitjançant qPCR en un assaig que garanteix l'amplificació imparcial dels al·lels comuns a cada locus alhora que s'evita l'amplificació de tots els altres loci. Els primers utilitzats van ser: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTGTTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). La transcripció inversa es va realitzar mitjançant el kit High-Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems). L'amplificació de l'HLA i l'ADNc de la microglobulina del gen 2 (B2M) de la neteja es va realitzar mitjançant Power SYBR green master mix (Applied Biosystems), en una màquina ABI 7900HT. Les seqüències d'encebadors per a B2M es descriuen a la taula S4 de Kulkarni et al. (2013). El nivell d'expressió mitjà de cada gen HLA es va normalitzar al de B2M i es va calcular mitjançant el mètode 2-∆∆Ct (on Ct és el cicle llindar).

Els nivells d'expressió específics d'al·lels mitjans dels al·lels HLA comuns es van estimar mitjançant un model lineal tal com es descriu a Ramsuran et al. (2015). Concretament, vam modelar l'expressió com a funció lineal dels dos al·lels portats per cada individu i vam extreure els efectes de cada al·lel sobre l'expressió gènica. Hem realitzat aquest pas a R (vegeu la secció Disponibilitat del codi).

Expressió superficial

L'expressió de la superfície cel·lular HLA-C es va mesurar en cèl·lules CD3 més de PBMC recentment aïllades mitjançant citometria de flux mitjançant l'anticòs monoclonal específic de HLA-C DT9 (Apps et al. 2013). Per a l'anàlisi HLA-A en un subconjunt d'individus que portaven A * 03 i A * 11, vam tacar cèl·lules amb l'anticòs 0554HA (One Lambda, Inc.).

ARN-seq

Preparació de l'ARN

L'ARN-seq es va realitzar a l'ARN emmagatzemat a -80 graus. L'ARN total es va quantificar mitjançant l'assaig Qubit RNA HS (Thermo Fisher). La qualitat de l'ARN es va avaluar mitjançant un instrument Bioanalyzer 2100 i un Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). Per a cada mostra, es van utilitzar 500 ng d'ARN total com a entrada per a la preparació de biblioteques completes d'ARNr de transcriptoma. Es va preparar una biblioteca lligada amb adaptadors amb el KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) mitjançant adaptadors de codi de barres d'ADN Bioo Scientific NEXTfex ™ (BioScientifc, Austin, TX, EUA) segons el protocol proporcionat per KAPA.

Esgotament de l'ARNr mitjançant RiboErase

L'ARN ribosòmic es va esgotar incubant l'ARN total amb sondes complementàries a les seqüències d'ARNr. Després de la hibridació, es va utilitzar la RNasa H per degradar enzimàticament l'ARNr. La neteja i la digestió de la DNasa es van realitzar mitjançant Kapa Pure Beads i DNasa segons el protocol Kapa.

Fragmentació, síntesi d'ADNc i construcció de biblioteques

Les mostres esgotades d'ARNr es van fragmentar a 85 graus durant 4, 5 min en presència de magnesi abans de la síntesi de la primera i la segona cadena i les reaccions de cua A. Els adaptadors de codi de barres d'ADN NEXTfex (1,5 uM) es van lligar a l'ADNc de cua A amb un codi de barres únic per a cada mostra. Els productes es van purificar amb Kapa Pure Beads i es van realitzar 8 cicles d'amplificació de biblioteca. Després de l'amplificació, es va realitzar una neteja final de la biblioteca i es va avaluar la quantificació de la biblioteca i el control de qualitat mitjançant l'assaig Qubit DNA HS (Thermo Fisher) i el kit Agilent DNA HS a l'instrument 2100 Bioanalyzer.

Seqüenciació

Les biblioteques de seqüenciació multiplexada resultants es van utilitzar en la formació de clúster en un cBOT Illumina (Illumina, San Diego, CA, EUA) i la seqüenciació es va realitzar mitjançant un Illumina HiSeq 2500 seguint els protocols proporcionats per Illumina per a una seqüenciació d'extrem aparellat de 2 × 126 pb. Cada transcriptoma es va seqüenciar a una profunditat objectiu de 40-50 milions de lectures.

ARN-seq en mostres fresques d'11 individus

Per investigar la possibilitat de degradació de la mostra del material emmagatzemat a -80 graus abans de la seqüenciació de l'ARN, una font potencial de desacord amb les estimacions de qPCR, vam tornar a extreure sang d'11 donants i vam realitzar RNA-seq a les noves mostres. L'experiment es va dur a terme amb la mateixa preparació i mètodes de la biblioteca que abans, però seqüenciat mitjançant un Illumina NextSeq amb lectures de 2 × 150 pb.

Quantificació de l'expressió d'ARN-seq

Transcriptoma de referència

Hem utilitzat Salmon (Patro et al. 2017) per estimar els nivells d'expressió de totes les transcripcions anotades a la base de dades Gencode v37. Hem utilitzat totes les opcions per a la correcció del biaix al salmó (biaix GC, biaix posicional i biaix específic de la seqüència).

Personalitzat

Igual que el "Transcriptoma Ref", però amb transcripcions HLA personalitzades segons els genotips HLA-A, -B i -C portats per cada individu. La personalització es va dur a terme alineant la seqüència de l'al·lel HLA del genoma de referència amb el genoma per obtenir les coordenades. Aleshores, utilitzant l'alineació multiseqüència de l'al·lel present al genoma de referència amb tots els altres al·lels (disponible a partir de la versió 3.43 d'IPD-IMGT/HLA.0 (Robinson et al. 2020)), vam atribuir genòmica posicions a tots els al·lels HLA. Finalment, vam construir una transcripció personalitzada basada en la combinació d'informació sobre les coordenades de la transcripció i la seqüència de l'al·lel HLA. Aquest procediment es va dur a terme a R (R Core Team 2020), utilitzant el paquet Biostrings (Pagès et al. 2020) i el meta paquet tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com