Els patrons diferencials de mutació de VHL en RCC de cèl·lules clares bilaterals distingeixen entre tumors primaris independents i malaltia metastàtica contralateral

Objectiu

Per avaluar si els pacients amb carcinoma renal de cèl·lules clares (ccRCC) bilaterals i multifocals es poden diferenciar mitjançant l'anàlisi de mutacions de VHL en casos que representen múltiples tumors primaris que sorgeixen de manera independent o un únic tumor primari que s'ha estès tant ipsilateralment com al ronyó contralateral. La naturalesa de la multifocalitat del càncer de ronyó fora de les síndromes hereditàries conegudes encara és poc entesa.

Materials i mètodes

Es va avaluar l'ADN de múltiples tumors per pacient per a la mutació del gen VHL somàtic i la hipermetilació. Es va analitzar un subconjunt de tumors amb mutacions VHL compartides amb assajos de seqüenciació de propera generació dirigits.

Resultats

Aquesta cohort contenia 5 pacients amb tumors múltiples que van demostrar una mutació VHL somàtica compartida consistent amb la propagació metastàtica inclosa al ronyó contralateral. En diversos casos, això es va corroborar per mutacions somàtiques compartides addicionals en gens associats a ccRCC. En canvi, els 14 pacients restants amb tumors múltiples van demostrar alteracions VHL úniques i no compartides en tots els tumors analitzats, d'acord amb els tumors renals que sorgeixen de manera independent. Cap d'aquests últims pacients va mostrar cap evidència de propagació local o metàstasi a distància.

Conclusió

L'espectre d'alteracions de VHL dins dels tumors ccRCC bilaterals i multifocals avaluats d'un sol pacient pot distingir entre el creixement del tumor independent i la metàstasi múltiple. Això es pot realitzar mitjançant les proves genètiques clíniques disponibles actualment i millorarà la precisió del diagnòstic i el pronòstic del pacient, així com informarà la gestió adequada.

Feu clic aquí per obtenirels beneficis de Cistanche

Introducció

El carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares (ccRCC) és el tipus més comú de càncer de ronyó, que representa el 75 per cent dels casos. El pronòstic i la gestió dels pacients amb ccRCC depenen de l'etapa clínica. Si la malaltia es detecta precoçment i encara es localitza dins del ronyó, la resecció quirúrgica s'associa amb una taxa de supervivència del 95% 5-10-any. Tanmateix, si el tumor s'ha estès de manera local o sistèmica, les taxes de supervivència 5-anys cauen al 67% o al 12%, respectivament. El RCC de cèl·lules clares es caracteritza més sovint per la pèrdua bial·lèlica del gen supressor del tumor von-Hippel Lindau, VHL. Mecànicament, això s'aconsegueix mitjançant la pèrdua d'una còpia del cromosoma 3p, inclosa la regió que codifica VHL, en combinació amb la mutació o la hipermetilació del promotor de l'altra còpia de VHL. S'observen alteracions somàtiques del gen VHL en aproximadament el 90 per cent dels ccRCC esporàdics, amb mutació gènica observada en més del 80 per cent dels ccRCC i la hipermetilació del promotor de l'illa CpG observada en aproximadament el 8 per cent dels ccRCC.

Mentre que en la majoria dels casos esporàdics de ccRCC, només hi ha una única lesió en un ronyó, una fracció presenta múltiples lesions en un o ambdós ronyons. Aquests pacients presenten ccRCC multifocal bilateral (BMF) i la naturalesa d'aquests tumors múltiples pot influir en el diagnòstic i la gestió del pacient. La presentació podria representar un únic tumor primari que s'ha estès dins del ronyó ipsilateral o que ha fet metàstasi al ronyó contralateral. Diversos estudis han investigat casos de ccRCC multifocal comparant el grau de pèrdua de 3p o l'espectre d'alteracions cromosòmiques entre tumors d'un mateix pacient per demostrar que comparteixen un origen clonal comú consistent amb la propagació metastàtica o que cada tumor representa un esdeveniment de origen independent. . Aquesta susceptibilitat podria ser induïda per un efecte ambiental, com l'exposició al tricloroetilè (TCE), o per una alteració genètica de la línia germinal. Una causa coneguda de càncer de ronyó multifocal bilateral és la mutació de la línia germinal d'un gen de susceptibilitat a RCC, com ara VHL, MET, BAP1 o FLCN, associada a una síndrome de predisposició tumoral hereditària. La més comuna d'aquestes és la malaltia de von Hippel-Lindau (VHL), causada per l'alteració de la línia germinal del gen VHL, que provoca una predisposició al CCRC multifocal bilateral. Mentre que alguns pacients amb BMF ccRCC tindran síndrome de VHL, molts pacients amb malaltia bilateral multifocal no tindran cap síndrome de susceptibilitat a RCC diagnosticat.

Avaluar la diferència entre malaltia metastàtica o d'origen independent és possible mitjançant l'anàlisi genètica dels tumors per identificar alteracions genètiques comunes compartides, en el cas de metàstasi, o canvis genètics variats dispars en el cas d'esdeveniments independents. La distinció entre aquestes 2 presentacions clíniques és fonamental per a la gestió adequada del pacient. Si s'ha produït metàstasi, el pacient probablement seria tractat per una malaltia sistèmica. En canvi, si tots els tumors fossin múltiples esdeveniments independents dins dels ronyons, el pacient probablement seria tractat per a una malaltia localitzada i seria investigat per trastorns genètics de la línia germinal, tenint en compte també el cribratge de membres de la família potencialment en risc.

En aquest estudi, hem utilitzat l'anàlisi de la mutació del gen VHL en ccRCC com a marcador genètic per comparar tumors dins de cada pacient en una cohort de pacients bilaterals multifocals amb ccRCC que no tenien alteració genètica de la línia germinal coneguda. Es van identificar dues poblacions de pacients: aquells amb tumors d'origen independent i aquells amb metàstasi al ronyó contralateral.

Efectes Cistanche

Materials i mètodes

1. Pacients

Els pacients van ser vists a l'Urologic Oncology Branch (UOB) de l'Institut Nacional del Càncer (NCI), els Instituts Nacionals de Salut (NIH) per a una avaluació clínica. Es va considerar que els pacients tenien antecedents familiars si tenien almenys un familiar de primer o segon grau amb antecedents de CCR de cèl·lules clares i d'inici precoç si se'ls va diagnosticar als 46 anys o menys. Aquest estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional de l'Institut Nacional del Càncer i tots els pacients van proporcionar un consentiment informat per escrit sobre els protocols de la branca d'oncologia urològica. A tots els pacients se'ls va donar un número 6-desidentificat assignat pel laboratori per a la referència interna.

2. PCR i seqüenciació d'ADN

L'ADN es va extreure de sang i teixit tumoral mitjançant els kits de purificació d'ADN de sang i teixits Promega Maxwell 16 (Promega, WI). La seqüenciació de l'ADN es va realitzar mitjançant PCR mitjançant un Qiagen Taq PCR Core Kit (Qiagen, MD) segons les especificacions del fabricant, seguida de la seqüenciació bidireccional mitjançant el Big Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA) segons les especificacions del fabricant. i s'executa amb un ABI 3130xl o 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). La seqüenciació de Sanger es va dur a terme al CCR Genomics Core del National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892. Les seqüències directes i inverses es van avaluar mitjançant Sequencher 5.0.1 (Gencodes, MI).

3. Anàlisi de Metilació del DNA

Els ADN es van sotmetre a tractament amb bisulfits mitjançant un kit de bisulfits Qiagen EpiTect (Qiagen, MD) segons les especificacions del fabricant. Es van dissenyar dos parells d'imprimadors que serien capaços de recuit amb ADN tant metilat com no metilat/convertit en bisulfit a les proximitats del promotor de VHL. La PCR es va realitzar com l'anterior amb els primers exteriors, seguida d'una segona ronda de PCR amb els primers interns, i els productes es van sotmetre a una seqüenciació bidireccional com anteriorment.

4. Anàlisi Oncomine i TruSight Oncology 500

Els tumors seleccionats de les cirurgies indicades clínicament van ser escollits per a l'anàlisi mitjançant l'assaig integral d'Oncomine v3 (ThermoFisher, MA) o, posteriorment, el TruSight Oncology 500 (Illumina, CA), assajos de seqüenciació de nova generació capaços de detectar variacions de nucleòtids únics, variacions del nombre de còpies, fusions gèniques i indels de 161 a 523 gens conductors del càncer, respectivament. Les mostres fixades en formalina i incrustades en parafina van ser processades per la Secció de Diagnòstic Molecular del Laboratori de Patologia de l'NCI.

Cistanche estandarditzada

Discussió

La capacitat de caracteritzar millor els pacients amb tumors renals multifocals bilaterals permetrà una millor gestió del pacient i podria donar lloc a noves idees sobre la naturalesa genètica del carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares. En general, es coneix relativament poc sobre l'evolució del ccRCC multifocal bilateral. La freqüència de RCC bilateral i/o multifocal, ja sigui a la presentació o dins d'un any des del descobriment inicial del tumor, és relativament baixa i la freqüència informada varia molt entre el 0,8% i el 5,4%. Es requereixen estudis addicionals de cohorts més grans amb criteris de diagnòstic universals per determinar la freqüència exacta de BMF ccRCC. Wiklund et al van informar que el BMF RCC és més freqüent en pacients més joves i Syed et al van demostrar una incidència més gran amb un seguiment més llarg. Alguns estudis han investigat si el RCC multifocal representa metàstasi local o esdeveniments que sorgeixen de manera independent comparant el grau de pèrdua de 3p o l'espectre d'alteracions cromosòmiques entre tumors del mateix pacient. Miyake et al i Junker et al van mostrar patrons compartits de pèrdua del cromosoma 3p o alteració cromosòmica entre tumors en el mateix pacient consistents amb la propagació metastàtica, mentre que Ji et al van mostrar diferents graus de pèrdua de 3p entre els tumors de 2 pacients diferents compatibles amb l'aparició independent. tumors en ambdós casos. Alguns informes de casos mostren evidències de propagació metastàtica d'1 ronyó a la regió del ronyó contralateral, suprarenal o renal.

En l'estudi actual, tots els pacients van desenvolupar tumors als dos ronyons. La malaltia metacrònica era més freqüent (4/5; 80 per cent) en el grup que va demostrar metàstasis contralaterals que en aquells en què els tumors van créixer de manera independent (3/14; 21 per cent), però es va observar malaltia contralateral tant sincrònica com metacrònica en ambdues cohorts. . L'anàlisi del patró de mutació del VHL entre els tumors de cada pacient va permetre que tots els pacients fossin designats com a preocupats per la malaltia metastàtica o els tumors renals bilaterals localitzats que probablement s'haguessin sorgit de manera independent. Els pacients amb malaltia metastàtica compartien una alteració comuna del VHL entre tots els tumors, mentre que els pacients amb tumors renals d'origen independent tenien diferents alteracions del VHL en diferents tumors.

Els pacients que van demostrar una mutació VHL compartida en diversos tumors renals podrien resultar de mutacions de VHL de mosaicisme germinal en lloc de metàstasi. En aquest cas, la mutació de la línia germinal només pot estar present a les cèl·lules renals, o fins i tot una fracció de les cèl·lules renals, però no està present als glòbuls blancs avaluats en una anàlisi de sang o a les cèl·lules bucals d'un hisop de galtes. El pacient semblaria negatiu a la línia germinal mitjançant proves estàndard, però podria tenir la mateixa mutació VHL present en múltiples tumors que sorgeixen de manera independent. Aquest principi s'ha demostrat recentment en pacients amb tumor de Wilms que tenien mutacions al principi del desenvolupament que van donar lloc a tumors multifocals bilaterals amb una mutació del conductor compartit. És important destacar que també es va demostrar que en aquest escenari els tumors independents desenvoluparien mutacions addicionals úniques a mesura que evolucionés el tumor. En general, el mosaicisme és un esdeveniment rar i poc probable en aquest estudi, ja que 3 pacients van demostrar tumors amb mutacions gèniques somàtiques addicionals compartides (MTOR i ARID1A per al pacient 3; PBRM1, SETD2 i NFE2L2 per al pacient 4; PBRM1 i KDM5C per al pacient 5) que només es podia compartir a causa de metàstasi més que de mosaicisme. A més, a 2 pacients amb mutacions VHL compartides (pacients 2 i 3) també es va realitzar una seqüenciació al teixit renal normal adjacent que no mostrava cap evidència de mutació de VHL. Finalment, 4 de 5 pacients (pacients 1 a 4) van desenvolupar metàstasis fora dels ronyons.

Cal destacar que el pacient 5 encara no ha demostrat evidència de metàstasis distants. Tot i que el seu tumor més gran era de 4, 8 cm i es podria considerar que té un risc més elevat de propagació metastàtica, l'observació que els 7 dels seus tumors recentment resecats comparteixen mutacions VHL i la majoria comparteixen mutacions PBRM1 i KDM5C augmenta encara més la sospita de metàstasis distants. Com a resultat, aquest pacient serà seguit amb una observació especialment acurada i atenta en el futur.

pastilles de Cistanche i Cistanche sec

Els pacients amb tumors renals d'origen independent van demostrar un enriquiment tant per a antecedents familiars de càncer de ronyó com per malaltia d'inici precoç, tots dos indicadors d'alteracions hereditàries de la línia germinal. Tots els pacients havien fet un cribratge negatiu per a les variacions patògenes del gen del càncer de ronyó conegudes, cosa que suggereix que podrien estar presents causes genètiques desconegudes alternatives. També s'ha demostrat que la translocació de la línia germinal que implica el cromosoma 3p augmenta el risc de ccRCC i s'associa amb una malaltia multifocal bilateral. Les translocacions no són detectables per matrius de gens dirigits i requereixen anàlisi de cariotips. Així, els pacients amb tumors renals d'origen independent que es presenten sense mutacions en els gens coneguts de susceptibilitat a RCC també s'han de cridar per a les translocacions del cromosoma 3p. L'anàlisi del cariotip estava disponible per a 12 de 14 dels pacients amb tumors renals de origen independent en aquest estudi, però no es van observar translocacions rellevants. Una avaluació addicional d'aquests pacients per a alteracions addicionals de la línia germinal podria identificar nous gens de susceptibilitat a RCC i l'anàlisi de l'espectre de mutació de VHL permet la selecció d'aquests pacients.

Cada cop és més comú realitzar anàlisis de mutacions gèniques del càncer dirigides a tumors o biòpsies de pacients, i aquestes anàlisis inclouen freqüentment el gen VHL, així com gens addicionals associats a ccRCC com PBRM1, BAP1, SETD2 i ARID1A. Per tant, les biòpsies bilaterals rutinàries de masses renals bilaterals poden proporcionar un mètode fàcil i eficaç per distingir entre metàstasi contralateral i tumors multifocals d'origen independent, a diferència de les anàlisis basades en alteracions cromosòmiques que s'han realitzat prèviament, permetent una confirmació addicional en els pacients amb malaltia metastàtica. Diversos estudis recents han posat de manifest l'heterogeneïtat intratumoral present dins del ccRCC i això podria confondre l'anàlisi de la biòpsia, ja que l'àrea mostrada pot no tenir una mutació que només està present en algunes àrees d'un tumor i proporcionar resultats inexactes. L'avantatge d'avaluar la mutació VHL és que està present a la majoria de ccRCC i és una mutació troncal precoç que estaria present a tot el tumor, per la qual cosa les biòpsies gairebé sempre haurien de ser informatives.

La importància de poder distingir entre pacients amb malaltia metastàtica o amb tumors renals localitzats de origen independent és que es tractarien de manera diferent i potencialment tindrien resultats clarament diferents. Tot i que l'evidència de metàstasi fora del ronyó és concloent, les imatges de pacients que tenen BMF ccRCC no permeten una designació precisa. En aquest estudi, aquest problema s'exemplifica millor pels pacients 4, 9 i 19, ja que tots 3 presentaven una malaltia bilateral amb un tumor gran en un ronyó i un tumor o tumors més petits al ronyó contralateral i sense evidència sincrònica de lesions fora del ronyó. ronyó. Sense l'anàlisi de mutacions de VHL, l'única característica notable és que el pacient 19 va tenir l'aparició més jove als 36 anys, i el pacient 9 va tenir l'última aparició als 62 anys. diferents tumors, d'acord amb els tumors renals d'origen independent. Per contra, el pacient 3 tenia la mateixa mutació VHL compartida en tots els tumors consistents amb un origen comú i metàstasi contralateral. Això va ser recolzat per la presència compartida de mutacions somàtiques addicionals compartides en MTOR i ARID1A en tots els tumors del pacient 3. Així, els pacients 9 i 19 podrien ser tractats mitjançant excisió quirúrgica dels tumors i vigilància rutinària, mentre que el pacient 3 podria ser tractat amb teràpies sistèmiques adequades per a un pacient amb malaltia metastàtica.

En conclusió, l'anàlisi de l'alteració de VHL en BMF ccRCC pot ajudar a distingir entre tumors renals metastàtics contralaterals i tumors renals localitzats i que sorgeixen de manera independent i això es pot utilitzar per influir en la gestió i el resultat del pacient.

Referències

1. Linehan WM, Walther MM, Zbar B. La base genètica del càncer de ronyó. J Urol. 2003;170(6 Pt 1):2163–2172.

2. Chin AI, Lam JS, Figlin RA, Belldegrun AS. Estratègies de vigilància per a pacients amb carcinoma de cèl·lules renals després de nefrectomia. Rev Urol. 2006;8:1–7.

3. Shao N, Wan F, Abudurexiti M, Wang J, Zhu Y, Ye D. Causes de mort i supervivència condicional del carcinoma de cèl·lules renals. Front Oncol. 2019;9:591.

4. Gnarra JR, Tory K, Weng Y, et al. Mutacions del gen supressor del tumor VHL en el carcinoma renal. Nat Genet. 1994;7:85–90.

5. Nickerson ML, Jaeger E, Shi Y, et al. Identificació millorada de les alteracions del gen von Hippel-Lindau en tumors renals de cèl·lules clares. Clin Cancer Res. 2008;14:4726–4734.

6. Investigació atles del genoma del càncer n. Caracterització molecular completa del carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares. Naturalesa. 2013;499:43–49.

7. Zbar B, Brauch H, Talmadge C, Linehan M. Pèrdua d'al·lels de loci al braç curt del cromosoma 3 en carcinoma de cèl·lules renals. Naturalesa. 1987;327:721–724.

8. Ricketts CJ, Linehan WM. La seqüenciació multiregional dilucida l'evolució del carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares. Cèl·lula. 2018;173:540–542.

9. Syed JS, Nguyen KA, Holford TR, Hofmann JN, Shuch B. Factors de risc per al carcinoma de cèl·lules renals bilaterals metacrònics: una anàlisi de vigilància, epidemiologia i resultats. Càncer. 2019;125:232–238.

10. Crispen PL, Lohse CM, Blute ML. Carcinoma de cèl·lules renals multifocal: característiques clinicopatològiques i resultats per als tumors

11. Wiklund F, Tretli S, Choueiri TK, Signoretti S, Fall K, HO Adami. Risc de càncer de cèl·lules renals bilateral. J Clin Oncol. 2009;27:3737–3741.

12. Ji Z, Zhao J, Zhao T, Han Y, Zhang Y, Ye H. Origen independent del tumor en dos casos de carcinoma renal de cèl·lules clares bilateral sincrònic. Ciència Rep. 2016;6:29267.

13. Miyake H, Nakamura H, Hara I, et al. Carcinoma de cèl·lules renals multifocal: evidència d'un origen clonal comú. Clin Cancer Res. 1998;4:2491–2494.

14. Junker K, Thrum K, Schlichter A, Muller G, Hindermann W, Schubert J. Origen clonal del carcinoma renal multifocal determinat per anàlisi de microsatèl·lits. Revista d'Urologia. 2002;168:2632–2636.

15. Wells GM, Schroth W, Brauch H, Ross EA. Carcinoma bilateral de cèl·lules renals associat a una mutació adquirida de VHL i exposició a llarg termini al tricloroetilè. Clin Nephrol. 2009;71:708–713.

16. Linehan WM. Bases genètiques del càncer renal bilateral: implicacions per a l'avaluació i la gestió. J Clin Oncol. 2009;27:3731–3733.

17. Linehan WM, Srinivasan R, Schmidt LS. La base genètica del càncer de ronyó: una malaltia metabòlica. Nat Rev Urol. 2010;7:277–285.

18. Linehan WM, Ricketts CJ. La base metabòlica del càncer de ronyó. Semin Càncer Biol. 2013;23:46–55.

19. Latif F, Tory K, Gnarra J, et al. Identificació del gen supressor del tumor de la malaltia de von Hippel-Lindau. Ciència. 1993;260:1317–1320.

20. Choyke PL, Glenn GM, Walther MM, Patronas NJ, Linehan WM, Zbar B. Malaltia de Hippel-Lindau: característiques genètiques, clíniques i d'imatge. Radiologia. 1995;194:629–642.

21. Kechrid M, Malik GH, Al-Mohaya S, et al. Carcinoma de cèl·lules renals del ronyó contralateral amb secundaris a la vesícula biliar vuit anys després de la nefrectomia. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2000;11:587–592.

22. Wang K, Wang J, Sun JI, et al. Carcinoma de cèl·lules renals amb metàstasi metacrònica a la glàndula suprarenal contralateral i la bufeta urinària: informe d'un cas. Oncol Lett. 2015;10:2749–2752.

23. Ahmed HK, Bapir R, Abdula GF, Hassan KMS, Ali RM, Salih MA. Metàstasi suprarenal contralateral solitària del carcinoma de cèl·lules renals 15 anys després de la nefrectomia radical: un informe de cas i revisió de la literatura. Int J Surg Case Rep. 2019;58:33–36.

24. Coorens THH, Treger TD, Al-Saadi R, et al. Precursors embrionaris del tumor de Wilms. Ciència. 2019;366:1247–1251.

25. Foulkes WD, Polak P. Tumors bilaterals: heretats o adquirits? N Engl J Med. 2020;383:280–282.

26. Cohen AJ, Li FP, Berg S, et al. Carcinoma hereditari de cèl·lules renals associat a una translocació cromosòmica. N Engl J Med. 1979;301:592–595.

27. Foster RE, Abdulrahman M, Morris MR, et al. Caracterització d'una translocació 3;6 associada a carcinoma de cèl·lules renals. Gens Cromosomes Càncer. 2007;46:311–317.

28. Gerlinger M, Horswell S, Larkin J, et al. Arquitectura genòmica i evolució dels carcinomes de cèl·lules renals de cèl·lules clares definits per seqüenciació multiregional. Nat Genet. 2014;46:225–233.

29. Turajlic S, Xu H, Litchfield K, et al. Les trajectòries evolutives deterministes influeixen en el creixement del tumor primari: TRACERx Renal. Cèl·lula. 2018;173:595–610. e511.

Cathy D. Vocke, Christopher J. Ricketts, Adam R. Metwalli, Peter A. Pinto, Rabindra Gautam, Mark Raffeld, Maria J. Merino, Mark W. Ball i W. Marston Linehan