Perfil complet de les formulacions de secretoma a partir de cèl·lules mare de líquid amniòtic humà fetal i perinatal

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

A més, a partir dels gràfics de barres de les figures 5B i 6B, la distribució de proteïnes distintiva segons el precondicionament hipòxic de les cèl·lules secretores és apreciable. En aquest cas, per obtenir informació completa, també es van informar de proteïnes que no superen el llindar de DAve i DCI. El fetal té resultats de secretomes enriquits amb la proteïna de xoc tèrmic de 60 kDa (HSPD1, figura 5B, panell esquerre) en la seva formulació hipòxica, mentre que la contrapart perinatal altament expressava la cèl·lula muscular llisa contràctil reguladora de la miosina [52] polipèptid lleuger 9 (MYL9, figura). 5B, panell dret). Una part important de la diferència entre les etapes gestacionals sembla que depèn més del precondicionament hipòxic en hAFS. vehicles elèctrics; Els f-have-EV obtinguts a partir de l'encebació de cèl·lules hipòxiques es van trobar enriquits amb factors com Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), subunitat de laminina -5 i -1(LAMA5 i LAMB1), trombospondina{{17 }} (THBS1, figura 6B, panell esquerre). Els p-hAFS-EV hipòxics contenien cadena pesada de ferritina (FTH1), proteïnes de bastida com Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexina A6 (ANXA6), inhibidor de la dissociació del PIB Rab beta (GDI2), juntament amb Thy -1 glicoproteïna de membrana (THY1), neuropilina-1(NRP1) i Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, figura 6B, panell dret).

Feu clic aquí per saber-ne més

Es van trobar proteïnes amb una freqüència d'almenys 2 en cada condició examinada en f-hAFS. Els EV i els p-hAFS-EV es van comparar encara més amb la base de dades Vesciclepedia [53]. Com era d'esperar, la majoria de les proteïnes identificades (96 per cent) s'han descrit prèviament en EV i exosomes a la base de dades de referència (figura S3A).avantatges de cistancheEn aquest sentit, l'anàlisi d'enriquiment de Gene Ontologia (GO) es va realitzar mitjançant FunRich [54]. L'abundància de termes GO al conjunt de dades es va comparar amb la seva quantitat natural a la base de dades de referència per trobar grups de proteïnes estadísticament sobrerepresentats, segons la seva implicació en processos biològics, funció molecular i components cel·lulars (per a aquest últim aspecte les dades no són mostrat, però disponible a petició). Pel que fa a l'anàlisi de les funcions moleculars associades a les proteïnes identificades, les fraccions hAFS-CM van indicar l'enriquiment en un constituent estructural de la matriu extracel·lular i el citoesquelet, la unió a proteïnes del citoesquelet i l'activitat de la molècula estructural (Figura S2), mentre que els hAFS-EV es van enriquir amb una estructura estructural. constituent del citoesquelet i del ribosoma, la unió a l'ADN i l'ARN i els factors d'unió a GTPasa i chaperones (figura S3C).

L'anàlisi d'enriquiment de processos biològics tant per a hAFS-CM com per a have-EVs va indicar que la majoria de proteïnes modulades a les fraccions de secretoma fetal i perinatal de hAFS pertanyen al creixement/manteniment cel·lular i al metabolisme de proteïnes (figures 5C i 6C). Dins dels hAFS-EV, vam observar que el terme "components estructurals de la matriu extracel·lular" estava associat exclusivament amb f-hAF-EV hipòxics; els termes "unió d'ions de calci" i "activitat molecular estructural" es van enriquir principalment en mostres f-hAFS i p-hAFS hipòxiques (figura S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10,4I i un DCI (confiança de l'expressió diferencial) superior o igual a I5I van passar els filtres i es van considerar expressats de manera diferencial; vegeu la taula S3 per a la llista completa i els paràmetres detallats de les proteïnes informades. (C) Anàlisi d'enriquiment de processos biològics de proteïnes identificades amb una freqüència d'almenys 2 en f-hAFS-EV (tauler esquerre) i p-hAFS-EVs (plafó dret) després del precondicionament hipòxic. A partir de l'eina FunRich, els termes d'ontologia gènica es mostren en gràfics de barres que informen del percentatge de gens enriquits per a cada categoria (barres grogues fosques per a f-hAFS-EVsnormo, barres vermelles per a f-hAFS-EVShypo, barres verdes clars per a p-hAFS). -EVsnormo i barres de color verd fosc per a p-hAFS-EVShypo). Només els termes d'ontologia gènica amb Bonferroni corregit*p<0.05 are="">

Cistanche pot anti-envelliment

2.6.El perfil de citocines i quimiocines de fets i perinatals ha-CM i have-EVs van revelar diferents patrons de distribució

Prèviament hem validat la capacitat regenerativa de f-hAFS-CMhypo en cèl·lules cardiovasculars lesionades mitjançant efectes paracrins [34,35,49]. Aquí vam comparar el contingut de citocines i quimiocines de f-hAFS-CMHypo amb el corresponent p-hAFS (figura 7A, figura S4A i taula S4) i vam trobar alguns factors discriminants.

L'ANGIOGENINA, l'inductor de la metal·loproteïna de matriu extracel·lular (EMMPRIN), la interleucina 8 (IL-8) i la proteïna quimioattractora de monòcits-1 (MCP-1) es van trobar exclusivament enriquits amb inf-hAFS-CMNypo i no es van trobar detectat en p-hAFS-CMhypo. La proteïna d'unió del factor de creixement similar a la insulina 2 (IGFBP2) i l'osteopontina (OPN) van augmentar significativament en f-hAFS-CMhypo respecte a p-hAFS-CMHypo en 3.5-i 3.8- vegades (" pàg<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Si bé el fetal-versus perinatal have-CM va mostrar una expressió diferencial en el seu perfil de citocines i quimiocines, els corresponents homòlegs EV fetals versus perinatals es van distribuir de manera més homogènia, tot i que amb perfils d'expressió més baixos (figura 7B, figura S4B i taula S5). No obstant això, es podrien apreciar algunes diferències: la diPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), el factor de creixement/diferenciació 15 (GDF-15) i IL-8 només es van expressar per f-hAFS-EVSHypo, encara que a baix nivells; L'ANGIOPOIETINA2, el LIGAND CD40 i la proteïna d'unió a la vitamina D (VDBP) només es van trobar a p-hAFS-EVShypo, tot i que es van tornar a detectar en quantitats baixes. Altres citocines com el factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, proteïna d'unió del factor de creixement similar a la insulina 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, factor estromal derivat{ {23}} alfa (SDF-1a), es van trobar tant a f-hAFS-EVShypo com a p-hAFS-EVSHvpo, amb PAI-1 i EMMPRIN més altament expressats (figura 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 i SDF-lo es van enriquir exclusivament en tots els have-EV hipòxics en comparació amb l'hAFS-CM corresponent, independentment de l'etapa gestacional. A més, mentre que EMMPRIN no es va detectar dins de p-hAFS-CMhypo, es va trobar enriquit en la fracció corresponent a EV; per contra, OPN era més abundant a f-have-CMhypo que a f-have-EVShypo, mentre que era comparable entre les fraccions de secretoma p-hAFS corresponents. FGF-19, MIF i PTX3 es van expressar de manera similar tant en has-CM fetal com perinatal i en els hAFS-EV corresponents. PAI-1 estava molt enriquit en fraccions de secretoma hipòxic.

Figura 7. Perfil de citocines i quimiocines dins de les formulacions de secretomes hAFS fetals i perinatals. (A) L'expressió de citocines i quimiocines detectades dins de l'haver-CM fetal-versus perinatal hipòxic (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) s'informa en densitat de píxels per unitat arbitrària [AU]. Els valors s'expressen com a mitjana ±sem d'experiments independents i s'informen a la taula S4;*p=0.0485;**p{=0.006.(B)El contingut de citocines i quimiocines detectat en el fetal hipòxic. versus hAFS-EV perinatals (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) i expressat per densitat de píxels en unitats arbitràries [AU].colesterol de cistancheEls valors s'expressen com a mitjana±sem de n=3 experiments independents i s'informen a la taula S5. CST3: Cistatina C; EMMPRIN: Inductor de la metal·loproteinasa de matriu extracel·lular; FCFF-19: Factor de creixement del fibroblast-19;IGFBP2:Factor de creixement similar a la insulina (IGF) Proteïna d'unió 2; IL-8: Interleucina -8;IL-17a:Interleuquina-17a; MCP-1: proteïna quimioattractant de monòcits-1;MIF:factor inhibidor de la migració dels macròfags; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: inhibidor de l'activador del plasminogen-1; BDNF: Factor neurotròfic derivat del cervell; DPPIV: Dipeptidil Peptidasa IV; GDF-15:Factor de diferenciació del creixement-15;IGFBP3:Factor de creixement similar a la insulina (IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Factor estromal derivat-1 alfa; VDBP: proteïna d'unió a la vitamina D.

2.7. Els EV fetals i perinatals s'enriqueixen amb informació d'ARN a la seva càrrega

Com que els petits ARN no codificants s'han considerat reguladors mestres de la influència paracrina de l'EV a les cèl·lules diana [4, 55], ens vam centrar principalment en l'anàlisi de seqüenciació d'ARN en el contingut de microRNA (miRNA) dins dels f-hAFS-EV i p-hAFS-EVs. El perfil d'ARN petit va mostrar un enriquiment de miRNA tant en hAFS-EV fetals com perinatals (al voltant del 35-36 per cent) en comparació amb la quantitat total d'ARN petita (figura 8A). De fet, el component miRNA es trobava entre les dues espècies d'ARN més representades en ambdues formulacions d'EV, juntament amb l'ARNr (***p) p <0.0001). els="" mirna="" següents="" van="" ser="" els="" més="" enriquits="" a="" les="" mostres="" d'ev="" analitzades:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,deixa-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" i="" mir-221-3p.="" cal="" destacar="" que="" els="" have-ev="" fetals="" i="" perinatals="" compartien="" la="" majoria="" d'aquests="" mirna="" (és="" a="" dir,="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47}="" }}f-5p,="" deixa-7i-5p,="" mir{-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir{-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir{-125b{-5p,="" mir{-155-5p,="" mir-191-5p="" i="" mir{-221-3p,="" figura="" 7b).="" les="" 15="" espècies="" de="" mirnas="" més="" enriquides="" cobrien="" més="" del="" 60="" per="" cent="" del="" contingut="" total="" de="" mirna="" a="" cada="" mostra.="" d'altra="" banda,="" es="" van="" trobar="" uns="" 100="" mirnas="" en="" el="" 30="" per="" cent="" restant="" del="" contingut="" de="" mirna="" vesicular="" (figura="">

Per caracteritzar encara més el contingut de miRNA dins dels hAFS-EV, es va investigar si l'etapa gestacional hAFS o el precondicionament de cèl·lules hipòxiques in vitro podrien influir en l'enriquiment de miRNA específics. La modulació més forta es va trobar entre les etapes gestacionals, on gairebé tots els miRNAs modulats es van enriquir en f-hAFS-EV sobre la contrapart perinatal (figura 9A i taula 1). El precondicionament hipòxic va tenir un efecte més suau sobre la càrrega de miRNA, mentre que en aquesta comparació la modulació era en qualsevol direcció, amb alguns miRNA enriquits en hipòxic i altres en condicions de control normoxics (figura 9A).

Com a anàlisi complementària, ens vam centrar en la identificació dels miRNAs investigats amb la variabilitat més baixa entre els diferents donants i el precondicionament del cultiu, per als EV derivats de les dues etapes gestacionals investigades. Els miRNA resultants d'aquesta anàlisi van abastar des de nivells d'expressió alts fins a baixos (figura 9B). Dins del nucli de miRNA més estable de la càrrega dels hAFS-EV, es van identificar alguns miRNA compartits entre els f-hAFS-EV i els p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p a nivell alt; miR-221-3p,miR-221-5p i miR-22-3p a nivell tènue, taula 2).

Figura 9. Anàlisi de l'enriquiment diferencial de miRNAs en hAFS-EV fetals i perinatals. (A) Parcel·les de volcà per a l'enriquiment diferencial de la càrrega de miRNA hAFS-EV segons l'etapa gestacional (tauler esquerre) i el precondicionament hipòxic in vitro de les cèl·lules secretores (tauler dret). Per obtenir més informació sobre miRNA, consulteu la taula 1. (B) Gràfic de dispersió de la correlació entre la variabilitat (eix X) i el nivell d'enriquiment (eix Y) de miRNAs estables dins dels hAFS-EV fetals (tauler esquerre) i hAFS-EVs perinatals (tauler dret) segons alt (punts grocs), enriquiment tènue (punts verds) i baix (punts porpra fosc). Per obtenir més informació sobre miRNA, consulteu la taula 2.RPM: lectures per milió.

3. Discussió

Les mostres sobrants de líquid amniòtic humà s'han identificat com una font valuosa de cèl·lules estromals amb un potencial prometedor en medicina regenerativa i enginyeria de teixits. Les preocupacions ètiques associades amb el seu aïllament són mínimes, ja que es poden obtenir a partir de mostres sobrants de l'amniocentesi prenatal de cribratge rutinària, durant el II trimestre de gestació (hAFS fetal) o del líquid amniòtic rebutjat com a residu clínic en la cesària programada del III trimestre. procediments perinatals (hAFS perinatal). En els últims anys, els hAFS s'han proposat com a terapèutiques potencials per a la reparació i regeneració de teixits humans donada l'evidència encoratjadora obtinguda a partir de models experimentals de malalties. Curiosament, també s'han proposat per a la teràpia in utero de malalties neurològiques feto-neonatals; de fet, els estudis preclínics van suggerir que l'hAFS administrat prenatalment mitjançant el lliurament intraamniòtic va salvaguardar la medul·la espinal durant la gestació mitjançant l'activitat paracrina en un model de rata de mielomeningocele [56-58] i va reduir el dany de l'intestí exposat en la gastrosquisis experimental de rosegadors[59]. ]. Des d'una perspectiva translacional, el trasplantament in utero d'hAFS podria ser substituït per l'administració de la preparació més adequada del seu secretoma (hAFS-CM o hAFS-EVs).efectes secundaris de cistanche deserticolaAquesta estratègia permetria una intervenció ràpida i oportuna durant la gestació mitjançant la superació de les limitacions de la teràpia cel·lular canònica (és a dir, l'expansió cel·lular in vitro que requereix molt de temps) alhora que proporciona formulacions farmacèutiques disponibles i llestes per al seu ús.

El desenvolupament recent de tècniques diagnòstiques prenatals menys invasives pot donar lloc a una disminució dels procediments d'amniocentesi en un futur proper, defensant així l'AFS perinatal com l'opció més accessible. No obstant això, com que els hAFS fetals són més immadurs en el desenvolupament, poden albergar un potencial paracrí més efectiu. En aquest escenari, aquí vam comparar c-KITt hAFS fetal i perinatal i ens vam centrar a perfilar les seves fraccions secretomes. Hem destacat les distincions rellevants a tenir en compte per a la possible traducció clínica de la seva capacitat paracrina.

D'acord amb estudis independents anteriors, demostrem que l'etapa gestacional no va influir en la morfologia heterogènia hAFS i el seu perfil d'antigen mesenquimal [25,26]. A continuació, es van avaluar paràmetres amb més probabilitats d'afectar l'activitat secretora i paracrina cel·lular més enllà de l'immunofenotip estromal canònic. En particular, s'ha demostrat recentment que la presència d'una subpoblació CD146-positiva alta en CD107a dins dels progenitors mesenquimàtics de medul·la òssia es correlaciona amb una notable activitat paracrina moduladora i terapèutica [47]. Aquí vam revelar que tant l'hAFS fetal com perinatal es caracteritzen fortament per aquesta signatura molecular que recolza la seva potència secretora amb implicacions translacionals rellevants. A més, els hAFS fetals es van caracteritzar per un metabolisme aeròbic ineficient, mentre que els perinatals més madurs van mostrar una taxa de consum d'oxigen més alta i una síntesi d'ATP. Això pot suggerir un perfil metabòlic més immadur de l'hAFS del II trimestre que s'assembla a les cèl·lules estromals del cordó umbilical dels nadons prematurs, que han mostrat la mateixa tendència [60].

Per tal de desencadenar el potencial paracrí, els hAFS es van exposar a un cebament hipòxic sense sèrum de 24 hores, una estratègia que hem desenvolupat amb èxit [34,35,37] per a cèl·lules fetals i que aquí vam investigar en el seu homòleg perinatal per primera vegada. El precondicionament fetal i perinatal d'hAFS sota hipòxia va donar lloc a una tendència positiva en l'augment de la seva concentració de secretoma i en la quantitat d'EV alliberats, mentre que l'etapa gestacional no va exercir cap efecte sobre el rendiment del secretoma cel·lular ni sobre la morfologia i la distribució de la mida de l'EV.

En particular, la caracterització de la càrrega paracrina hAFS va revelar algunes diferències específiques, segons les diferents condicions que vam avaluar. El perfil proteòmic del secretoma fetal hAFS va revelar distribucions de factors perceptibles basades en l'etapa gestacional i el precondicionament hipòxic cel·lular. Això indica que el potencial paracrí hAFS pot adquirir una identitat diferent durant la maduració del Ⅱ al Ⅲ trimestre de gestació que, al seu torn, es pot modular estimulant les cèl·lules secretores in vitro. L'anàlisi d'enriquiment de processos biològics de hAFS-CM i hAFS-EVs va suggerir que la majoria de les proteïnes modulades poden concórrer al creixement/manteniment cel·lular i al metabolisme de proteïnes, donant suport als efectes paracrins beneficiosos per a les cèl·lules reportats fins ara. En particular, es va trobar el secretoma total de hAFS fetal hipòxic enriquit amb la proteïna de xoc tèrmic HSPD1 (HSP60), que es va demostrar que donava suport a la cicatrització de ferides en un model de lesió de la pell del ratolí diabètic i que promou la desviació de la resolució de macròfags en el fenotip M2 [61] . Així mateix, els hAFS-EV fetals hipòxics es van enriquir amb factors que promouen la neurogènesi (HSPG2[62], l'autorenovació cel·lular i el desenvolupament cerebral i cardiovascular (LAMA5[63]i LAMB1[64]i la migració (THBS1 [2]). També es va trobar AGRN en els vehicles elèctrics després de l'encebació hipòxica del hAFS fetal.dosificació de cistanche redditLes nostres troballes estan en línia amb evidències prèvies que AGRN està regulat en el proteoma de les cèl·lules estromals mesenquimals sota estímuls instructius inflamatoris i hipòxics [65]. També s'ha demostrat que AGRN està implicat en la senyalització de la sinapsi immune [66] i que coincideix amb la regeneració del cor del ratolí neonatal [67], donant suport així a una predisposició pronunciada de l'hAFS fetal jove en desenvolupament cap als efectes paracrins regeneratius. A més, es va confirmar que l'hAFS fetal era més sensible al precondicionament hipòxic, com ho demostra l'enriquiment de predictors de l'eficàcia regenerativa vascular, com ara ANGIOGENINA, EMMPRIM, IL-8 i MCP-1 citocina[68], en el seu mitjà condicionat. Això dóna suport a proves prèvies de la potència paracrina de l'hAFS-CM fetal per augmentar la neoarteriogènesi endògena en models preclínics de rosegadors d'infart de miocardi, isquèmia de les extremitats posteriors i colgajo fasciocutani isquèmic [34,69-71] A més, l'hAFS fetal El secretoma total es va trobar significativament més enriquit amb IGFBP2 i OPN en comparació amb el perinatal, cosa que suggereix un perfil modulador pro-resolució i anti-envelliment més pronunciat[72-75]. El have-CM perinatal, tot i que estava menys millorat en factors paracrins, es va complementar de manera similar amb factors neurotròfics i immunomoduladors, com ara CST3[76,77] i MIF[78].

En comparació amb el hAFS-CM total, els corresponents homòlegs EV fetal i perinatal hipòxics van mostrar una expressió menor de citocines i quimiocines, a excepció del mediador de remodelació vascular EMMPRIN [79], que es va enriquir majoritàriament al compartiment de la vesícula. El perfil cardioactiu i pro-regeneratiu reportat anteriorment dels hAFS-EV fetals[34,37] s'ha confirmat aquí mitjançant l'evidència de la seva expressió exclusiva d'IL-8 [80] i GDF-15 cardioprotectores, un factor paracrí clau que desencadena la neurogènesi endògena de l'hipocamp adult[81,82], així com contraresta la cardiotoxicitat induïda per antraciclines [78]. Tant els hAFS-EV fetals com perinatals van mostrar una expressió similar per al regulador del tràfic de cèl·lules mare/progenitors SDF-1 [83-85]. L'anàlisi proteòmica va informar de l'augment de l'expressió de proteïnes relacionades amb l'angiogènesi, com NRP1 [86] i MP14[87]en els hAFS-EV perinatals hipòxics; aquest perfil estimulador pot explicar resultats anteriors sobre les propietats regeneratives endotelials de l'hAFS Ⅲ trimestre en un model preclínic de ratolí de lesió isquèmica del múscul esquelètic [25], malgrat l'evidència que el seu hAFS-CM és menys pro-angiogènic que el fetal corresponent. En particular, el factor de creixement neural BDNF es va trobar tant en la càrrega fetal com perinatal d'EV, tot i que en quantitats baixes, cosa que suggereix una activitat neurotròfica putativa per als hAFS-EV en els processos de supervivència neuronal i neurodesenvolupament, com també s'observa per a les vesícules extracel·lulars secretades per l'os humà. sang de medul·la i cordó umbilical-MSC[8889]. Ambdues formulacions de secretomes d'hAFS fetal i perinatal sotmeses a estimulació hipòxica van demostrar estar enriquides amb PAI-1, un facilitador de l'activació endotelial [90] que també ha participat en la polarització dels macròfags M2 al cor i dotat de cardioprotector. i potencial antifibròtic [91].

Els microARN (miRNAs) s'han abordat àmpliament com a reguladors crucials de l'activitat paracrina de les cèl·lules mare i de les cèl·lules estromals mesenquimals-EV [92,93]. Aquí vam trobar que les 15 espècies de miRNA més enriquides dins dels hAFS-EV cobreixen més del 60 per cent del contingut total de miRNA de cada mostra. S'ha informat que aquests miRNA caracteritzen la càrrega molecular de les cèl·lules estromals mesenquimals-EV (-7a-5p [4,95]), protegeixen contra la isquèmia miocàrdica influint en la regeneració vascular i inhibint la fibrosi (permet -7b-5p, let{-7f{-5p, miR-21-5p i miR{-155-5p [96,97]), promou cicatrització de ferides mitjançant la regulació de la funció dels queratinòcits (miR-16-5p [98]) i contrarestar la mort neuronal després d'una isquèmia del cervell anterior (miR-29a-3p [99.100]). D'altra banda, es van trobar uns 1000 miRNAs en el 30% restant del contingut de miRNA vesicular. Aquesta distribució desequilibrada és coherent amb estudis anteriors [4] i destaca els miRNAs majoritàriament enriquits com els putatius responsables de l'activitat biològica principal dels hAFS-EV. Curiosament, els hAFS-EV fetals i perinatals compartien la majoria de 15 miRNAs. Cal destacar que també vam observar que tant els hAFS-EV fetals com els perinatals contenien un conjunt de miRNAs molt estables a diferents nivells d'enriquiment. Aquesta evidència pot suggerir una àmplia gamma de candidats "de neteja" per utilitzar-los com a control de referència intern en experiments de qPCR amb hAFS-EV. A més, un subconjunt consistent d'aquests miRNAs estables (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) es comparteix entre les dues etapes gestacionals i es solapa amb les 15 majoritàriament enriquides, cosa que suggereix un comportament encara més constant i una signatura molecular de pre-resolució fiable ([96,{{45} }}]). Cal destacar que un parell de candidats dins d'aquest nucli distintiu s'han informat recentment com a miRNAs de referència dins d'EV neuroprotectors obtinguts a partir de cèl·lules estromals mesenquimals derivades del líquid amniòtic del segon trimestre (miR-29a-3p i miR{{ 49}}p[95]). No obstant això, també vam observar que l'edat gestacional pot modular la càrrega de miRNA més que el precondicionament hipòxic. Desenvolupament, més EVs juvenils obtinguts a partir d'hAFS fetal del III trimestre es van enriquir amb miRNAs que anteriorment es va demostrar que recolzen la viabilitat de les cèl·lules mare embrionàries (miR-302-3p [101]), la proliferació cel·lular i la diferenciació osteogènica de les cèl·lules estromals de la medul·la òssia (miR). -217 [102]), alhora que alberga potencial supressor de tumors (miR{-302-3p[103,104]); miR{-383-5p[105,106]).

A partir dels nostres resultats, aquí confirmem que l'hAFS fetal i perinatal pot representar fonts paracrines atractives per explotar per a la medicina regenerativa. Tot i que el seu fenotip i l'activitat secretora eren similars, hem destacat alguns aspectes peculiars en les seves formulacions de secretoma com a coneixements útils per a la seva traducció terapèutica futura.

4. Materials i Mètodes

4.1.Aïllament de cèl·lules mare del líquid amniòtic humà i cultiu in vitro

Les cèl·lules mare del líquid amniòtic humà (hAFS) es van aïllar a partir de mostres sobrants de líquid amniòtic (FA) recollides mitjançant un cribratge prenatal rutinari mitjançant amniocentesi Ⅱ trimestre (hAFS fetal, f-hAFS) o com a residus clínics durant el part programat per cesària durant Ⅲ trimestre. (hAFS perinatal,p-hAFS) a la Unitat de Diagnòstic Prenatal i Medicina Perinatal de l'Hospital IRCCS San Martino, a la Unitat de Medicina i Cirurgia Fetal i Perinatal i al Laboratori de Genètica Humana de l'Hospital IRCCS Istituto Gaslini (Gènova, Itàlia). Es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els donants d'acord amb l'autorització del comitè d'ètica local (protocol PR428REG2015) i d'acord amb les directrius de la Declaració d'Hèlsinki. Les mostres de FA fetal del II trimestre es van obtenir de dones donants amb una edat mitjana d'uns 37,42 ± 0,32 anys (n=15 que van des de 36-fins a 41 anys); es van obtenir mostres de FA perinatals del Ⅲ trimestre de dones donants amb una edat mitjana de 34,25 ± 1,31 anys (n=10 que van des de 26- fins a 42 anys). Els hAFS fetals i perinatals es van obtenir a partir de mostres validades per a cariotip normal i aïllades mitjançant classificació immunomagnètica per a l'expressió de c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bolonya, Itàlia) de cèl·lules estromals mesenquimals AF adherents [16].Beneficis de l'extracte de cistanchec-KIT* hAFS es va cultivar en un mitjà essencial mínim (MEM)-alfa amb un 15 per cent de FBS (sèrum boví fetal, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia), un 18 per cent de Chang B i un 2 per cent de mitjà Chang C (Irvine Scientific). , Santa Ana, CA, EUA) amb 1 per cent de L-glutamina i 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia), en una incubadora a 37 graus amb un 5 per cent de CO2 i un 20 per cent d'atmosfera d'Oz i cultivada. a 5 passatges in vitro abans de ser utilitzats per aïllar el seu secretoma.

4.2.Avaluació Bioquímica del Metabolisme del hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) es van utilitzar cèl·lules per a cada experiment. Per avaluar la respiració basal, els hAFS es van permeabilitzar amb 0,03 mg/ml digitonina durant 10 min i es van suspendre en solució salina tampó fosfat (PBS). Es van afegir 10 mM de piruvat més 5 mM de malat o 20 mM de succinat per estimular el camí. -maneres compostes pels Complexes I, II i IV o Complexos Ⅱ i IV, respectivament [60].

Per avaluar les contribucions relatives a la respiració de la glutamina, l'oxidació d'àcids grassos de cadena llarga i la glucosa, després de la permeabilització de la digitonina, les cèl·lules es van suspendre en un medi de creixement i 4 uM de BPTES, 4 uM d'Etomoxir i 4 uM de UK5{{22} }99 es van afegir per inhibir la glutaminasa, la carnitina palmitoil-transferasa 1A (CPT1A) o el portador de piruvat mitocondrial (MPC), respectivament. L'activitat de la Fi-F.ATP sintasa (ATP sintasa) es va detectar mesurant la producció d'ATP pel mètode de luciferina/luciferasa altament sensible. Els assajos es van realitzar a 37 graus, durant 2 minuts, i les dades es van recollir cada 30 s. En un primer conjunt d'experiments, es van incubar cèl·lules d'10 grau durant 10 min en un medi que contenia 50mM de KCl, 1mMEGTA, 2mMEDTA, 5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain, 1mM P1P{26}Di (adenosina-5')pentafosfat, 0,040 mg/ml d'ampicil·lina i Tris-HCl 10 mM pH 7,4. Després, es va induir la síntesi d'ATP mitjançant l'addició dels substrats respiratoris (piruvat 10 mM més malat 5 mM o succinat 20 mM) i ADP 0, 1 mM. La reacció es va mesurar utilitzant el kit d'assaig de bioluminescència ATP de luciferina/luciferasa CLSII (Roche, Basilea, Suïssa) en un lumiòmetre (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milà, Itàlia) solucions estàndard d'ATP (Roche, Basilea, Suïssa) de {{ 42}}/M es van utilitzar per al calibratge. En el segon conjunt d'experiments, es va avaluar la síntesi d'ATP en presència de 4 uM de BPTES, 4 uM d'Etomoxir o 4 uM de UK5099. En aquest cas, 10 cèl·lules es van incubar durant 10 min en un medi de creixement en absència o presència d'un inhibidor del metabolisme i la síntesi d'ATP es va induir amb ADP 0, 1 mM. L'eficiència d'OxPhos (fosforilació oxidativa) (proporció P/O) es va calcular com la relació entre la concentració d'ATP produït i la quantitat d'oxigen consumit en presència de substrat respiratori i ADP. Quan el consum d'oxigen es dedica completament a la producció d'energia, la relació P/O hauria de ser aproximadament 2,5 i 1,5 després de l'addició de piruvat més malat o succinat, respectivament [48] Per avaluar la contribució de la glucòlisi anaeròbica al metabolisme de hAFS, es van avaluar les concentracions de glucosa i lactat. en el medi de creixement. El consum de glucosa es va avaluar mitjançant el sistema d'acoblament de l'hexoquinasa (HK) i la glucosa-6-fosfat deshidrogenasa (G6PD), després de la reducció de NADP a 340 nm. El medi d'assaig contenia 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM d'ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU d'hexocinasa i 2 UI de glucosa-6-fosfat deshidrogenasa. L'alliberament de lactat es va analitzar després de la reducció de NAD més a 340 nm. El medi d'assaig contenia 100 mM de Tris-HCl (pH8), 5 mM de NAD més i 1 UI/mL de lactat deshidrogenasa. Les mostres es van analitzar abans i després de l'addició de 4 ug de lactat deshidrogenasa purificada. En ambdós casos, les dades es van normalitzar al nombre de cèl·lules i es van expressar com a glucosa mM/cèl·lules de 10 graus o mM lactat alliberat/cèl·lules de 10 graus, respectivament[107].

4.3.Citometria de flux Caracterització de hAFS

Cent mil (105) cèl·lules fetals i p-hAFS es van separar i incubar amb CD107a-Alexa Fluor 647-anti-humà de ratolí i CD146-FITC-anti-humà. anticossos conjugats (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia). L'apoptosi cel·lular es va avaluar mitjançant un kit de detecció d'apoptosi FITC Annexin V (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Itàlia) seguint les instruccions del fabricant. Els esdeveniments es van adquirir en un classificador i analitzador BD Bioscience FACS Aria II, equipat amb el programari FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milà, Itàlia). Les dades es van analitzar mitjançant el programari FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milà). , Itàlia). 4.4.Tinció de senescència

El fenotip de senescència de hAFS cultivat fins al pas 5 en condicions estàndard in vitro es va avaluar amb Senescence -Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA): f-hand p-hAFS es va fixar amb una solució fixadora al 70 per cent. confluència i tenyit per SA- -gal a 37 graus durant la nit, segons les instruccions del fabricant. Els esdeveniments senescents es van adquirir en un microscopi Leica DMil (equipat amb el programari Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milà, Itàlia) i es van avaluar com a percentatge de cèl·lules positives SA- -gal sobre el total de cèl·lules per camp.

4.5. Separació i concentració de les fraccions del secretoma hAFS

f-hAFS i p-hAFS es van cultivar durant 24 hores en medi sense sèrum (SF) en un 1% d'hipòxia d'O2 versus un 20% de normòxia d'O2 (control), l'últim dels quals es va utilitzar com a referència de referència. Aquesta estratègia de precondicionament es va utilitzar per millorar l'alliberament de factors paracrins bioactius, tal com vam informar anteriorment [34,35,37,49]. Els hAFS es van cultivar durant 24 hores en medi sense sèrum (SF) (medi d'àguila modificat de Dulbecco d'alta glucosa, DMEM, amb un 1% de L-glutamina i un 1% de penicil·lina/estreptomicina, tots de Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia), sota norma normòxica. (20 per cent d'O2 i 5 per cent de CO2 a 37 graus) o hipòxiques (1 per cent d'O2 i 5 per cent de CO2 a 37 graus a les incubadores de CO2 CellXpert C170i i Galaxy 48R, d'Eppendorf, Milà, Itàlia).

Es van recollir f-hAFS-CM i p-hAFS-CM i es van centrifugar a 4 graus a 300x g durant 10 min i 2000x g durant 20 min per eliminar les restes cel·lulars; hAFS-CM es va concentrar mitjançant membranes d'ultrafiltració amb un tall selectiu de 3 kDa (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Alemanya) a 4 graus a 3000 × g durant 90 min i després es va concentrar més a 4 grau a 3000× g durant 30 min. Els hAFS-EV es van separar i concentrar mitjançant ultracentrifugació en sèrie a partir d'hAFS-CM. Breument, es va recollir hAFS-CM i es va centrifugar a 4 graus a 300 × g durant 10 min i 2000 × g durant 20 min per eliminar les restes cel·lulars. A continuació, el sobrenedant es va processar a 10.000 × g durant 40 min. El pellet es va descartar i el sobrenedant es va processar posteriorment mitjançant ultracentrifugació en un Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milà, Itàlia) a 10.000 × g durant 120 min utilitzant els rotors de centrífuga SW55Ti de galleda oscil·lant de Beckman Coulter. El pellet que contenia hAFS-EV heterogenis es va rentar en PBS amb centrifugació final a 100.000 × g durant 120 min i després es va tornar a suspendre en PBS filtrat amb una membrana de filtre de porus de 0,22 um. Les concentracions de proteïnes en hAFS-CM i a la superfície dels hAFS-EV es van mesurar mitjançant l'assaig d'àcid bicinchonínic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia). Les mostres es van adquirir en un lector de microplaques Gen5 a 570 nm per avaluar el rendiment de hAFS-CM i hAFS-EV en termes d'ug de cèl·lules productores de solució/10 graus.

4.6. Caracterització dels hAFS-EV mitjançant microscòpia electrònica de transmissió i anàlisi de seguiment de nanopartícules

L'anàlisi de microscòpia electrònica de transmissió (TEM) es va realitzar en un microscopi Hitachi TEM (sèrie HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Itàlia). Les imatges digitals es van prendre amb una càmera Mega view 3 i el programari Radius (EMSIS, Muenster, Alemanya). f-hAFS i p-hAFS es van fixar en una solució de paraformaldehid (PA) al 3,7 per cent diluïda 1:1 amb medi complet hAFS, es van rentar en tampó de cacodilat 0.1 M i es van incubar immediatament durant 1 h a temperatura ambient a Tampó de cacodilat 0,1 M que conté un 2,5 per cent de glutaraldehid (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, EUA). Els pellets de cèl·lules es van fixar posteriorment en tetròxid d'osmi durant 1 h i en una solució d'acetat d'uranil a l'1 per cent durant 1 h. Les mostres es van deshidratar durant 24 h a 42 graus i 48 h a 60 graus mitjançant una sèrie d'etanol graduat i es van incrustar en resina epoxi (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Alemanya). Les seccions ultrafines (50 nm) es van tallar amb un micròtom Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milà, Itàlia) i es van tacar amb un 5% d'acetat d'uranil en una solució d'etanol al 50%. Els f-hAFS-EV i els p-hAFS-EV es van tornar a suspendre en una solució de PBS de 20 uL i es van fixar afegint un volum igual de paraformaldehid al 2 per cent en una solució tampó fosfat 0, 1 M (pH7, 4). Aleshores, els EV es van adsorbir durant 10 min sobre reixetes de coure recobertes de carboni de formvar fent flotar les reixetes sobre gotes de 5 μL sobre parafilm. Posteriorment, les reixetes amb EV adherides es van esbandir amb PBS i es van tacar negativament amb una solució d'acetat d'uranil al 2% durant 5 min a temperatura ambient. Les reixetes tacades es van incrustar en metilcel·lulosa al 2,5 per cent per a una millor conservació i es van assecar a l'aire abans de l'examen. L'anàlisi de morfometria dels hAFS-EV es va mesurar en 10 micrografies preses aleatòriament amb un augment de 40. 000 x g. La mida es va calcular mitjançant la funció de línia arbitrària incrustada al quadre de diàleg de mesura del programari Radius (EMSIS, Muenster Alemanya). Per visualitzar la distribució de la mida dels hAFS-EV, els resultats es van representar com a gràfic de punts de dispersió i com a distribució de freqüència en la qual cada mida es representa com un punt juntament amb línies per al valor mitjà i l'interval.

Els f-hAFS-EV i els p-hAFS-EV també es van analitzar mitjançant l'anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA) per avaluar les partícules alliberades per cèl·lules de 10 graus. Els hAFS-EV es van diluir 1:100 en solució de PBS i es van adquirir en un NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Regne Unit) que va registrar almenys 3 fotogrames diferents de 60 s cadascun. Es van analitzar tres adquisicions diferents de cada mostra mitjançant l'opció de procés per lots del programari. 4.7.LC-MS/MS Anàlisi de hAFS-CM i hAFS-EVs 4.7.1.Digestió en solució

L'anàlisi proteòmica es va realitzar en 3 rèpliques biològiques de hAFS-CM i hAFS. EVs de f-hAFS i p-hAFS després d'un precondicionament normoxic o hipòxic (n=24 condicions diferents). Les mostres de hAFS-CM i hAFS-EVs es van suspendre en 0.1M NHCO3 pH 7,9 i es van tractar amb RapigestIM Reactiu SF (Waters Co, Milford, MA, EUA) a la concentració final de 0,25 per cent (p/v). Les suspensions resultants es van incubar mentre s'agitaven a 100 grau durant 2{{40}} min. La digestió es va dur a terme a cada mostra afegint tripsina modificada de grau de seqüenciació (Promega Inc, Madison, WI, EUA) a una relació enzim/substrat d'1:50 (p/p) durant la nit a 37 graus en NH4HCO3 0,1 M pH 7,9. tampó amb un 10 per cent de CHSCN. Al matí es va afegir una alíquota addicional de tripsina (1:100 p/p) i la digestió va continuar durant 4 h. A més, l'addició d'àcid trifluoroacètic (TFA) al 0,5% Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, EUA) va aturar la reacció enzimàtica i una incubació posterior a 37 graus durant 45 min va completar la hidròlisi àcida de RapiGest [108]. Els productes de degradació no miscibles amb aigua es van eliminar per centrifugació a 13.000 rpm durant 10 min. Finalment, les mescles de digestió tríptica es van dessalar mitjançant columnes de spin PierceTM C-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia), segons el protocol del fabricant, i es van tornar a suspendre en àcid fòrmic al 0,1 per cent (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EUA) en aigua (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, EUA) a una concentració de 0,1 ug/μL.

4.7.2.Cromatografia de líquids

Les mescles digerides amb tripsina es van analitzar mitjançant una plataforma formada per un sistema cromatogràfic nanolíquid, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, part d'AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, EUA) configurat en mode trampa-elució, combinat amb un espectròmetre de masses d'alta resolució. Breument, les mostres (0,8 ug injectades) es van carregar primer en una trampa de pèptids (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) i es renta amb la bomba de càrrega funcionant en mode isocràtic amb un 0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua durant 10 min a un cabal de 3 μL/min. Després, la commutació automàtica d'una vàlvula de deu ports va eluir la barreja atrapada en una columna de fase nano-invertida (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) a través d'un gradient de 150 min d'eluent B (eluent A, 0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua; eluent B, 0,1 per cent d'àcid fòrmic en acetonitril) a un cabal de 300 nL/min. En profunditat, el gradient va ser: des del 5-10 per cent Bin 3min,10-40 per cent Bin 130min,40-95 percent Bin 10 min i mantenint-se al 95 per cent B durant 7 min. 4.7.3.Espectrometria de masses

Les anàlisis de MS/MS es van realitzar en un espectròmetre de masses LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia) equipat amb una font d'ions nanospray. La tensió capil·lar de polvorització es va establir a 1,7 kV i la temperatura capil·lar de transferència d'ions es va mantenir a 220 graus. Es van registrar espectres MS complets en un rang 400-1600 m/z en mode d'ions positius, amb un poder de resolució de 60.000 (amplada total a la meitat màxima) i una velocitat d'exploració de 2 espectres/s. Aquest pas va ser seguit per cinc esdeveniments MS/MS de baixa resolució que es van generar seqüencialment de manera seqüencial depenent de les dades sobre els cinc ions principals seleccionats de l'espectre complet de MS (a un 35 per cent d'energia de col·lisió), utilitzant l'exclusió dinàmica de 0,5 min per Anàlisi MS/MS. Les funcions d'escaneig de l'espectròmetre de masses i els gradients de dissolvents de cromatografia líquida d'alt rendiment es van controlar mitjançant la versió 1.4 del sistema de dades Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia).

4.7.4.Processament proteòmic de dades i mineria de dades

Totes les dades generades es van cercar mitjançant el motor de cerca Sequest HT contingut al programari Thermo Scientific Proteome Discoverer, versió 2.1. Els espectres experimentals de MS/MS es van correlacionar amb seqüències de pèptids tríptics en comparació amb els espectres de masses teòrics obtinguts per digestió in silico de la base de dades de proteoma Uniprot Homo Sapiens (746 00 entrades), descarregada el 2 de gener. 020 (www.uniprot.org, consultat l'10 2 de març021). Es van utilitzar els criteris següents per a la identificació de seqüències de pèptids i proteïnes relacionades: tripsina com a enzim, tres clivages perduts per pèptid, toleràncies de massa de ± 50 ppm per als ions precursors i ± 0, 8 Da per als ions de fragment. El node de percolador es va utilitzar amb una estratègia de descoberta objectiu per donar una taxa final de descobriment fals (FDR) a un nivell de coincidència d'espectre de pèptids (PSM) de 0,01 (estricte) basat en valors q, tenint en compte un deltaCN màxim de 0,05 [109]. Només es van considerar pèptids amb una longitud mínima del pèptid de sis aminoàcids i rang1. Es van aplicar els principis estrictes d'agrupació de proteïnes i de parsimònia. Les dades de MS s'han dipositat al ProteomeXchange Consortium a través del dipòsit associat PRIDE [10] (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, consultat el 10 de març de 2021) Les 48 proteïnes obtingudes de l'algoritme SEQUEST es van alinear, normalitzar , i en comparació sense etiquetes. Per a aquest objectiu es va utilitzar un algorisme intern, és a dir, el Mapa de proteïnes de l'algoritme multidimensional (MAProMa), utilitzant les coincidències d'espectre peptídic mitjà (aPSM) [111,112] que corresponen a la mitjana de tots els espectres identificats per a una proteïna i, en conseqüència, , a la seva abundància relativa, en cada condició analitzada. En profunditat, per seleccionar proteïnes expressades de manera diferent, es van comparar per parelles subgrups (tant per a hAFS-CM fetal i perinatal com per a hAFS-EV, tenint en compte també l'estimulació del precondicionament de cèl·lules hipòxiques), aplicant un llindar de 0, 4 i 5 als dos MAProMa. índexs DAve (mitjana diferencial) i DCI (índex de confiança diferencial), respectivament. DAve, que avalua els canvis en l'expressió de proteïnes, es va definir com (XY)/(X＋Y)/0,5, mentre que DCI que avalua la confiança de l'expressió diferencial, es va definir com (X més Y)×(XY)/2 X i Y Els termes representen el PSM d'una proteïna determinada en dues mostres comparades. A més, les llistes de proteïnes mitjanes, obtingudes de cada condició examinada, es van sotmetre a una anàlisi discriminant lineal (LDA) i les proteïnes amb la proporció F més gran (més o igual a 4,5) i el valor p més petit (menys o igual a 0,001) es van retenir i processar mitjançant agrupació jeràrquica, aplicant el mètode de Ward i la mètrica de distància d'Euclidean mitjançant el programari JMP 15.2. Concretament, la relació F representava el quadrat mitjà del model dividit pel quadrat mitjà de l'error, mentre que el valor p indicava la probabilitat d'obtenir un valor F superior al calculat si, en realitat, no hi havia diferència entre les mitjanes del grup de població. 4.8. Perfil de citocines i quimiocines de hAFS-CM i have-EVs

El perfil de citocines i quimiocines de hAFS-CM i have-EV obtinguts per f-hAFS i p-hAFS després del precondicionament hipòxic es va avaluar mitjançant el kit Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (R&D System, Minneapolis, MN, EUA) segons el instruccions del fabricant. Es van utilitzar vint ug de les mostres hAFS-CM i hAFS-EVs. Les imatges de membranes van ser adquirides per un Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, Regne Unit). El contingut específic de citocines/quimiocines es va avaluar mitjançant la quantificació de la intensitat de píxels positius (mitjançant la unitat arbitrària) per a cada citocina detectable mitjançant el programari ImageJ (disponible a https: //imagej.nih.gov/ij/, consultat el 10 de març de 2021 [13]). 4.9. Extracció d'ARN de hAFS-EV i Next

Seqüenciació de generacions

L'ARN es va aïllar de f-hAFS-EV i p-have-EV amb miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milà, Itàlia) segons les instruccions del fabricant. La integritat i la distribució de la mida de l'ARN es van avaluar mitjançant el kit Agilent Small RNA amb el petit xip d'ARN no codificant per tal d'avaluar el contingut d'ARN petits que oscil·laven entre 6 i 150 nucleòtids (nt). El kit d'assaig de microRNA Qubit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itàlia) es va utilitzar per quantificar el contingut de microRNA (miRNA), seguint les instruccions del fabricant. Les biblioteques de seqüenciació de miRNA es van preparar i amplificar mitjançant el kit QIAseq miRNA Library (Qiagen, Milà, Itàlia) utilitzant 18,5 ng de miRNAs aïllats com a entrada i seguint les instruccions del fabricant. Les biblioteques es van agrupar després de fer una comprovació de qualitat i una quantificació per part de TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, EUA) mitjançant Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Les biblioteques agrupades es van avaluar per al control de qualitat mitjançant qPCR en temps real seguint la guia "Sequencing Library qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, EUA) i seqüenciades per la plataforma Illumina NextSeq mitjançant High Output Hit v2.5 (75 cicles) ( Illumina Inc, San Diego, CA, EUA). La trucada base es va realitzar amb el flux de treball predeterminat d'Illumina NextSeq500.

4.10.Anàlisi de dades bioinformàtiques de la seqüenciació de miRNA

Els fitxers Fastq es van processar primer retallant l'adaptador de 3' i les bases de baixa qualitat mitjançant Cutadapt [114]. Després del retall, es van identificar les seqüències d'inserció i les seqüències UMI. Es van descartar les lectures sense seqüència d'adaptador, les lectures amb seqüències d'inserció de menys de 16 pb i les lectures amb seqüències UMI de menys de 10 pb. Per anotar les seqüències d'inserció, les lectures es van alinear al conjunt del genoma humà GRCh38 mitjançant Bowtie [15] Per a cada mostra es van comptar totes les lectures assignades a un miRNA particular i es van agregar les UMI associades per comptar molècules úniques. L'anàlisi secundària es va realitzar mitjançant scripts R personalitzats disponibles a petició raonable. L'anàlisi d'enriquiment diferencial es va realitzar mitjançant paquets Limma [116] i EdgeR Bioconductor [117].

4.11. Anàlisis estadístics

Els resultats es presenten com a mitjana ±sem d'almenys tres (n{{0}})experiments independents. Les comparacions es van fer mitjançant ANOVA unidireccional seguida de la prova de comparacions múltiples de Tukey posthoc o de la prova t de Student. Les anàlisis es van realitzar mitjançant Graph-Pad Prism versió 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, consultat el 10 de març de 2021) amb una significació estadística fixada a* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

En conclusió, l'hAFS fetal i perinatal es va trobar fenotípicament equivalent amb una potència secretora comparable i un enriquiment d'EV en mida i distribució; no obstant això, es podrien apreciar algunes distincions en el seu perfil de secretoma. Concretament, el perfil de desenvolupament immadur de l'hAFS fetal es pot recapitular per les seves formulacions de secretoma dotades d'un secretoma pro-vasculogènic, pro-regeneratiu i rejovenidor més pronunciat. Tanmateix, els hAFS perinatals encara conserven un perfil paracrí rellevant mitjançant l'expressió de factors relacionats amb la migració de cèl·lules endotelials, un potencial immunomodulador, antiinflamatori i neurotròfic similar al hAFS fetal. Aquestes troballes poden proporcionar coneixements útils que donen suport a una futura teràpia paracrina de la malaltia relacionada amb lesions i la inflamació/isquèmica. Per tant, la selecció d'hAFS fetal o perinatal com a font cel·lular més ideal s'hauria d'avaluar tenint en compte l'escenari clínic específic.

Aquest article està extret de Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms