L'exposició al gas d'escapament dièsel altera l'expressió de les xarxes implicades en la neurodegeneració en cervells de peix zebra Part 1

Resum

Les malalties neurodegeneratives són una de les principals causes de discapacitat al món, però les seves etiologies segueixen sent difícils de fer. Els factors genètics només poden representar una minoria de risc per a la majoria d'aquests trastorns, cosa que suggereix que els factors ambientals tenen un paper important en el desenvolupament d'aquestes malalties.

Les malalties neurodegeneratives es refereixen a un tipus de malaltia que provoca la degeneració de les cèl·lules cerebrals per diferents motius. Les comunes inclouen la malaltia d'Alzheimer, la malaltia de Parkinson, la malaltia de Huntington, etc. Aquestes malalties afecten les neurones del cervell, donant lloc a una funció cerebral deteriorada i símptomes com la memòria, el pensament i els canvis de comportament.

Tanmateix, no hem de perdre la nostra actitud positiva a causa d'aquestes malalties. Hi ha moltes maneres d'ajudar els pacients a millorar la memòria i alleujar els símptomes. Fem una ullada a alguns d'aquests mètodes:

Primer, fes una mica d'exercici físic. La investigació demostra que l'activitat física millora la circulació sanguínia al cervell i augmenta l'alliberament de substàncies químiques com la dopamina i les endorfines, que ajuden a protegir i millorar la funció de les neurones. Al mateix temps, l'exercici també pot ajudar a reduir problemes com l'ansietat, la depressió i l'insomni, fent que els pacients siguin més agradables per afrontar la vida.

En segon lloc, mantenir les relacions socials. També és molt important que les nostres xarxes socials estiguin estretament connectades amb àrees relacionades del cervell, i la interacció social no només pot reduir l'estrès, sinó que també pot millorar la salut del cervell augmentant la felicitat, lluitant contra la depressió i molt més.

Finalment, mengeu bé i dormiu prou. Tots dos aspectes poden tenir efectes importants en la salut del cervell. Una bona dieta no només ha d'incloure prou nutrients, sinó que també ha d'evitar consumir massa sucre, greixos saturats i colesterol repetidament. A més, dormir prou pot ajudar a combatre els problemes de memòria en diverses etapes, especialment malalties com la malaltia d'Alzheimer.

En definitiva, les malalties neurodegeneratives no signifiquen renunciar a les expectatives de vida. Tot i mantenir una actitud positiva, també cal adoptar mètodes científics i eficaços per millorar la qualitat de vida. Més riures i més sol t'ajudaran a mantenir-te saludable. Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè Cistanche deserticola és un material medicinal tradicional xinès que té molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'eficàcia de Cistanche deserticola prové dels múltiples ingredients actius que conté, com l'àcid tànic, polisacàrids, glicòsids flavonoides, etc. Aquests ingredients poden promoure la salut del cervell a través de diverses vies.

Feu clic a Coneix 10 maneres de millorar la memòria

Recentment s'ha identificat que l'exposició prolongada a la contaminació atmosfèrica augmenta el risc de patir malalties d'Alzheimer i Parkinson, però els mecanismes moleculars pels quals actua no s'entenen bé.

Els embrions de peix zebra exposats a l'extracte de partícules d'escapament dièsel (DEPe) provoquen una autofàgia disfuncional i una pèrdua neuronal. Aquí, vam exposar embrions de peix zebra a DEPe i vam realitzar anàlisis d'expressió proteòmica i transcriptòmica d'alt rendiment del seu cervell per identificar vies patògenes induïdes per la contaminació de l'aire. El tractament amb DEPe va alterar diversos processos biològics i vies de senyalització rellevants per als processos neurodegeneratius, inclòs el metabolisme xenobiòtic, la maduració del fagosoma i el processament de l'amiloide. La inducció més gran de cervells d'expressió gènica va ser a Cyp1A (més de 30- vegades).

La rellevància d'aquest canvi d'expressió es va confirmar bloquejant la inducció mitjançant CRISPR/Cas9, que va provocar un augment espectacular de la sensibilitat a la toxicitat de DEPe, confirmant que la inducció de Cyp1A era un mecanisme protector compensatori.

Aquests estudis van identificar vies moleculars alterades que poden contribuir a la patogènesi dels trastorns neurodegeneratius. En última instància, determinar la base molecular de com la contaminació de l'aire augmenta el risc de neurodegeneració ajudarà en el desenvolupament de teràpies modificadores de la malaltia.

Paraules clau

Contaminació de l'aire · Demència · Malaltia de Parkinson · Malaltia d'Alzheimer · Transcriptòmica ·Proteòmica.

Introducció

La contaminació de l'aire és un factor important en la mortalitat i s'associa amb malalties respiratòries, cardiopaties, ictus, càncer de pulmó i diabetis. L'evidència epidemiològica emergent admet un vincle entre l'exposició a la contaminació de l'aire i el desenvolupament de malalties neurodegeneratives, incloses les malalties d'Alzheimer i Parkinson (AD i PD) (Fu et al. 2019). Hi ha poca investigació per investigar els mecanismes pels quals la contaminació de l'aire pot augmentar el risc d'AD i PD, però els pocs que existeixen donen suport a una relació causal (Fu et al. 2019).

L'acumulació d'inclusions de proteïnes al cervell és una característica universal dels trastorns neurodegeneratius i probablement és una via comuna que condueix a la disfunció neuronal i la mort. Per exemple, la formació d'estructures amiloide-beta (A-beta) i tau són els distintius patològics dels agregats d'AD i -sinucleïna (-syn) o cossos de Lewy en PD (Ross i Poirier 2004; Woulfe 2008).

Sembla que les alteracions en la proteòstasi subjauen almenys parcialment la formació d'aquests agregats, però encara es desconeixen els mecanismes precisos i poden variar en els individus en funció dels factors de risc genètics i ambientals. Sabem que l'augment de l'expressió o la disminució de la degradació d'A-betaor -syn pot provocar AD i PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Altres característiques comunes en els trastorns neurodegeneratius són la inflamació i l'estrès oxidatiu. La microglia activada, les cèl·lules inflamatòries del SNC, es pot apreciar fàcilment en les autòpsies de cervells d'AD i PD i probablement contribueixin a la patogènesi de la neurodegeneració (Kannarkat et al. 2013). Es creu que aquesta inflamació i possiblement disfunció mitocondrial condueixen a estrès oxidatiu que també s'aprecia en els cervells autopsiats (Picca et al. 2020).

La majoria dels estudis mecanicistes sobre la contaminació de l'aire i la neurodegeneració fins ara s'han centrat en la inflamació (Jayaraj et al. 2017). Sembla que la contaminació de l'aire augmenta tant la inflamació del SNC com l'estrès oxidatiu en cervells animals i humans (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b i c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).

De particular interès són les troballes que la contaminació de l'aire augmenta l'expressió d'alguns gens inflamatoris al bulb olfactiu (OB) dels ratolins, una regió del cervell on la patologia de la MP es veu molt aviat en la malaltia (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a) . També es va observar inflamació als indogs que vivien a les zones urbanes en comparació amb els que vivien a les zones rurals, i els autors van especular que aquests canvis es deuen als alts nivells de contaminació de l'aire (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Els mateixos autors també van suggerir que -syn s'acumulava al cervell de les persones que vivien a les ciutats a causa de la contaminació de l'aire (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). En un estudi recent en un model de peix zebra, es va informar que l'exposició a DEPe causa neurotoxicitat i una disminució significativa del nombre de neurones en alterar l'autofàgia (Barnhill et al. 2020).

El DEPe conté molts dels components tòxics de la contaminació de l'aire i s'utilitza habitualment per modelar l'exposició en sistemes de cultiu cel·lular (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). L'autofàgia és un mecanisme intracel·lular essencial per a l'eliminació i eradicació de proteïnes mal plegades i orgànuls danyats.

De fet, l'activitat autofàgica precisa és necessària per a l'homeòstasi cel·lular, i l'autofàgia disfuncional a les neurones condueix a una supervivència alterada i neurodegeneració (Kesidou et al. 2013). Hi ha limitacions clares en molts d'aquests estudis, però tots suggereixen que l'exposició a la contaminació de l'aire augmenta el risc de MA. i PD. La nostra comprensió dels mecanismes pels quals la contaminació augmenta aquest risc és limitada, però les partícules ultrafines i diversos components de la contaminació de l'aire poden entrar al cervell directament a través del bulb olfactiu o a través dels pulmons a través del torrent sanguini (Kilian i Kitazawa 2018).

Aquestes partícules es componen de nucli d'acarboni i compostos adsorbits com ara hidrocarburs aromàtics policíclics, metalls, nitrats, sulfats i altres elements i constitueixen una proporció important de contaminants atmosfèrics, especialment a les zones urbanes. Molts d'aquests compostos han estat implicats en estrès oxidatiu i cel·lular. toxicitat que afegeix plausibilitat a una associació causal de contaminació de l'aire i neurodegeneració.

Les investigacions multidisciplinàries detallades, inclosos models cel·lulars i animals, poden donar una visió de les causes de la malaltia i dirigir els enfocaments terapèutics futurs (Cannon i Greenamyre 2011). Entre els organismes model utilitzats per a estudis in vivo, Danio rerio (peix zebra) és un model potent per estudiar la toxicologia, la genètica molecular, la toxicogenòmica i el descobriment de drogues.

La majoria de les vies biològiques estan molt conservades en els vertebrats, i la majoria dels gens humans funcionals tenen homòlegs en el peix zebra (Vaz et al.2018). A més, els embrions de peix zebra es desenvolupen de manera ràpida i independent, permetent l'anàlisi en qualsevol etapa de desenvolupament desitjada. Aquestes característiques, juntament amb la reproducció ràpida i el baix cost de cria, fan del peix zebra un model favorable per estudiar els efectes tòxics de les exposicions ambientals.

Per entendre millor els mecanismes moleculars darrere de la patogènesi de la malaltia, s'ha desenvolupat una àmplia gamma d'enfocaments de perfil d'expressió gènica d'alt rendiment. La proteòmica basada en l'espectrometria de masses i la seqüenciació d'ARN d'alt rendiment són especialment prometedores per identificar vies biològiques d'interès. Aquestes tècniques s'han utilitzat àmpliament per entendre la resposta dels models cel·lulars i animals als estímuls ambientals (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

En aquest estudi, hem realitzat anàlisis d'expressió dels efectes del tractament amb DEPe tant en els perfils del proteoma com del transcriptoma dins dels caps dels embrions de peix zebra. L'aïllament de mostres del cap, que es compon principalment de teixit cerebral, va permetre obtenir més perfils específics de teixit i minimitzar els efectes originats d'altres teixits. Descriurem aquí l'expressió gènica alterada i els perfils de proteïnes en diverses vies implicades en la neurodegeneració als caps del peix zebra exposat a DEPe. Aquests resultats proporcionen noves idees sobre els possibles mecanismes pels quals la contaminació de l'aire augmenta el risc de MA i PD.

material i mètodes

El tractament del peix i la destrucció genètica mediada per CRISPR/Cas9-

Tots els estudis van ser aprovats pel Comitè de Drets dels Animals de la UCLA. El peix zebra (AB) es va criar amb estimulació lleugera durant 1 h i es van incubar un nombre total de 200 ous durant 24 h a 28 graus. Els embrions resultants es van decorionar en pronasa (2 mg/ml) i es van tractar amb DEPe (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) a una concentració final de 20 ug/ml o amb vehicle fins 5 dies després de la fecundació (DPF).

Aquesta concentració es va seleccionar ja que va provocar la pèrdua de neurones tal com es va informar anteriorment, però sense mortalitat significativa (Barnhillet al. 2020). El peix knockdown Cyp1A es va preparar de la següent manera. Mitjançant eines disponibles a http://crispr.mit.edu, l'ARN CRISPR (Cyp1A-crRNA). ) es va dissenyar en funció de la ubicació dels llocs PAM adequats al primer exó del gen Cyp1A.

El millor disseny es va comprar a IDT DNA (www.idtdna.com) juntament amb el tracrRNA estàndard CRISPR-Cas9. El crRNA per a Cyp1Agene i tracrRNA es van tornar a suspendre per separat en 10 mM Tris-EDTA per obtenir una concentració final de 100 μM. A continuació, es va combinar tracrRNA amb crRNAin 1 × tampó dúplex (acetat de potassi 100 mM; HEPES 30 mM, pH 7, 5; DNA IDT) per obtenir una concentració final de 10 μM. La mescla es va escalfar a 95 graus durant 5 minuts en un bany d'aigua bullint i es va refredar lentament a temperatura ambient per permetre el recuit de les seqüències de nucleòtids complementàries incrRNA i tracrRNA i la formació d'ARN guia funcional (gRNA).

A continuació, es va combinar un volum de 3 μL d'ARNn recuit amb el mateix volum d'ADN d'una sola cadena donant (ssDNA; 200 μM) que la seqüència de plantilla per a Cyp1A mutant. Es va afegir una quantitat de 3 ug de Cas9 Nuclease (IDT) en 1 x tampó d'injecció (5 mM KCl; 0,1 M de fosfat de sodi, pH 6,8) a la barreja per formar els complexos CRISPR/Cas9ribonucleoprotein (Cyp1A-RNP) finals.

Per a la preparació del Scramble RNP (SC-RNP), el Cyp1A-crRNA específic es va substituir per un Scramble-crRNA comercial sense cap objectiu al genoma. Aquesta seqüència de tots els oligonucleòtids utilitzats en aquest treball es mostra a la taula complementària 1. Els ous es van injectar sota un estereomicroscopi amb uns 3 nL de barreja d'injecció de RNP.

Es van realitzar cinc injeccions de rèpliques biològiques (cada rèplica incloïa 400-600 ous injectats amb Cyp1A-RNP i 100-200 injectats amb SC-RNP) i totes les microinjeccions es van completar en 60 min. Els ous es van col·locar en plaques de Petri de plàstic de 100 mm i es van incubar a 28 graus en aigua d'ou. La taxa de supervivència dels embrions es va controlar fins a 7 dies.

Es van revisar imatges de peixos supervivents per puntuar malformacions. Cada larva es va puntuar de manera cega per la presència de 4 malformacions del desenvolupament, incloent malformació del cap, malformació de la cua, edema cardíac i edema del rovell. Les larves amb les 4 malformacions tindrien una puntuació de 4, mentre que les larves de desenvolupament normal tindrien una puntuació 0. Es va utilitzar la prova estadística T per avaluar les diferències significatives.

For more information:1950477648nn@gmail.com