Expressió diferencial dels enzims que metabolitzen els esfingolípids en rates espontàniament hipertenses: un possible substrat per a la susceptibilitat al dany cerebral i renal
Feb 24, 2022
Resum: Les alteracions en el metabolisme dels esfingolípids, una classe de molècules biològicament actives a les membranes cel·lulars amb efecte directe sobre l'homeòstasi vascular, es reconeixen cada cop més com a determinants importants en diferents trastorns vasculars. No obstant això, no està clar si els esfingolípids estan implicats en la patogènesi de la hipertensió vascular i cerebrovascular relacionada amb la hipertensió.dany renal. En aquest estudi, hem avaluat l'existència de possibles anomalies relacionades amb el metabolisme dels esfingolípids al cervell iRonyóde dues soques de rates hipertenses espontàniament ben validades, els models propensos a l'ictus (SHRSP) i els resistents a l'ictus (SHRSR), en comparació amb la soca de rata normotensa Wistar Kyoto (WKY). Els nostres resultats van mostrar una alteració global en el metabolisme dels esfingolípids tant a nivell cerebral comrenal teixits de les dues soques hipertenses en comparació amb la rata normotensa. Tanmateix, només es van detectar pocs defectes, com ara una expressió reduïda d'enzims implicats en el metabolisme/catabolisme de l'esfingosina-1-fosfat i en les vies biosintètiques de novo, exclusivament a l'SHRSP. Tot i que són necessaris estudis addicionals per entendre completament la importància d'aquestes troballes, suggereixen que els defectes en molècules de lípids específiques i/o les seves vies metabòliques relacionades probablement poden contribuir a la patogènesi del dany hipertensiu en l'òrgan diana i, finalment, poden servir com a dianes terapèutiques futures per reduir-la. les conseqüències vasculars de la hipertensió.
Paraules clau:esfingolípids; ictus; cervell; ronyó; SHR; WKY
IntroduccióLa hipertensió representa un problema de salut important que causa danys a òrgans específics i conseqüències clíniques dramàtiques, donant lloc a un augment de la taxa de mort i discapacitat a les societats occidentals [1–3]. Per reduir la càrrega de les complicacions hipertensives, cal una comprensió més completa dels mecanismes etiopatogenètics subjacents. La disponibilitat de models animals que puguin imitar de prop la patologia humana i, al mateix temps, simplificar la complexitat inherent a l'estudi de les poblacions humanes, pot ser molt útil en aquest concurs. Actualment, la rata espontàniament hipertensiva propensa a l'ictus (SHRSP), que mostra una gran predisposició a patirdany renal, especialment quan s'alimenta amb una dieta alta en sal i baixa en potassi, representa un model ideal. La hipertensió i els factors dietètics es comporten com a factors de risc predisposants tant per a rates com per a humans [4,5]. El SHRSP mostra una freqüència més alta d'ictus quan s'alimenta amb una dieta d'estil japonès (JD) que el seu control estrictament relacionat, el resistent a l'ictus (SHRSR), malgrat nivells similars de pressió arterial [6]. De nota,dany renal sempre precedeix els esdeveniments d'ictus [6]. Tot i que els mecanismes moleculars subjacents no s'entenen completament, l'evidència indica que la disfunció vascular resultant i les consegüents lesions estructurals afavoreixendany renali desenvolupament de l'ictus.
CISTANCHE MILLORARÀ LA FUNCIÓ RENAL/RENAL
Al llarg dels darrers anys, alguns dels aspectes mecànics i determinants de la malaltia cerebrovascular idany renals'ha identificat l'ocurrència al model SHRSP [7-12]. Tanmateix, encara queda molt per descobrir. Els esfingolípids, incloses les ceramides (Cer), l'esfingosina i la seva forma fosforilada Esfingosina -1-fosfat (S1P), representen els principals constituents lipídics de les membranes biològiques i modulen diverses funcions importants per a les poblacions de cèl·lules neuronals i no neuronals [13]. No menys important, però, és el paper fonamental que tenen en la formació i funció vascular [13–15], així com en la regulació de la integritat de la barrera hematoencefàlica (BBB) mitjançant la modulació de proteïnes d'unió estreta [16]. En aquest sentit, l'evidència indica que la síntesi de novo d'esfingolípids és crucial per preservar les funcions de les cèl·lules endotelials [17, 18], probablement contribuint a la integritat vascular i l'homeòstasi. S'ha descrit un metabolisme defectuós dels esfingolípids subjacent a diferents condicions cardiovasculars [19,20]. Tanmateix, encara no s'ha proporcionat cap evidència directa del paper causant dels esfingolípids en la patogènesi del dany hipertensiu en l'òrgan diana. Malgrat la manca de detalls mecanicistes, s'ha demostrat que la via de S1P, un lípid bioactiu, és neuroprotectora durant la isquèmia [21,22], i l'estimulació dels seus receptors provoca efectes beneficiosos en un model animal d'ictus [23]. Per tant, és concebible que existeixi una estreta interacció entre l'ictus i els esfingolípids. En aquest estudi, hem investigat el cervell irenalexpressió de diverses molècules implicades en les vies dels esfingolípids tant en soques SHRSP com SHRSR, respecte a la soca WKY normotensiva. Les nostres troballes posen de manifest, per primera vegada, un metabolisme aberrant dels esfingolípids, ja sigui al cervell o al ronyó d'ambdós models animals hipertensos. És important destacar que alguns defectes es van detectar exclusivament a la soca SHSRP. Aquesta evidència suggereix que les alteracions en molècules de lípids específiques i/o les seves vies específiques poden contribuir potencialment a la patogènesi de la hipertensió i del dany hipertensiu en l'òrgan diana.
Resultats
Els nivells d'enzims metabolitzadors de S1P es pertorben en SHRSPPer revelar si es va detectar qualsevol alteració potencial en el metabolisme dels esfingolípids a les soques SHRSP i SHRSR, primer vam investigar l'expressió de molècules implicades en les vies de síntesi i degradació de S1P (esquematitzada a la figura 1). Amb aquesta finalitat, es van avaluar els nivells de SPHK1 i 2, així com de SGPL1 enrenalteixits de les dues rates espontàniament hipertenses en comparació amb la soca WKY. Tal com s'informa a la figura 2, les rates SHRSP es van caracteritzar per una reducció significativa de SPHK2 i de SGPL1 al cervell en comparació amb WKY i SHRSR. No hi ha diferència en elrenales va detectar l'expressió de tots els enzims entre les tres soques de rates.
Els nivells de receptors S1P són aberrants en rates espontàniament hipertensesL'evidència indica que la modulació dels receptors S1P pot ser beneficiosa en models isquèmics [23]. Aquí, per tal d'establir si algun canvi en la seva expressió podria estar eventualment associat amb els fenotips de la malaltia, vam avaluar els nivells de proteïnes dels receptors més abundants, S1PR1-3 [24], a les tres soques de rates. L'anàlisi d'immunoblotting va revelar una variació en l'expressió dels tres receptors de manera dependent del teixit. Curiosament, S1PR1 va ser l'únic receptor l'expressió del qual va augmentar tant al cervell com als ronyons de SHRSR (figura 3A, 3B). Per contra, l'anàlisi dels teixits SHRSP no va mostrar cap variació en l'expressió de tots els receptors, excepte el S1PR3 els nivells del qual van augmentar al cervell, de manera similar als detectats en el SHRSR (Figura 3E)
L'expressió de les sintasis de ceramida és defectuosa en diversos teixits dels models SHRSP i SHRSRLes proves prèvies indiquen que els nivells de ceramida augmenten en models preclínics d'ictus, així com en pacients humans [25–27]. Aquí, per avaluar si el metabolisme de la ceramida es podria veure afectat en rates espontàniament hipertenses, donant lloc a un augment dels nivells de ceramida, vam investigar l'expressió de les ceramide sintasis, que s'informa que són les més abundants al cervell (CerS1 i CerS2). i en elronyons(CerS2 i CerS4) [28]. Tal com s'informa a la figura 4, l'anàlisi de qPCR va revelar un trastorn generalitzat en l'expressió de les sintasis, amb algunes diferències entre les dues soques espontàniament hipertenses. SHRSP va mostrar un augment dels nivells d'ARNm de CerS1 al cervell en comparació amb WKY o SHRSR (figura 4A) i nivells reduïts de CerS6 al cervell.ronyons, de manera similar a la observada a la SHRSR (figura 4D). Per contra, els SHRSR es van caracteritzar per una expressió reduïda de l'ARNm de CerS2 tant al cervell com als ronyons (figura 4B, 4C).
L'expressió de SPTLC1 es redueix als teixits SHRSPEstudis recents han assenyalat una possible implicació de la biosíntesi de novo d'esfingolípids en la hipertensió i les malalties vasculars [29,30]. Per investigar qualsevol possible associació entre les vies dels esfingolípids de novo i l'ictus, es van avaluar els perfils d'expressió de proteïnes de SPTLC1 i 2, dues subunitats de l'SPT, els enzims que limiten la velocitat en la biosíntesi de novo dels esfingolípids [13], tant en el cervell com en elrenalteixits. Tal com es va informar a la figura 5A, B, les rates SHRSP es van caracteritzar per una reducció significativa de SPTLC1 tant al cervell com aronyons.Curiosament, SPTCL2 també es va reduir al cervell de SHRSP en comparació amb SHRSR (figura 5C).
L'expressió de la 3-ceto-dihidroesfingosina reductasa es redueix en les dues rates espontàniament hipertensesL'alteració en la biosíntesi de novo dels esfingolípids es va confirmar encara més mitjançant l'anàlisi dels enzims 3-ceto dihidroesfingosina reductasa (KDSR) i ceramida desaturasa (DES), normalment implicats en la síntesi de novo d'esfingolípids [13]. L'anàlisi de qPCR va mostrar una reducció significativa dels nivells d'expressió d'ARNm de KDSR a laronyonstant de SHRSP com de SHRSR (figura 6B). No es van observar més canvis.
Figura 2. L'expressió dels enzims metabolitzadors de S1P és defectuosa en els teixits cerebrals de SHRSP. Immunoblottings retallats representatius i anàlisi densitomètrica de SPHK1 (esfingosina quinasa 1) (A, B), SPHK2 (esfingosina quinasa 2) (C, D) i SGPL1 (S1P-Lyase) (E, F) en teixits cerebrals i renals de WKY, SHRSP i SHRSR. En cada immunoblot, totes les mostres es van executar al mateix gel. Les mostres no adjacents estan separades per una línia negra. Les dades es representen com a mitjana ± SD, n {{10}}/7 per a cada grup de rates. * p < 0.05;="" **="" p=""><0,01; ***="" p=""><0,001 (anova="" unidireccional,="" posttest="" de="" tukey).="" la="" data="" en="" brut="" per="" generar="" la="" figura="" s'informa="" a="" la="" taula="" de="" materials="" suplementaris="">
Discussió
Malgrat els enormes esforços de recerca dels científics bàsics i clínics, les complicacions hipertensives com l'ictus irenalLes malalties encara representen les principals causes de mort a tot el món [1–3]. Per tant, cal conèixer les vies patògenes alternatives i les noves dianes de fàrmacs per preservar la salut cerebrovascular i renal. L'exploració del metabolisme dels esfingolípids, una classe de molècules biològicament actives a les membranes cel·lulars que tenen un paper clau en l'homeòstasi vascular, pot obrir el camí cap a un nou horitzó de comprensió. Tot i que les evidències emergents indiquen que les alteracions en el metabolisme dels esfingolípids, com S1P i les ceramides, poden tenir un paper en els trastorns vasculars i la hipertensió [31], encara no està clar si estan implicades en la patogènesi del dany d'òrgans hipertensius. En aquest estudi, hem intentat obtenir algunes idees sobre el metabolisme dels esfingolípids a les soques de rata SHRSP i SHRSR, dos models preclínics espontàniament hipertensos amb una susceptibilitat diferent arenali desenvolupament de danys cerebrovasculars. En particular, vam realitzar l'estudi en rates de 8-setmanes d'edat, en una edat en què es tornen hipertenses però encara estan lliures de danys en l'òrgan diana. Mitjançant aquest enfocament, vam voler identificar qualsevol signatura "esfingobiològica" potencialment implicada en el diferent resultat de la malaltia hipertensiva en els dos models de rata. Una soca de rata normotensa va servir com a control adequat. Les nostres troballes van mostrar per primera vegada que ambdós models de rates hipertenses es caracteritzaven per una alteració global del metabolisme dels esfingolípids, però pocs canvis van ser específics per a la soca SHRSP o SHRSR. En particular, l'expressió tant de SPHK2 com de SGPL1 es va reduir significativament només al cervell de SHRSP. La reducció dels nivells de SPHK2 pot tenir efectes extremadament nocius al cervell, on és particularment abundant a les cèl·lules endotelials microvasculars i exerceix un paper protector contra la isquèmia induïda pel precondicionament hipòxic [32]. D'altra banda, la reducció de SGPL1 pot ser potencialment tòxica per a les funcions de les cèl·lules neuronals [33].
A la vista d'això, és concebible que un desequilibri dels enzims metabolitzadors de S1P, amb una consegüent biodisponibilitat defectuosa de S1P, pugui provocar un augment del dany vascular. La possible implicació de S1P en la regulació dels mecanismes moleculars potencialment associats amb l'ictus va provenir de l'evidència que els nivells de S1PR1, que recentment s'ha identificat com un gen candidat posicional per a la sensibilitat a la sal en SHRSP [22], van augmentar als teixits SHRSR. . Aquests resultats suggereixen un possible doble paper de S1P en la determinació del dany vascular i el consegüent esdeveniment d'ictus. De fet, la reducció de la biodisponibilitat de S1P i/o la regulació defectuosa de les seves vies relacionades podria augmentar la susceptibilitat a l'ictus en el SHRSP. Per contra, l'augment de l'expressió de S1PR1, l'activació del qual s'ha informat que és beneficiosa en models experimentals d'isquèmia cerebral [34–36], podria representar eventualment un factor protector en SHRSR. Les nostres troballes van revelar una altra diferència interessant entre les dues soques de rates espontàniament hipertenses. L'augment de l'expressió de CerS1, detectat només a l'SHRSP, pot ser suggeridor d'una biodisponibilitat elevada de ceramida cerebral que pot revelar tòxic i potencialment associada a una major susceptibilitat a l'ictus. Això està corroborat per diversos estudis que informen de l'associació entre l'augment del contingut de ceramide, la malaltia isquèmica dels petits vasos i les hiperintensitats de la substància blanca [37,38].
CISTANCHE MILLORARÀ LA FUNCIÓ RENAL/RENAL
Una altra observació important derivada del nostre estudi és la reducció significativa tant de SPTLC1 com de 2 en SHRSP en comparació amb SHRSR, en què no es van detectar variacions. Tot i que ambdues soques hipertenses compartien alguns defectes en l'expressió d'altres gens implicats en la síntesi d'esfingolípids de novo, la reducció dels SPTLC suggereix clarament un paper clau d'aquesta ruta metabòlica en la patogènesi de la malaltia cerebrovascular. En aquest context, les evidències recents indiquen que la síntesi endotelial de novo d'esfingolípids regula la pressió arterial i l'homeòstasi endotelial [30], posant de manifest el paper crític dels esfingolípids sintetitzats de novo en les malalties vasculars. Les dades actuals poden indicar que la síntesi de novo d'esfingolípids es podria pertorbar al SHRSP. El nostre estudi és el primer que aborda aspectes específics del metabolisme dels esfingolípids pel que fa a l'ictus. Tot i que no vam realitzar cap anàlisi quantitativa d'esfingolípids en teixits de rata, les nostres troballes van suggerir una possible alteració en la biodisponibilitat de diferents esfingolípids com S1P i ceramida en SHRSP. Com que S1P estimula la proliferació cel·lular i les vies de supervivència, mentre que les ceramides solen exercir efectes antiproliferatius i apoptòtics [39], el desequilibri entre elles pot afectar l'homeòstasi cerebral en SHRSP i contribuir potencialment a la patogènesi de l'ictus. Tenint en compte la naturalesa correlativa del nostre estudi, calen més investigacions per entendre completament el paper fonamental potencial de les alteracions dels esfingolípids en la patogènesi del dany d'òrgans hipertensius per tal de desenvolupar estratègies terapèutiques "basades en esfingolípids" més efectives. Tenint en compte que diversos fàrmacs, les dianes moleculars dels quals pertanyen a les vies dels esfingolípids, ja estan disponibles per al tractament d'altres malalties [40], creiem que les nostres troballes poden oferir suport per explorar el seu potencial terapèutic en el cervell hipertens irenaltrastorns vasculars.
Materials i mètodes
Models animalsTots els experiments es van realitzar amb soques de rates masculines de dos mesos d'edat, propenses a l'ictus espontàniament hipertenses (SHRSP), resistents a l'ictus espontàniament hipertenses (SHRSR) i comparant-les amb una soca de rata normotensa coincident per edat i sexe, WistarKyoto (WKY) . SHRSP i SHRSR són els models animals més utilitzats en estudis preclínics d'hipertensió i d'ictus associat [5,6]. Es van mantenir a la instal·lació d'animals de l'IRCCS Neuromed, es van mantenir a temperatura ambient constant i cicles dia/nit de 12 h, i es van alimentar amb menjar de rata regular i aigua ad libitum. Tots els estudis amb animals es van realitzar d'acord amb els protocols aprovats per l'IRCCS Neuromed Animal Care Review Board i per "Istituto Superiore di Sanità" (número de permís ISS: 1086/2020) i es van realitzar segons la Directiva de la UE 2010/63/UE per a experiments amb animals. .
ImmunoblottingsLes rates van ser sacrificades per decapitació i teixits (cervell ironyons) es van congelar instantàniament en N2 líquid i es van polveritzar en un morter amb una mà de mà. El teixit polveritzat es va homogeneïtzar en un tampó de lisi que contenia 20 mM de Tris, pH 7,4, 1 per cent de Nonidet P-40, 1 mM d'EDTA, 20 mM de NaF, 2 mM de Na3VO4 i una mescla d'inhibidor de proteasa 1:1000 (Sigma-Aldrich) i sonicat amb polsos de 2*10 s. Per a la immunoblotting, es van immunoblotjar 20 µg de lisat proteic total amb els anticossos següents: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, Regne Unit). ), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), anti-S1PR1 (1:1000) (Ciències immunològiques), anti-S1PR2 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) , anti-S1PR3 (1:1000) (Ciències immunològiques), anti SPTLC1 (1:1000) (Abcam) i anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Per a la normalització de proteïnes, es va utilitzar anti-actina (1:2000) (Ciències Immunològiques, Roma, Itàlia). Les bandes de proteïnes van ser detectades per ECL Prime (GE Healthcare) i quantificades amb el programari Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).
Extracció d'ARN i qPCR.
L'ARN total es va extreure mitjançant el kit Rneasy (Qiagen) segons les instruccions del fabricant. Es van sintetitzar 1000 ng d'ARN total mitjançant la transcriptasa inversa Super Script III (Invitrogen) i l'ADNc resultant es va amplificar mitjançant Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) seguint les instruccions del fabricant. L'anàlisi quantitativa de qPCR es va realitzar mitjançant cebadors específics: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.
CISTANCHE MILLORARÀ LA FUNCIÓ RENAL/RENAL
