Dos triterpenoides de les fulles de Rubus Fraxinifolius i les seves activitats inhibidores de tirosinasa i elastasa

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

S'han aïllat nombrosos compostos terapèutics de recursos orgànics naturalment abundants, que poden oferir fonts econòmiques i sostenibles de compostos amb activitats biològiques segures i eficaços. A la indústria cosmètica, es busquen amb entusiasme compostos naturals amb activitats anti-envelliment. Així, vam preparar diversos extractes de fulles de Rubusfraxinifolius i vam utilitzar assajos d'inhibició enzimàtica per aïllar compostos amb efectes protectors contra l'envelliment de la pell. Es van aïllar dos triterpenoides de Rubus fraxinifolius Poir. fulles. Les estructures es van caracteritzar mitjançant anàlisis espectroscòpiques (LC-ESI-MS, 1D/2D RMN) i comparació amb les dades informades. Els compostos 1 i 2 es van determinar com 2,3-O-etilenglicol,19-hidroxiurs-12-en-23,28-àcid dioic i 2,{{15} }O-propandiol,19-hidroxiurs-12-en-28-àcid oic. L'extracte de metanol i els aïllats es van avaluar pels seus efectes inhibidors sobre l'elastasa i la tirosinasa. Els compostos 1 i 2 van inhibir l'elastasa amb ICso 122,199 ug/mL i 98,22 ug/mL, i també van inhibir la tirosinasa amb ICso 207,79 ug/exèrcit i 221,51 ug/mL, respectivament. L'acoblament molecular va demostrar que ambdós compostos tenen afinitats cap als enzims.

Feu clic aquí per saber-ne més

Tot i que és difícil d'aconseguir, les substàncies naturals antienvelliment que són segures per als humans es poden collir de manera econòmica i sostenible d'abundants recursos naturals. Unes 700 espècies de Rubus (Rosaceae) es distribueixen a tot el món, tot i que es troben poques espècies als tròpics. Aquest gènere conté nutrients (sucre, vitamines, etc.), metabòlits secundaris (triterpenoides, flavonoides, polifenols, etc.) i té moltes activitats anti-envelliment (antioxidant, formiga elastasa, formiga tirosinasa, anti-colagenasa, anti-UV, antiinflamatòria, cicatrització de ferides, etc.)1. A més, les espècies de Rubus també van informar que contenien diversos triterpens amb diverses activitats biològiques -'.

A Indonèsia, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) es distribueix a Java, Borneo, etc., i es coneix popularment com "urban".què és el cistancheA més, alguns agricultors locals cullen aquestes plantes, i la fruita de la baia se sol consumir fresca o congelada. El nostre estudi anterior va demostrar que l'extracte de tija de R. frascinifolius té l'activitat d'inhibir l'elastasa, la tirosinasa i com a antioxidant8. Algunes altres investigacions també van demostrar que la fulla i el fruit de R. fraxinifolius tenen una potent activitat antioxidant?10.No obstant això, l'estudi de R. fraxinifolius ha estat poc investigat i no s'han informat estudis de components químics.

Cistanche pot anti-envelliment

L'elastasa és un enzim serina proteasa, que té un paper crucial en l'arrugues o flacciditat de la pell a través de la degradació de la fibra elàstica dèrmica (elastina) i provoca la pèrdua d'elasticitat de la pell. Un d'ells és l'elastasa derivada dels fibroblasts de la pell. Així, com a moderadors de la degradació de la fibra d'elastina que provoca l'envelliment de la pell, els inhibidors de l'elastasa han cridat l'atenció com a agents per a preparats cosmètics,12. La melanogènesi està mediada per la tirosinasa i regula la biosíntesi de melanina mitjançant una reacció en dues etapes. En el pas inicial, la L-tirosina s'hidroxila a L-3,{4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). En el segon pas, la L-DOPA s'oxida a la O-quinona corresponent. Per tant, els compostos naturals amb activitat inhibidora de la tirosinasa s'utilitzen habitualment en cosmètics que inhibeixen la hiperpigmentació amb melanina i, per tant, afavoreixen el blanquejament de la pell.Cistanche anti-envellimentEls inhibidors de l'elastasa i l'enzim tirosinasa es podrien desenvolupar com a agents blanquejadors de la pell, antienvelliment o antiarrugues per tractar trastorns dermatològics44.

Aquest estudi va aïllar els triterpenoides d'ursà de les fulles de R.fraxinifolius i va dilucidar les seves estructures en anàlisis espectroscòpiques mitjançant espectroscòpia de masses d'ionització electrospray (ESI-MS) i 'H RMN, |3CNMR i 2D RMN (DEPT, HSQC, HMQC i HMBC). Posteriorment, vam realitzar assajos d'activitats inhibidores d'elastasa i tirosinasa d'extractes, fraccions i compostos aïllats en brut.

L'activitat de dos compostos seleccionats també es va observar mitjançant el mètode in silico en aquesta investigació. Es va realitzar un enfocament d'acoblament molecular amb DockThorl516. Les macromolècules utilitzades en aquesta investigació es van obtenir del banc de dades de proteïnes (RCSB PDB, 2000) amb identitats 2y9x i 3hgp per a tirosinasa i elastasa, respectivament l718. Les macromolècules es van optimitzar a UCSF Quimera i els resultats de l'acoblament molecular. es van observar amb PyMOL1920.

Resultats i discussió

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 per cent en 100 ug/mL, mentre que l'extracte de n-hexà no tenia activitat (Fig. 1). Alguns Rubus també van mostrar activitat inhibidora de l'elastasa com R. Sanctus (percentatge d'inhibició 14.68-49.20 en 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus, etc.221. Per tant, vam fraccionar els extractes actius mitjançant cromatografia líquida al buit/VLC i vam recollir totes les fraccions de cadascuna. Les fraccions de l'extracte d'acetat d'etil van mostrar activitats inhibidores de l'elastasa febles (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Els aïllats es van identificar i caracteritzar mitjançant cromatografia líquida-espectroscòpia de masses (LCMS), 'H i 13CNMR, DEPT, coherència quàntica única heteronuclear (HSQC), correlació quàntica múltiple heteronuclear (HMQC) i correlació d'enllaços múltiples heteronuclears (HMBC). La taula 1 mostra les dades espectrals de RMN dels compostos.

Compost 1: es va aïllar com una pols blanca amorfa. Els espectres LCMS-ESI d'aquest compost mostraven un pic d'ions moleculars a m/z 543,32[MH]t, suggerint la fórmula molecular C32H48O- amb nou equivalents d'insaturació. Els espectres IR van revelar màxims d'absorció corresponents a hidroxil (3,343,4 cm-l) i Grups funcionals olefínics (1,684 cm-1). A més, els espectres de RMN H del compost I van revelar un protó de metina (CH) un senyal singlet de 2,6, un senyal característic per a l'H-18 de tipus ursà. triterpens amb 19-substitucions O. El tipus de triterpè 19a-hidroxi-ursà també té un senyal típic de protons a l'àrea al voltant de 2,6 ppm. Aquest senyal desprotegit pot diferir notablement d'altres senyals de protons de metilè ordinals, amb un desplaçament característic a causa d'un protó olefínic (H12) a 5,28 (t, J=6Hz).cistanche benefíciosLes assignacions completes i inequívoques de canvi químic H i l3C van ser assistides pels espectres HMQC (13Cx'H) i HMBC (15Cx'H). A partir del pic creuat HMBC, el protó a ou 2,60 es va confirmar que era H{ {5}}(Fig.2a). Es van trobar altres caràcters específics per als cinc singlets de metil a 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20 (cadascun, H{24-27;29), un doblet de metil a og 0,92 (d, J=6 Hz) i el senyal de protons olefínics a 5,30 (t, J=7 Hz, H-12). Els espectres 13CNMR actuals mostren 32 ressonàncies de carboni, i amb els espectres DEPT i HMQC, van mostrar dos carbonis carbonílics (δC183.70,C-28 i 8-178.96,C{-23), un carboni olefínic. a oc 127,23,C-12,un carboni quaternari olefínic (oc139,49,C-13),un carboni quaternari que porta oxigen （o-72,7, C-19 ）, deu metilens alifàtics i sis carbonis metil. Els dos carbonis olefínics a δ-127,23（C-12） i 139,49 (C-13) eren característics del tipus ursà-triterpenoide. Un altre senyal va indicar la presència d'etilenglicol （-OCH-CH-O-） a senyals a δ4,62（d, J=11,5 Hz）, 4,05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）i 4.06（d, J{=11.5Hz）i suportat amb δ61.27（t） i 63.20（t）. Es trobava a C-2iC-3 basat en la presència de correlació de llarg abast en l'espectre HMBC. Per tant, el compost 1 es va identificar com a àcid 2,3-O-etilenglicol,19-hidroxiurs-12-en{-23,28-dioic (figura 3a).

Compost 2: es va obtenir com una pols amorfa blanca. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (calc. per a 528,3815). En els espectres LCMS-ESI, hi ha un pic d'ions moleculars a m/z 527,33 [MH]t, que indica la fórmula molecular CH Os, que requeria 8 graus d'insaturació". {15}}) i grups funcionals olefínics (1.686 cm-1). A més, els espectres HNMR del compost 2 van mostrar un singlet de 2,42, que és característic de l'H18 d'un triterpè de tipus ursà amb {{24} }}O-substitució.Extracte de Cistanche Anti RadiacióAltres espectres característics específics van incloure la presència de sis singlets de metil a og1.22 0.76,0.97,0.69,1.3{0i 1.17 (cadascun, H -24-28,H{-30), un doblet de metil a 0,91 (d,J{=7Hz), i el senyal de protons olefínics a ou 5,37 (d, J{=7 Hz, H-12). L3 corresponents (els espectres CNMR i DEPT mostren 33 ressonàncies de carboni, i els espectres HSQC i HMQC indiquen la presència d'un carboni carbonílic (oc 182,23, C-28), un carboni olefínic （δ-129.36, C -12）, un carboni quaternari olefínic （δ-140,24, C{-13）, un carboni quaternari que porta oxigen (oc73,68, C-19), onze alifàtics metilè i set carbonis metil. Aquestes dades van indicar que el compost 2 porta un esquelet ursà-triterpenoide. Els altres senyals indiquen la presència del grup funcional 1,3-propandiol, a og 3,22(d,J=11 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10,5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) i 4,02 (d, J{=11,5 Hz) i 3,36 (t, J{ {57}},5 Hz). El seu grup funcional té una correlació a llarg abast amb C2-C3. A partir d'aquests resultats, el compost 2 es va identificar així com 2,3-O-propanediol,{{ 66}}hidroxiurs-12-en-28-àcid oic (Figs. 2b i 3b). Un compost similar és l'àcid 2,3-O-isopropilidè turmenta, aïllat de Rubus xanthocarpus.7

A la taula 1, es van comparar tots els espectres de RMN "H i "C amb l'àcid de turments (TA/2a,3a,19-trihidroxi-12-ursen-28-àcid oic)², que és un ursà triterpenoide que s'ha trobat en diverses espècies de Rubus-p L'àcid tormentic tenia fortes similituds amb els compostos 1 i 2, excepte que els desplaçaments químics relacionats amb C-23 i C{31-33 van ser diferents. Aquesta part també es va confirmar a Experiments DEPT, HMQC i HMBC (Fig.2).

L'àcid triterpenoide turmenta es troba àmpliament distribuït en els aliments vegetals naturals. Té diverses bioactivitats: efectes hipoglucèmics, propietats antiinflamatòries i antiaterogèniques que redueixen la proliferació de cèl·lules musculars llises vasculars i activitats antiproliferatives en línies cel·lulars de càncer renal, de pròstata i de melanoma2426. Per tant, com que aquests compostos tenen el mateix esquelet, no tenen possibles activitats potencials adequades.

La figura 4 representa l'activitat inhibidora de l'elastasa i la tirosinasa dels aïllats. Les dades obtingudes dels assajos d'inhibició enzimàtica in vitro es van expressar com a desviació estàndard (SD). Els compostos 1 i 2 van inhibir l'elastasa amb ICso 122,199 i 98,22 ug/mL, i també van inhibir la tirosinasa amb ICso 207,79 i 221,51 ug/mL, respectivament. Alguns triterpenoides pentacíclics (àcid ursòlic i àcid oleanòlic) van informar que tenien activitat inhibidora de l'elastasa2728. El valor d'inhibició de l'elastasa també del compost 2 és inferior al del compost 1. Tots dos compostos tenien una menor activitat d'inhibició que l'àcid oleanòlic de control positiu, que tenia un valor ICso de 90,39 ug/mL. D'acord, estudis anteriors van mostrar un ICso per a l'àcid oleanòlic de 76,5 ug/mL i un valor ICso de 31,0 ug/ml per a l'àcid ursòlic28. Les anàlisis cinètiques informades anteriorment de triterpens pentacíclics van demostrar que aquests compostos inhibeixen de manera competitiva i reversible l'elastasa dels neutròfils. En el mateix estudi, els experiments d'acoblament molecular van demostrar que la part molecular 28-COOH i els dobles enllaços dels triterpens pentacíclics són essencials per a les seves activitats inhibidores.

Un dels problemes que sorgeixen amb l'edat és la hiperpigmentació.cistanche herbaPer tant, hi ha una recerca contínua d'agents per aclarir la pell o nous despigmentants. La supressió de la tirosinasa pot actuar contra la melanogènesi". Com es mostra a la Fig.4, l'extracte de metanol i els compostos I i 2 van demostrar activitats moderades com a inhibidors de la tirosinasa.

En aquesta investigació, també es va utilitzar l'acoblament molecular per analitzar les activitats d'unió de compostos seleccionats a la tirosinasa i l'elastasa com a objectius. Les estructures de cristall utilitzades van ser 2Y9X, una estructura cristal·lina de tirosinasa d'Agaricus bisporus amb tropolone inhibidor; i BHGP, una estructura cristal·lina d'elastasa pancreàtica porcina complexada amb un potent inhibidor de peptidil FR130180. Tots dos es van seleccionar perquè es van obtenir del mateix organisme utilitzat per a l'assaig in vitro d'aquesta investigació. Les macromolècules també s'uneixen als seus respectius inhibidors de manera que es pugui obtenir l'estat actiu de les conformacions enzimàtiques. Els cocristalls es van utilitzar com a centre de l'objectiu d'acoblament molecular per reduir les probabilitats d'unió del compost perquè el procés de puntuació sigui més eficient.

A partir de l'acoblament molecular, es van obtenir afinitats d'unió mitjanes per als dos compostos, tal com es mostra a les figures 5 i 6. La predicció d'afinitat s'utilitza per classificar diferents lligands tenint en compte la posició energètica superior de cada compost, una predicció d'una millor posició energètica es mostra mitjançant puntuacions d'afinitats d'enllaç més baixes16. El redocking de la tropolona inhibidora designada es va fer amb afinitats d'unió mitjanes de -7,41 kcal/mol. Les afinitats d'unió mitjanes dels compostos 1 i 2 a la tirosinasa eren de -7,84 kcal/mol i -8,37 kcal/mol, respectivament (taula 2). Es va predir que tots dos compostos tenien una millor afinitat que l'inhibidor.

Mentrestant, la mitjana d'afinitats d'unió de l'elastaseredocking va ser de -7,84 kcal/mol. Les afinitats d'unió mitjanes dels compostos 1 i 2 a l'elastasa eren de -7,58 kcal/mol i de -8,06 kcal/mol, respectivament. Tot i que el resultat va mostrar que el compost 1 té afinitats més baixes que el cocristall, és lleugerament diferent (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Mètodes

Procediments experimentals generals. Els espectres de RMN 'H i ' es van registrar a 500 MHz mitjançant un instrument JEOL JNM-ECZ500R/S1. Els espectres d'infrarojos (IR) es van mesurar amb un FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Altres anàlisis es van realitzar amb un instrument Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, un lector de microplaques VersaMax i un lector de microplaques BioTek ELX800, làmines d'alumini recobertes de tradició TLC-gel de sílice 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Alemanya) , la cromatografia en columna (CC) es va realitzar amb gel de sílice 60 (Merck, Darmstadt, Alemanya) amb malla 70-230 per a cromatografia oberta i malla 230-400 per cromatografia al buit. Materials vegetals. Les fulles de R. fraxinifolius es van recollir d'una àrea de plantació al mont Pangrango, Java occidental a una alçada de 4.343 peus, el desembre de 2018. L'exemplar va ser identificat per un botànic (Dr. Joni Setijo) al Centre de Recerca de Biologia de l'Institut d'Indonèsia de Sciences, Indonèsia, amb el número d'exemplar 033/IPH.1.01/If.07.La recollida de material vegetal havia rebut l'autorització de l'agricultor i complia amb les normatives i directrius institucionals.

Extracció i aïllament. Les fulles en pols assecades a l'aire (2300 g) es van extreure mitjançant un aparell Soxhlet amb dissolvent de gradient (n-hexà, EtOAc i MeOH) per proporcionar els extractes respectius i després es van evaporar amb un evaporador rotatiu. i forn al buit. L'extracte de metanol (291 g) i l'extracte d'acetat d'etil (65 g) es van adsorbir al gel de sílice i es van realitzar cromatografia líquida al buit/VLC, eluint amb un gradient gradual d'EtOAc: MeOH (de 1:0 a 0:1) a produir fraccions per a cada extracte (Eal-Hall i M1-Mill i). Es van combinar fraccions similars que van tenir reaccions positives amb reactius sulfúrics de vainillina en TLC. Rendiment de fraccions: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea{7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); i M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }}(2,9 g). Totes les fraccions es van enviar per a l'activitat inhibidora de l'elastasa, Fr. M8 va donar el major rendiment i va tenir una activitat potent. Fr. M8 posteriorment repartint-se per CC sobre gel de sílice (eluent CH2Cl2/MeOH amb un gradient gradual) i purificat mitjançant la columna Sephadex LH-20 (eluint amb CHCl{3-MeOH 100:10, v/v. Dues fraccions). mostraven naturalesa sòlida i es van cristal·litzar amb cloroform i metanol per obtenir dos aïllats: el compost 1 (18 mg) i: 2 (31 mg). La puresa de tots els aïllats es va avaluar mitjançant TLC bidimensional i visualitzant la taca amb un 5% de sulfúric. àcid en metanol, seguit d'escalfament de les plaques a 110 graus durant 5 min.

Els cristalls es van identificar i caracteritzar mitjançant cromatografia líquida-espectroscòpia de masses (LCMS), LH i millora de les distorsions '3C per transferència de polarització (DEPT) RMN, coherència quàntica única heteronuclear (HSQC), correlació quàntica múltiple heteronuclear (HMQC) i heteronuclear múltiple. correlació d'enllaços (HMBC).

Assaig d'inhibició de l'elastasa. L'assaig d'inhibició de l'elastasa es va realitzar tal com es va descriure anteriorment amb algunes modificacions32. Breument, en plaques de microtitulació de pous Nunc-96, alíquotes de20-μL de 0.{8-unitats/ml EPI en tampó base de grau Trizma （pH 8.0 ） es van barrejar amb mostres de 20-μL i després es van diluir les mescles a 180 μL en tampó base de grau Trizma. Els extractes de prova es van preincubar amb l'enzim durant 15 minuts i es van afegir alíquotes de 20-μL del substrat N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (A3PVN; 2, 9 mM) i es van incubar durant 15 minuts més. El control positiu i els pous en blanc contenien àcid oleanòlic i aigua, respectivament. Els experiments es van realitzar per triplicat i es van determinar les taxes d'inhibició segons l'absorció; a 401 nm mitjançant un lector de microplaques VersaMax. El percentatge d'inhibició es va calcular mitjançant l'equació següent:

on E és l'absorbància de la reacció enzimàtica, Eb és l'absorbància del blanc d'enzim, T és l'absorbància de la mostra de prova i Tb és l'absorbància del blanc de prova. també es van determinar els valors a partir d'un gràfic lineal del percentatge d'inhibició de l'elastasa enfront de la concentració (50, 75,100,125,150 ug/mL). Assaig d'inhibició de la tirosinasa. La inhibició de la tirosinasa es va determinar mitjançant el mètode de formació de DOPA-crom tal com es va descriure anteriorment amb lleugeres modificacionsl3. Breument, en 96-plaques de pous, es van barrejar alíquotes de 20 μL de DMSO (control) o compostos de prova a diferents concentracions amb alíquotes de 40 μL de tirosinasa de bolets de 30 U/mL (Sigma Aldrich) i 100- μL de 0.1-Tampó fosfat M （pH 6,8）. Es van preincubar durant 10 minuts a temperatura ambient. Les reaccions es van iniciar mitjançant alíquotes addirg4μL de 10 mML-DOPA a cada pou i incubant a 37 graus durant 20 min. A continuació, es va determinar l'activitat de la tirosinasa mesurant l'absorbància a 475 nm. L'àcid kòjic es va utilitzar com a control positiu. Els experiments es van realitzar per triplicat. El percentatge d'inhibició de la tirosinasa es va calcular mitjançant l'equació següent:

on E és l'absorbància de la reacció enzimàtica, Eb és l'absorbància del blanc d'enzim, T és l'absorbància de la mostra de prova i Tb és l'absorbància del blanc de prova. També es van determinar els valors a partir d'un gràfic lineal del percentatge d'inhibició de l'elastasa enfront de la concentració (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/mL).

Acoblament molecular. En aquesta investigació, es va predir l'activitat farmacològica in silico amb acoblament molecular mitjançant un metge. L'acoblament molecular dirigit es va fer utilitzant un lligand cocristal·litzat com a centre del lloc actiu. L'estructura 2Y9X es va utilitzar per a l'acoblament molecular de la tirosinasa amb tropolone, un inhibidor de la tirosinasa de bolets, com el seu cocristall. El centre del lloc d'acoblament molecular es defineix a -10,032;-28,769 i -43,467 com a dimensions X, Y i Z, respectivament. La cadena A es va separar per utilitzar-la i l'àtom d'holmi es va eliminar de l'estructura mitjançant UCSF Quimera.

En aquesta investigació també es va utilitzar l'estructura de 3HGP, una elastasa porcina. FR130180, ja que el cocristal es va utilitzar com a centre del lloc d'acoblament molecular. Les coordenades eren 12.453, 9.237 i 1.199 per a les dimensions X, Y, Z, respectivament. L'afinitat d'unió es va analitzar a partir dels deu millors conformers de cada càlcul d'acoblament molecular.

Aquest article està extret de Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x