Descobriment de nous inhibidors STING basats en l'estructura de l'agonista STING del ratolí DMXAA
Nov 27, 2023
Resum:
La proteïna del gen estimulador de l'interferó (STING) està implicada en la immunitat innata. El fàrmac DMXAA (àcid 5,6-dimetilxantenona-4-acètic) va demostrar ser un potent agonista del STING murin (mSTING), però va tenir poc efecte sobre el STING humà (hSTING). En aquest article, ens basem en la comparació de diferents estructures cristal·lines i l'anàlisi de les relacions d'interacció proteïna-lligant per aventurar la hipòtesi que el disseny de fàrmacs de variants de DMXAA té el potencial de convertir els agonistes de STING en inhibidors. A partir del nostre descobriment anterior de dos anàlegs de DMXAA, 3 i 4 (tots dos podrien unir-se a STING), els vam optimitzar estructuralment i vam sintetitzar nous derivats, respectivament. En els assajos d'unió, vam trobar els compostos 11 i 27 que representaven aglutinants STING que eren superiors a les estructures originals i vam discutir les relacions estructura-activitat. Tots els compostos objectiu estaven inactius en assajos cel·lulars per al cribratge de l'activitat agonista de STING. Afortunadament, vam identificar 11 i 27 com a inhibidors de STING amb activitat micromolar tant a les vies hSTING com a mSTING. A més, 11 i 27 van inhibir la inducció d'interferó i de citocines inflamatòries activades per 20 3 0 -cGAMP sense citotoxicitat aparent. Aquestes troballes trenquen el pensament rígid que DMXAA proporciona la base estructural específicament per als agonistes de STING i obre més possibilitats per desenvolupar nous agonistes o inhibidors de STING.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Paraules clau:
STING; DMXAA; selectivitat d'espècies; agonista de STING; Inhibidor de STING
1. Introducció
El gen estimulador de l'interferó (STING) és una molècula de senyalització essencial per a la immunitat intrínseca, que media principalment les respostes immunes naturals induïdes per l'ADN citoplasmàtic [1]. Quan el receptor d'ADN guanosina-adenosina fosfat sintasa cíclica (cGAS) detecta ADN intracel·lular de doble cadena, el cGAS catalitza la síntesi del 2 0,{30 -cGAMP (Figura 1), un dinucleòtid cíclic (CDN) capaç d'unir-se directament i activar STING al reticle endoplasmàtic [2-4]. Després de l'activació, STING forma agregats que es recluten aigües avall a la quinasa d'unió a TANK 1 (TBK1) i s'uneixen al factor regulador de l'interferó 3 (IRF3), que fosforila IRF3, activa els dímers IRF3 al nucli, indueix l'expressió d'interferó de tipus I (IFN) i inicia una resposta immune d'interferó [1]. Molts estudis han demostrat que STING està implicat en la patogènesi de múltiples malalties i que l'estimulació de STING indueix respostes immunitàries efectives a infeccions patògenes i càncers; tanmateix, la manca de modulació de la senyalització inflamatòria crònica condueix a malalties autoimmunes i inflamatòries [5–8]. A causa del paper fonamental de STING en la regulació de la immunitat innata, un gran nombre d'equips han començat a desenvolupar agonistes o inhibidors de STING.
Figura 1. Moduladors STING representatius
La investigació sobre agonistes STING de primera generació es va centrar en la modificació estructural dels anàlegs de CDN per evitar algunes limitacions dels CDN endògens, com ara la mala permeabilitat de la membrana i la susceptibilitat a la hidròlisi per fosfatases [9,10]. La petita molècula STING agonista 5, 6-dimetilxantenona-4-àcid acètic (DMXAA), que ha mostrat una promesa terapèutica contra els tumors sòlids en models de ratolí, podria contrarestar els inconvenients dels derivats de CDN [11]. Tanmateix, el fàrmac va fracassar en els assaigs clínics en humans [12]. A més, s'afirma que la DMXAA s'uneix selectivament a la STING murina (mSTING) en lloc de la STING humana (hSTING) [13, 14], cosa que impedeix el potencial terapèutic de la DMXAA en humans. La 10-carboximetil-9-acridinona (CMA) és un altre agonista STING representatiu específic de la mòrida utilitzat com a potent inductor d'IFN de tipus I per a la teràpia antiviral a principis dels anys setanta [15]. Per tant, la selectivitat d'espècies és un factor vital en el desenvolupament d'agonistes STING de molècules petites. Els esforços incansables dels investigadors, inclosos diABZI, SR717, MSA02 i altres [16–19] s'han posat a la vista agonistes substancials de l'esquelet hSTING.
Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari
L'evidència creixent mostra que la hiperactivació de STING està associada a malalties autoinflamatòries i autoimmunes. Cal limitar l'activació excessiva de la via de senyalització STING, la qual cosa posa de manifest el valor potencial dels inhibidors de STING. En contrast amb els agonistes de STING, el desenvolupament d'inhibidors de STING encara està en la seva infància, però encara no hi ha candidats a fàrmacs que han entrat en estudis clínics. Els inhibidors de STING coneguts inclouen dos tipus de compostos: antagonistes competitius (SN-011 i Merck{-18) i inhibidors covalents (H151) [20–22]. Els inhibidors de STING covalents identificats anteriorment interaccionen amb Cys88/91 o Cys91 que es troba al domini transmembrana N-terminal de STING fora de la butxaca d'unió a CDN [22]. Recentment, dos equips han informat successivament dos tipus estructurals d'antagonistes de STING que ocupen la butxaca d'unió de 20 3 0 -cGAMP per inhibir l'activació de 20 3 0 -cGAMP, cosa que suggereix un efecte de doble tall a la butxaca d'unió de CDN [20]. ,21].
Aquí oferim una nova perspectiva. Suggerim que la butxaca inferior on es troben DMXAA i CMA faciliti el desenvolupament d'inhibidors de STING basant-se en la nostra extracció de dades profunda i la comparació de la informació de l'estructura co-cristal de les proteïnes STING identificades. El nostre estudi anterior va informar d'una sèrie d'anàlegs de CMA i DMXAA i va identificar els compostos 3 i 4 que s'uneixen a hSTING però amb una potència cel·lular feble [23] (figura 2).
Figura 2. Estructures químiques dels compostos 3 i 4 amb dades de les seves activitats biològiques. Els valors EC50 dels compostos 1-4 es van mesurar per cèl·lules informadores STING i els IC50 d'unió es van mesurar mitjançant kits d'unió de competició STING.
En aquest article, pel que fa al disseny d'inhibidors de STING per descobrir agents d'unió més potents amb més contactes a la butxaca inferior, vam realitzar optimitzacions estructurals per a 3 i 4, respectivament. Posteriorment, vam realitzar un estudi SAR basat en assajos d'unió a la competència. En l'avaluació de la bioactivitat, els compostos 11 i 27 van actuar com a aglutinants d'ampli espectre i van mostrar nivells micromolars d'activitat inhibidora de STING en múltiples cèl·lules informades. Pel que fa a l'estructura d'acoblament, dues molècules del compost 11 contenen hSTING en una conformació "oberta" inactiva, inhibint així competitivament la unió endògena de 20 3 0 -cGAMP, que és similar a l'estructura cristal·lina de Merck-18 i l'estructura d'acoblament. de SN-011 [20,21].
2. Resultats
2.1. Estratègia de disseny de derivats DMXAA com a inhibidors de STING
2.1.1. Identificació de llocs de disseny per a inhibidors de STING mitjançant la comparació de diferents estructures cristal·lines
L'apo-proteïna del domini d'unió al lligand STING (LBD) es va cristal·litzar com un dímer simètric en el no lligand, que es va demostrar que no era causat per la filtració en gel i l'anàlisi analítica d'ultracentrifugació [24-26]. El dímer STING adopta una conformació semblant a una papallona amb el lloc d'unió del lligand situat a la interfície entre els dos monòmers. En primer lloc, aquest article examina els mecanismes d'infraestructura i d'activació de les proteïnes hSTING i mSTING, comparant les diferències entre elles, així com desvetllant algunes idees intrigants. Per a l'estructura apo, la conformació natural d'ambdues proteïnes mostra que el mSTING està més concentrat que el hSTING (figura 3). Shih et al. van emprar simulacions de dinàmica molecular (MD) per estudiar les diferències entre hSTING i mSTING, demostrant que hSTING prefereix una conformació oberta-inactiva i mSTING prefereix una conformació tancada-activa fins i tot sense un lligand [27].
Quan s'uneix a 20,30 -cGAMP, la transició conformacional de l'hSTING és oberta (apo-proteïna, distància lateral ~ 57 Å) a tancada (proteïna lligada a cGAMP, distància lateral ~ 40 Å), mentre que el contrari és cert per a mSTING (29 Å a 40 Å). L'estructura d'apo-hSTING difereix molt de la d'apo-mSTING, però les estructures de l'STING complexos amb 20,30 -cGAMP se superposen. DMXAA, CMA i cGAMP són agonistes de STING amb diverses bastides estructurals, però les seves conformacions d'activació en unir-se a proteïnes mSTING també són essencialment les mateixes (figura 3). Els escenaris descrits anteriorment testifiquen que els mecanismes d'estimulació de hSTING i mSTING són sorprenentment divergents; les conformacions activades per STING són, tanmateix, relativament constants, independents de la selectivitat de les espècies i del tipus de columna vertebral agonista (tot i que es limiten als agonistes de STING que provoquen canvis conformacionals). Els volums de butxaca d'unió dels diferents complexos de cristalls són generalment convergents (~ 300 Å3, taula S1), cosa que és una prova més de l'estabilitat de la conformació d'activació de la proteïna STING.
Figura 3. Comparació d'estructures cristal·lines STING lligades a apo i compostos. La proteïna mSTING és blat (distància provada amb línia vermella), codi PDB: 4KC0 (apo), 4LOJ (bound-cGAMP), 4LOL (bound-DMXAA) i 4JC5 (bound-CMA)
En segon lloc, a partir de les troballes anteriors de l'estabilitat conformacional d'activació, hem superposat estructures co-cristallines del cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 i MSA02, que són agonistes de STING conformacionals tancats, per explorar la posició dels diferents agonistes estructurals en el Llocs d'unió de proteïnes STING. La butxaca de proteïnes es pot dividir en dues regions: la butxaca inferior i la butxaca superior, seguint la distribució dels agonistes de STING a la butxaca de proteïnes (figura 4a). Excepte que els agonistes de mSTING DMXAA i CMA estiguin completament a la butxaca inferior, els altres agonistes podrien activar la via hSTING i es troben a la regió superior. A continuació, vam mapejar les interaccions dels cinc agonistes STING amb residus d'aminoàcids units a la proteïna STING (dins de 5 Å del lligand; Figura S1), mostrant que els aminoàcids primaris incloïen R238, Y167, R232, S162, T263 i T267. (el número de seqüència de residus corresponent a mSTING menys un). L'associació seqüencial dels residus amb les butxaques va mostrar que T267, T263 i S162 es troben a la butxaca inferior; la butxaca superior conté R238, R232 i Y167 (figura 4b). Com s'ha informat, R238, Y167 i R232 són essencials per a la unió de l'agonista a STING, especialment R238 (la proteïna mSTING correspon a R237), la mutació de la qual donaria lloc a una pèrdua completa d'estabilització (unió de lligands) [28–30]. Che et al. també va revelar que el residu de clau R238 domina la unió de DMXAA i les mutacions puntuals (S162A/E260I) poden millorar la interacció de R238 amb DMXAA mitjançant simulacions MD [31].
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Per ocupar la butxaca de proteïnes mSTING, DMXAA o CMA van adoptar un mode d'unió únic en què dos agonistes de molècules petites s'uneixen a un únic homodímer mSTING. Els DMXAA es munten fermament a la butxaca inferior mitjançant enllaços d'hidrogen entre el grup ceto i la cadena lateral T266 (hSTING correspon a 267), mentre que el grup carboxilat interacciona amb les cadenes laterals R237 i T262 (figura 5a). La interacció de DMXAA amb R237 (l'únic aminoàcid clau a la butxaca superior) és crucial per a l'activitat de mSTING. Un detall que sovint es passa per alt és que DMXAA només pot actuar sobre R237 de proteïnes monomèriques simètriques, per exemple, DMXAA (molècula A) que afecta R237B (figura 5a). Com que DMXAA es troba a la part inferior, la distància entre la molècula A i R237B és de 3, 06 Å, mentre que la distància a R237A és superior a 5 Å (figura 5b). Beneficiant-se de la butxaca més compacta de la proteïna mSTING, DMXAA interacciona sense esforç amb R237 del monòmer mSTING simètric, però no hi ha manera que DMXAA s'associ amb cap dels R238 de la proteïna apo-hSTING conformacionalment oberta (figura 3). Per tant, la posició de butxaca de DMXAA perjudica l'estimulació de la via hSTING. Recentment, Merck, inspirat en la relació d'unió 2:1 de DMXAA, ha descobert antagonistes de STING capaços d'ocupar la butxaca d'unió [21]. El complex de cristalls de la proteïna Merck 18 i hSTING mostra que el compost es troba principalment a sota de la butxaca de proteïnes i interacciona amb S162, T263 i T267, tots els quals coincideixen amb les propietats de DMXAA (figura 5c). A partir d'això, es van generar hipòtesis: la butxaca superior és una cavitat excel·lent per dissenyar agonistes STING; la butxaca inferior és un niu més adequat per als inhibidors, i l'estructura de DMXAA o CMA està optimitzada per tenir el potencial de convertir-se en un antagonista de STING.
Figura 4. Subdivisió dels llocs d'unió de STING i distribució amb aminoàcids clau. ( a ) Ubicació de dues regions al monòmer STING. La butxaca inferior és de color magenta i la butxaca superior és verda. Els codis PDB per als complexos de cristalls superposats són els següents: 4LOH (cGAMP, verd), 6UKV (MSA-02, groc), 6XNP (SR717, taronja), 4LOL (DMXAA, magenta) i 4JC5 (CMA, porpra). (b) Distribucions dels aminoàcids clau a les regions superior i inferior. Els residus de la butxaca inferior es mostren en magenta i els verds a la regió superior.
Figura 5. Complexos cristal·lins de DMXAA i Merck 18. (a) Contactes intermoleculars al complex de DMXAA i mSTING. El DMXAA lligat es mostra en color gris, amb subunitats STING individuals al dímer simètric que es mostra en verd i violeta. Els superíndexs A i B indiquen la identitat del monòmer proteic o del lligand individual. (b) Distàncies entre els residus clau R237A i R237B, respectivament, i DMXAA (molècula A). R237A al carboxil de DMXAA és de 6,02 Å, R237B al carboxil de DMXAA és de 3,06 Å. ( c ) Estructura cristal·lina de Merck 18 unida a la proteïna hSTING (PDB 6MXE) i detalls dels seus contactes intermoleculars. El lligand lligat es mostra en color gris, amb subunitats STING individuals al dímer simètric que es mostra en verd i morat. Els superíndexs A i B indiquen la identitat del monòmer proteic o del lligand individual
Figura 6. Bases de recerca i els nostres hotspots optimitzats per a derivats DMXAA i CMA. ( a ) Superposició de l'estructura de DMXAA lligada a mSTING (PDB: 4LOL, mostrada en blau fosc) amb l'estructura de DMXAA lligada a hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, mostrada en taronja). (b) Detalls de DMXAA lligat a hSTING mutat (PDB: 4QXR). Els quadres de línia discontínua representen els llocs de modificació potencials. Els residus amino mostrats en verd són residus mutats (S162A/Q266I).
Vam trobar que la incapacitat de DMXAA per activar la via d'allotjament estava relacionada amb la ubicació de DMXAA a la butxaca inferior (segons la secció 2.1.1), que també ens va proporcionar la idea de disseny dels inhibidors de STING: augmentar els contactes dels derivats de DMXAA. amb la regió inferior mitjançant modificacions estructurals per mantenir STING en una conformació no activada. S162 i Q266 es troben adequadament a la part inferior del lloc d'unió, de manera que els DMXAA poden estar ben posicionats en contacte directe amb tots dos, facilitant l'exploració de l'efecte dels aminoàcids de butxaca inferior sobre els lligands. L'anàlisi de les relacions estructura-activitat (SAR) va revelar que la part 5,6-dimetil i la posició C7-metoxi eren crucials per a l'activitat biològica de 3 i 4. Com es mostra a la figura 6b, el 5 ,6-el grup dimetil va crear interaccions hidrofòbiques amb múltiples aminoàcids a la butxaca inferior; a causa de la proximitat de la posició C7 de DMXAA a l'aminoàcid Q266, la modificació metoxi corresponent va permetre que 3 i 4 s'unís a l'allotjament. Per tant, les nostres elaboracions estructurals pressuposaven el bloqueig de 5,6-dimetil i metoxi C7, i el disseny de nous derivats es va centrar a modificar el grup polar a la posició C1/C2 (afectant S162) i canviar el grup d'àcid carboxílic ( ampliant la diversitat estructural). Hem dissenyat i sintetitzat una sèrie de derivats utilitzant els compostos 3 i 4 com a bastides, validant així la nostra conjectura inhibidora proposada.
2.2. Química
La preparació de tots els compostos intermedis i objectiu es descriu a l'Esquema 1. 1-metoxi-2,3-dimetil-4-nitrobenzè (5) i 2-àcid bromobenzoic ( 7) estaven disponibles comercialment. Inicialment, el 1-metoxi-2,3-dimetil-4-nitrobenzè es va convertir en 4-metoxi{- 2,3-dimetilanilina (6) mitjançant reducció amb pols de ferro. Aleshores, 6 i 7 van ser sotmesos a la reacció d'Ullmann amb carbonat de potassi amb catàlisi per coure i òxid de coure (I) en N, N-dimetilformamida per proporcionar l'intermedi 8 corresponent. La reacció de condensació intramolecular de 8 es va realitzar amb el reactiu d'Eaton per proporcionar un intermedi 2-metoxi-3,4-dimetilacridina-9(10H)-ona (9). La substitució posterior de 9 es va realitzar amb bromoacetat d'etil, i la pèrdua d'1 equiv de HBr va produir etil 2-(2-metoxi{-3,4-dimetil-9- oxoacridina-10(9H)-il)acetat (10). Finalment, l'acetat d'etil en 10 es va hidrolitzar a àcid carboxílic mitjançant hidròxid de sodi donant 2-(2-metoxi{-3,4- dimetil-9-oxoacridina-10 àcid (9H)-il)acètic (11).
Esquema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. reactiu d'Eaton; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCl3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Per a la síntesi posterior de més compostos objectiu, primer hem de sintetitzar el compost 2-amino-5-metoxi{-3, 4-àcid dimetilbenzoic (14). 6 es va fer reaccionar amb hidrat de cloral i hidroxilamina, formant acetamida i hidroxiamino, amb l'intermedi (E)-2-(hidroxilamina)-N-(4-metoxi{-2,3-dimetilfenil )acetamida (12). La posterior reacció de reordenació de Beckmann de l'hidroxiamino de 12 es va realitzar amb àcid sulfúric per obtenir el derivat de lactama 13. Finalment, l'intermedi 13 es va hidrolitzar amb peròxid d'hidrogen i hidròxid de sodi en solució d'etanol donant 14. Utilitzant 14 com a material de partida per a la reacció, va sintetitzar a més una sèrie de 8-metoxi-9,10-dimetil-6hipirrolo[3,2,1-de]acridina-1,6( Derivats de 2H)-diona amb substituents a R1 i R2. Inicialment, 14 i 15-19 van ser sotmesos a la reacció d'Ullmann amb carbonat de potassi amb catàlisi per coure i òxid de coure (I) en N, N-dimetilformamida per proporcionar els intermedis corresponents 20-24. Les reaccions de condensació intramolecular de 20-24 es van realitzar amb el reactiu d'Eaton per produir 8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,{{46} Derivats de la }de]acridina-1,6(2H)-diona (25–29). De la mateixa manera, utilitzant 14 com a material de partida per a la reacció, vam sintetitzar una sèrie de 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo{-9,{{ 59}}dihidroacridina-4- derivats de l'àcid carboxílic amb substituents a R. Inicialment, 14 i 7 o 30 van ser sotmesos a la reacció d'Ullmann amb carbonat de potassi amb catàlisi per coure i òxid de coure (I) en N, N-dimetilformamida per proporcionar intermediaris corresponents 31 i 32. Les reaccions de condensació intramolecular de 31 i 32 es van realitzar amb el reactiu d'Eaton per obtenir 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo{-9 ,10-dihidroacridina-4-derivats de l'àcid carboxílic (33,34). Així, vam dissenyar, sintetitzar i seleccionar 16 anàlegs d'acridona, les estructures dels quals es resumeixen a la taula 1.
Taula 1. Estructures dels nous anàlegs del present estudi.
2.3. Potències d'unió dels nous compostos a STING i els seus SAR
Potències d'unió de nous compostos a STING i els seus SAR Per confirmar directament l'eficàcia de la modificació estructural, primer vam examinar tots els compostos sintetitzats mitjançant assajos de desplaçament de cGAMP. A més de la selectivitat d'espècies, hi ha cinc variants de STING que són polimòrfiques en humans, R232 (WT, 58% de la població), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) i Q ( 2%) [32]. Per tant, vam utilitzar els kits d'assaig de competició comercial mitjançant tecnologia de fluorescència homogènia resolta en temps (HTRF) per provar la potència bioquímica de nous compostos en mSTING i diverses isoformes hSTING (WT, H232 i AQ) i les vam comparar amb el control. Com s'esperava, els compostos de control 1-4 estaven tots units a mSTING; de la pantalla hSTING, els compostos 3 i 4 tenien valors IC50 a nivell micromolar.
Taula 2. Resultats de compostos amb diverses isoformes hSTING i assajos d'unió de competició mSTING.
Primer, a partir del compost 3, es va introduir un àtom d'halogen o un grup metoxi al lloc C1/C2 (taula 1). El compost 27, com a derivat òptim del compost 3 (posició C1 substituïda per F), té una millor activitat global que el compost 3 (activitat micromolar d'un dígit en tots els assajos bioquímics, taula 2). El compost R1-modificat 25 té un efecte d'unió d'espectre ampli, però no és tan actiu com la versió substituïda o no substituïda per F. En comparació amb el compost 3, els compostos (26, 28 i 29) amb el grup introduït al lloc C2-va mostrar diferents graus de disminució de l'afinitat d'unió, especialment el compost 29. En segon lloc, mantenint la columna vertebral del compost 4 i substituint l'àtom d'halogen contra el lloc C1/C2, vam obtenir els compostos 35-38 (taula 1). Aquests compostos eren inactius en els quatre assajos de desplaçament a concentracions de fins a 100 µM, demostrant que no es tolera la substitució amb un àtom d'halogen al lloc C1/C2. A continuació, vam convertir el grup acetat del compost 4 en un grup carboxil (33) i vam introduir metoxi al lloc C2 (34). Malauradament, aquest canvi va ser un fracàs, ja que ambdós compostos van romandre inactius. Aprenent del nostre fracàs, vam explorar encara més els SAR dels derivats del compost 4 canviant el grup acetat a la posició N i deixant les posicions C1/C2 sense modificar. El compost 11 mostra la unió a una àmplia gamma de variants STING, totes amb IC50 per sota de 20 µM; l'activitat és superior al compost 4 i comparable al compost 27. A més, el compost 9 (sense grup carboxil al lloc N) i el compost 10 (N-acetat etil) són precursors sintètics del compost 11 que no poden unir-se a STING, demostrant indirectament la importància del grup dels àcids carboxílics.
2.4. Avaluació Biològica Cel·lular
2.4.1. Projecció in vitro de nous anàlegs amb activitats agonistes de STING
Vam examinar sistemàticament tots els compostos per a l'activitat agonista de STING mitjançant les línies cel·lulars reporters 293T hSTING-WT, 293T-mSTING i THP1-KO-STING (proporcionades per Invivo Gen). Utilitzant cèl·lules 293T-hSTING-R232 i cèl·lules 293T-mSTING, vam mostrar l'activació de la via IRF com a mesura indirecta de la inducció d'IFN tipus I mitjançant el seguiment de l'activitat de la fosfatasa alcalina embrionària secretària (SEAP), contribuint al nostre estudi de la selectivitat d'espècies de la compostos. Les cèl·lules THP1-KO-STING es van generar a partir de cèl·lules THP1-duals mitjançant una eliminació estable del gen STING, i vam utilitzar cèl·lules THP1-KO-STING per confirmar si el compost presenta la funció de la inducció de citocines depenent de STING. Hem comparat les activitats agonistes de STING de tots els derivats dirigits amb les dels agonistes de referència per a STING murins (DMXAA) i humans (20,30 -cGAMP). Sorprenentment, cap dels compostos sintetitzats podria activar les vies hSTING o mSTING (concentració màxima a 200 µM), cosa que és greument incompatible amb els resultats dels assajos d'unió. Per tant, els nostres agents d'unió STING seleccionats poden tenir patrons d'unió potencials com a nous antagonistes de STING.
2.4.2. Cribratge in vitro d'aglutinants STING amb activitats inhibidores de STING
Primer, vam fer preexperiments: amb l'inhibidor covalent H151 d'1 µM com a referència positiva, vam explorar els seus nivells inhibidors en línies cel·lulars reporters mSTING i hSTING cocultivades amb diferents concentracions de 20 3 0 -cGAMP per determinar les condicions òptimes. per a la detecció de l'inhibidor (vegeu la secció 4.2.3 per als detalls del protocol). En segon lloc, vam examinar inicialment la potència inhibidora dels nous compostos mitjançant el tractament amb els mètodes preexperimentals a una concentració de 100 µM. Vam trobar que els compostos d'unió a STING d'ampli espectre 11 i 27 presentaven una excel·lent inhibició tant en cèl·lules reporters de STING murines com humanes, amb els compostos 3 i 4 i els altres compostos no eren tan efectius. En tercer lloc, establim gradients de concentració per als compostos 11 i 27 per provar els dos valors IC50 i comparar-los amb H151. Els compostos 11 i 27 estaven actius a concentracions micromolars inhibint l'expressió d'IFN induïda per 20 3 0 -cGAMP tant a les vies hSTING com a mSTING.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Amb valors IC50, el compost 11 (hSTING 19,93 µM i mSTING 15,47 µM) va superar el compost 27 (hSTING 38,75 µM i mSTING 30,81 µM) (figura 7a). En comparació, els valors IC50 de H-151 a les cèl·lules 293T-hSTING i 293T-mSTING eren 1,04 i 0,82 µM (figura 7a), cosa que indica que l'inhibidor covalent H-151 presenta un millor efecte inhibidor sobre STING - Senyalització dependent en assaigs basats en cèl·lules. Per confirmar encara més la propietat inhibidora dels compostos 11 i 27, hem emprat una altra línia cel·lular reportera de monòcits humans THP1-Dual-hSTING-R232, que utilitza un sistema de reporter dual per informar sobre l'activació de l'IRF. com a mesura indirecta de la inducció d'IFN tipus I i de l'activació de NF-κB com a mesura indirecta de la inducció de citocines proinflamatòries. Després de l'estimulació de la línia cel·lular reportera THP-1 amb 20,30 -cGAMP, vam afegir inhibidors de STING amb concentracions adequades per inhibir les induccions d'IFN I i de citocina proinflamatòria. Com s'esperava, els compostos 11, 27 i H151 van inhibir significativament les activacions de la via IRF i NF-κB desencadenadas per STING (figura 7b). A més, per excloure l'efecte de la citotoxicitat dels compostos sobre l'activitat inhibidora, hem utilitzat el kit CellTiter-Glo per analitzar l'activitat cel·lular. Afortunadament, els compostos 11 i 27 no van mostrar cap evidència de citotoxicitat per a les cèl·lules 293T i THP-1 mitjançant un assaig de viabilitat cel·lular quan s'afegeixen a concentracions (de 5 a 100 µM) que inhibeixen STING, en contrast amb H151, que ja mostrava una citotoxicitat significativa a 10 µM (figura 7c). Aquests estudis van identificar els compostos 11 i 27 com a inhibidors moderats de STING, trencant la sensibilitat de les espècies i inhibint les vies duals IRF i NF-κB sense citotoxicitat aparent.
2.5. La base estructural de l'activitat del compost 11 es va investigar mitjançant l'acoblament
El mecanisme dels antagonistes competitius de STING és ocupar el lloc d'unió i alterar la conformació d'activació de la proteïna STING [20, 21]. Específics de hSTING, els antagonistes deixen el dímer hSTING en una conformació "oberta". Hem utilitzat l'acoblament Glide per determinar la interacció entre STING CTD humà (codi d'identificació PDB 6MXE) i el millor compost actiu 11. A l'estructura d'acoblament, els dos compostos 11 són parcialment paral·lels entre si i es troben a la part inferior de l'escletxa de el dímer hSTING (figura 8a), bloquejant hSTING en una conformació oberta inactiva (figura S2). El compost 11 produeix principalment interaccions hidrofòbiques, amb l'estructura tricíclica del lligand que permet més contacte amb la interfície de la butxaca inferior. Igual que amb DMXAA o CMA, el grup carboxil forma un enllaç d'hidrogen amb la cadena lateral de T263, mentre que el grup ceto forma un enllaç d'hidrogen amb la cadena lateral de T267. El metoxi a la posició C2 interacciona íntimament amb S162, donant lloc a una proximitat lligand-lligant l'un cap a l'altre. Els substituents bis-metil no només generen interaccions lligand-lligant, sinó que també es troben convenientment situats a l'entrada de la butxaca superior, cosa que impedeix la unió dels agonistes naturals de STING als residus clau (figura 8b).
Figura 7. Els aglutinants STING d'espectre ampli 11 i 27 són antagonistes de STING. ( a ) Estructures químiques dels compostos 11 i 27 i l'activitat inhibidora dels inhibidors de STING contra les vies m- i h- STING. Les cèl·lules 293T (mSTING o hSTING), pretractades amb diferents concentracions de compostos, van ser estimulades per 20,30 -cGAMP; La inhibició de l'activitat de la via IRF es va mesurar indirectament mitjançant valors de densitat òptica (OD). La corba inhibidora depenent de la dosi es va ajustar per calcular els IC50s dels compostos. ( b ) Els compostos 11 i 27 poden inhibir l'activació de les vies duals hSTING. Les línies cel·lulars informadores THP1-hSTING-R232 es van estimular amb 20,30 -cGAMP i es van tractar amb els compostos, inhibint la inducció d'IFN (avaluant l'activitat per les unitats de llum relatives (RLU) de Lucia luciferase ) i inducció de citocines proinflamatòries (vigilant l'activitat de SEAP mesurada per valors de DO). ( c ) Els nous anàlegs presenten una citotoxicitat baixa en comparació amb l'inhibidor covalent. Les cèl·lules 293T (o THP-1) es van incubar amb la concentració indicada d'inhibidors durant els períodes de temps indicats. La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant els kits CellTiter-Glo. Les dades mostrades són la mitjana de tres experiments independents. NS (no significatiu) p > 0,05, *** p <0,001. Els valors de p es van calcular mitjançant una prova t de dues cues.
Figura 8. Estructura d'acoblament del compost 11 unit a la proteïna STING. (a) Mode d'unió del compost 11. El lligand lligat es mostra en color gris, amb subunitats STING individuals al dímer simètric que es mostra en verd i violeta. A les butxaques d'enquadernació del monòmer STING, la part inferior és de color magenta i la part superior és verda. (b) Els contactes intermoleculars del compost 11 estan units a STING. El compost 11 i els aminoàcids STING contactats es mostren com a model de pal. Els contactes intermoleculars i els enllaços d'hidrogen es mostren amb una línia discontínua groga. Els superíndexs A i B indiquen la identitat del monòmer proteic o del lligand individual.
3. Discussió
A la llum dels amplis informes sobre el mecanisme i l'estructura cristal·lina de STING, tenim l'oportunitat d'explicar el problema científic de per què DMXAA no posseeix activitat agonística de STING humana. En aquest estudi, comparant diverses estructures cristal·lines STING, hem obtingut algunes troballes interessants: 1. La conformació d'activació de STING és estable; 2. Hi ha diferents mecanismes d'activació per a hSTING i mSTING; 3. DMXAA i CMA es troben a la part inferior del lloc d'unió distingint-los d'altres agonistes. Tenint en compte els diferents mecanismes d'activació de mSTING i hSTING, els agonistes de mSTING DMXAA o CMA situats a la butxaca inferior no poden exercir una activació en hSTING perquè apo-hSTING té una cavitat d'unió més gran que impedeix que el lligand s'associ amb R238.
Gao et al. va informar que les mutacions simples (G230I, S162A i Q266I) doten hSTING de la mateixa sensibilitat DMXAA que mSTING [33]. Les simulacions de MD van revelar que la cadena lateral G230I de la mutació de la regió de la tapa és suficient per formar una barrera estèrica per evitar l'excreció de DMXAA, mentre que DMXAA surt fàcilment a hSTING WT [27]. A partir de la modificació estructural corresponent a mutacions puntuals hSTING (S162A/Q266I) al lloc d'unió, s'han disposat d'anàlegs substancials de DMXAA i CMA, però no hi ha agonistes potents de hSTING. El motiu d'això podria ser que la subtil discrepància estructural entre els hSTING "naturals" i "mutats" podria tenir un paper crucial en el procés de reconeixement. Mitjançant simulacions de MD, Che et al. va trobar que els hSTING mutats de manera no natural pertorben els moviments coordinats de les molècules d'aigua i alteren la quantitat d'aigua expulsada després de la unió del lligand, cosa que és més propici per restaurar l'activació DMXAA de hSTING [31].
Encoratjats pel descobriment de l'estudi d'inhibidors de STING al lloc d'unió inferior [21], ens atrevem a preveure que DMXAA, situat a la mateixa regió, té el potencial de transformar-se en nous inhibidors de STING. En un estudi anterior, vam fusionar les estructures de DMXAA i CMA amb modificacions estructurals subtils i vam descobrir amb èxit 3 i 4 que podrien unir-se a hSTING, però la seva feble activitat agonista STING no coincideix amb la seva potència d'unió. En aquest article, la idea de disseny és millorar encara més els contactes dels anàlegs DMXAA amb la butxaca inferior per resistir competitivament la unió de 20,30 -cGAMP, de manera que hem dissenyat i sintetitzat estructures optimitzades dels compostos 3 i 4.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
El primer pas de cribratge va ser provar l'activitat bioquímica mitjançant els kits d'unió de múltiples variants de STING per caracteritzar la potència d'unió dels nous derivats. Els resultats dels assajos d'unió van demostrar la solidesa de les nostres direccions de disseny; vam identificar 11 i 27 com a aglutinants STING d'ampli espectre (superiors als 3 i 4) i vam discutir els SAR. Per als anàlegs del compost 3, les modificacions a la posició C1 van millorar significativament la unió a diverses variants de STING, mentre que els compostos C2-modificats no van tenir cap efecte. Tanmateix, el compost 4 no va ser ben tolerat per a modificacions estructurals en C1/C2. Després de reubicar la posició d'àcid carboxílic (C4 a N), vam trobar el millor aglutinant STING 11 i vam determinar que el grup d'àcid carboxílic era essencial per a l'activitat. A continuació, vam examinar tots els compostos per a l'activitat a nivell cel·lular mitjançant tres línies cel·lulars informadores i cap dels compostos objectiu era actiu. A continuació, vam establir un mètode de cribratge per als inhibidors de STING i vam tornar a examinar tots els nous anàlegs. Els agents d'unió STING 11 i 27 van mostrar activitats inhibidores micromolars, amb dades comparables a l'assaig d'unió competitiva. L'inhibidor covalent H151 va mostrar una activitat inhibidora de STING lleugerament millor que 11 i 27 in vitro. A més, vam validar encara més que 11 i 27 poden inhibir eficaçment l'activació induïda per 20,30 -cGAMP de les vies duals STING. El més impressionant és que 11 i 27 mantenen un alt nivell de viabilitat cel·lular a altes concentracions, cosa que no és possible amb H151. La citotoxicitat és un problema comú amb els inhibidors covalents i limita l'aplicació de H151.
Mitjançant l'anàlisi de l'acoblament, hem adquirit una visió de la base estructural de la millor activitat del compost actiu 11. El compost 11 ocupa perfectament la butxaca inferior, mantenint hSTING en una conformació oberta inactiva i, per tant, inhibint competitivament la unió 20,30 -cGAMP. L'estructura de l'anell tricíclic de l'acridina és clau per generar interaccions hidrofòbiques, amb el grup d'àcid carboxílic i la part cetona ancorant el compost a la part inferior de la butxaca. Especulem que el metoxi produeix associacions íntimes amb el S162, tancant la conformació de la proteïna tancada marginalment però no prou per convertir-la en una conformació agonista. L'estructura de bis-metil crea un bloqueig de llocs espacials que millora les interaccions lligand-lligant i disminueix l'entrada d'agonistes a la butxaca superior. Actualment, no hi ha estructures co-cristalls reportades d'antagonistes de mSTING i STING, de manera que no podem explicar el mecanisme d'acció del compost 11 amb mSTING mitjançant un enfocament d'acoblament. Tanmateix, conjecturem que hi ha dues possibilitats: una és que el principi d'actuació és idèntic al de hSTING; l'altra és que el compost 11 manté mSTING en una conformació apo més agregada i 20,30 -cGAMP no pot entrar a la butxaca per exercir l'efecte agonístic. En resum, les nostres optimitzacions estructurals subtils dels agonistes de STING més febles han revertit amb èxit la funció biològica per descobrir inhibidors de STING. Aquestes troballes il·lustren la complexitat de les butxaques d'unió de STING i proporcionen noves idees de recerca per al desenvolupament de fàrmacs d'agonistes o inhibidors de STING.
4. Materials i Mètodes
4.1. Química
Els dissolvents i reactius utilitzats en la síntesi es van obtenir de Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Xina). Les estructures dels productes es van identificar mitjançant espectroscòpia de RMN 1H i 13C (JNM-ECA-400, Japó). Els pesos moleculars dels productes es van mesurar mitjançant espectrometria de masses d'alta resolució (HRMS) amb ionització per electrospray (ESI) com a mode d'ionització (Agilent 1260-G6230A, Alemanya). Els espectres de RMN i de masses dels compostos es proporcionen als materials suplementaris. Els compostos 35-38 van ser sintetitzats i identificats per nosaltres; si us plau, consulteu l'article informat anteriorment per obtenir-ne més detalls [23].
{{0}}({2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoacridina{-10 (9H)-il)acetat (1{ {25}}): a una solució de 4-metoxi{{{0}},3-dimetilanilina (6) (0,97 g, 6,4 mmol) i 2-Àcid bromobenzoic (7) (1,29 g, 6,4 mmol) en DMF (6 ml) a temperatura ambient, posteriorment hem afegit Cu en pols (0.{05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) i K2CO3 ({{{{86}},71 g, 5,1 mmol). La mescla de reacció es va escalfar a 110 ◦C durant 12 h. Després de l'eliminació dels dissolvents al buit, el residu es va dissoldre en una solució de NaOH 1 N (25 ml). El producte brut es va obtenir per precipitació després de l'acidificació del filtrat amb conc. HCl. Després de l'assecat, el producte brut es va afegir al reactiu d'Eaton (5 ml) a temperatura ambient, i després la mescla es va escalfar a 90 ◦ C durant 1 h. La mescla de reacció refredada es va deixar caure en una solució aquosa saturada de NaHCO3. El precipitat es va filtrar per recollir el producte rugós. La purificació del residu per cromatografia en columna de gel de sílice va proporcionar 9, un sòlid groc pàl·lid (0,61 g, rendiment del 37,7%). Una solució de NaH (1,43 mmol) i 9 (0,33 g, 1,3 mmol) en DMF (5 ml) a temperatura ambient es va agitar durant 1 h i després es va refredar a 5-7 ◦C. El bromoacetat d'etil (0,43 g, 2,6 mmol) es va afegir a la mescla resultant i es va agitar contínuament a temperatura ambient durant 20 h. Un cop finalitzada la reacció (TLC), la barreja de reacció es va abocar en aigua amb gel (15 ml). Els precipitats resultants es van filtrar, es van assecar i després es van extreure amb cloroform. L'evaporació del dissolvent va donar un èster brut que es va purificar per recristal·lització per proporcionar 10, un sòlid groc (0,33 g, 76% de rendiment). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75–7,67 (m , 1H), 7,57–7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) , 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7,1 Hz, 3H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 129,52,81, 129,52,81, 129,52,81, 129,52,81 9,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C20H21NO4: 339,3910 trobat: 340,1546. 2-({2-metoxi{-3,{4-dimetil-9-oxoacridina{-10(9H)-il)acètic (11): una solució de 10 (0,37 g, 1,1 mmol) i NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) en etanol (20 ml) i aigua (2 ml) es van escalfar a 60 ◦ C durant 1 h. Després d'eliminar els dissolvents, el residu resultant es va dissoldre en aigua i es va filtrar. Després de neutralitzar el filtrat amb conc. HCl, la barreja es va filtrar per obtenir el sòlid brut, posteriorment es va recristal·litzar amb metanol per donar 11, una pols groc pàl·lid (0,29 g, 85,7% de rendiment). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8,5 Hz, 1H ), 7,69 (s, 1H), 7,67–7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6,8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 125,21,8, 125,15, 125,15,15,15 1,77, 96,02, 74,81, 55,69, 14,42, 13,33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H17NO4: 311,3370 trobat: 312,1229.
{{0}}cloro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo [3,2,{1-de]acridina{ {9}},6(2H)-diona (25): a una solució de 6-carboxi-4-metoxi{-2,3-dimetilbenzenamini (14) (1,3 g, 6,4 mmol) i àcid 2-({2-bromo{-4-clorofenil)acètic (15) (1,6 g, 6,4 mmol) en DMF (6 mL) a temperatura ambient, després hem afegit Cu en pols (0.05 g), Cu2O (0.{05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). La mescla de reacció es va escalfar a 110 ◦ C durant 12 h. Després de l'eliminació dels dissolvents al buit, el residu es va dissoldre en una solució de NaOH 1 N (25 ml). El producte brut es va obtenir per precipitació després de l'acidificació del filtrat amb conc. HCl. Després de l'assecat, el producte brut es va afegir al reactiu d'Eaton (5 ml) a temperatura ambient, i després la mescla es va escalfar a 90 ◦ C durant 1 h. La mescla de reacció refredada es va deixar caure en una solució aquosa saturada de NaHCO3. El precipitat es va filtrar per recollir el producte rugós. La purificació del residu per cromatografia en columna de gel de sílice va proporcionar 25, un sòlid groc (0,80 g, rendiment del 38,6%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,17 (d, J =8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,86 (d, J {= 6,9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H14ClNO3: 327,7640 trobat: 328,0734. 4-cloro-8-metoxi{-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1 ,6(2H)-diona (26): la síntesi d'aquest compost era similar a la 25. 15 es va substituir per 2-(2-bromo-5-clorofenil)àcid (16). Hem obtingut 0,82 g 26 com a sòlid de color groc pàl·lid amb un rendiment del 38,7%. 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 1H), 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H14ClNO3: 327,7640 trobat: 328,0734.
{{0}}fluoro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina{ {9}},6(2H)-diona (27): la síntesi d'aquest compost va ser similar a la 25. 15 es va substituir per àcid 2-({2-bromo{-4-fluorofenil)acètic (17). Hem obtingut un sòlid groc profund 27 amb 0,84 g (42,1% de rendiment). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,21 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} },5 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H14FNO3: 311,3124 trobat: 312,1030. 4-fluoro-8-metoxi{-9,{10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1 ,6(2H)-diona (28): La síntesi d'aquest compost va ser similar a la 25. 15 es va substituir per àcid 2-({2-bromo{-5-fluorofenil)acètic (18). Es van obtenir 0,81 g de sòlid groc profund (40,5% de rendiment). 1H RMN (400 MHz, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H14FNO3: 311,3124 trobat: 312,1030.
4,8-dimetoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1,6(2H )-diona (29): la síntesi d'aquest compost va ser similar a la 25. 15 es va substituir per 2-({2-bromo-5-metoxifenil)àcid acètic (19). Es va proporcionar {{20}},73 g de sòlid groc amb un rendiment del 35,2%. 1H RMN (400 MHz, DMSO D6) δ 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C19H17NO4: 323,3480 trobat: 324,1230. 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo{-9,10-dihidroacridina-4-àcid carboxílic (33): a una solució de 6-carboxi-4-metoxi{-2,3-dimetilbenzenamini (14) (1,30 g, 6,4 mmol) i 2-àcid bromobenzoic (7) (1,29) g, 6,4 mmol) en DMF (6 mL) a temperatura ambient, posteriorment vam afegir Cu en pols (0,05 g), Cu2O (0,05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). La mescla de reacció es va escalfar a 110 ◦ C durant 12 h. Després de l'eliminació dels dissolvents al buit, el residu es va dissoldre en una solució de NaOH 1 N (25 ml). El producte brut es va obtenir per precipitació després de l'acidificació del filtrat amb conc. HCl. Després de l'assecat, el producte brut es va afegir al reactiu d'Eaton (5 ml) a temperatura ambient, i després la mescla es va escalfar a 90 ◦ C durant 1 h. La mescla de reacció refredada es va deixar caure en una solució aquosa saturada de NaHCO3. El precipitat es va filtrar per recollir el producte rugós. La purificació del residu mitjançant cromatografia en columna de gel de sílice va proporcionar 33, un sòlid groc pàl·lid (1,00 g, 52,7% de rendiment). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J {= 9,7 Hz, 1H), 7,69 (d) , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H) ), 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C17H15NO4: 297,3100 trobat: 298,1073. Àcid 2,7-dimetoxi-5,6-dimetil-9-oxo{-9,10-dihidroacridina-4-carboxílic (34): el la síntesi d'aquest compost va ser similar a la del 33. El 7 es va substituir per l'àcid 2-bromo-5- metoxibenzoic (30). El sòlid groc va donar 1,05 g amb un rendiment del 50,2%. 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 1H), 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculat per a C18H17NO5: 327,3360 trobat: 328,1179.
4.2. Assaig biològic
Els kits d'enquadernació STING de ratolí, els kits d'enquadernació STING WT humans, els kits d'enquadernació AQ STING humans i els kits d'unió H232 STING humans es van comprar a Cisbio. Les cèl·lules 293T mSTING (ISG/KI-IFNb), les cèl·lules 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb), les cèl·lules THP1-KI-hSTING-R232, les cèl·lules THP1-KO-STING es van comprar a Invivogen. Les cèl·lules 293T mSTING i les cèl·lules 293T hSTING-R232 es van cultivar amb DMEM (Gibco, Waltham, MA, EUA), L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 4,5 g/L de glucosa (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocina (Invivogen, San Diego, CA, EUA) i complementat amb antibiòtics selectius (Invivogen). ) blasticidina (10 µM), higromicina (100 µM) i zeocina (100 µM). Les cèl·lules THP1-KO-STING i les cèl·lules THP1-KI-hSTING-R232 es van cultivar mitjançant RPMI-1640 (Gibco), L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), HEPES 25 mM (Sigma-Aldrich), 10% de FBS inactivat per calor (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM de normocina (Invivogen) i complementat amb antibiòtics selectius (Invivogen) blasticidina ( 10 µM) i zeocina (100 µM). La solució QUANTI-Blue, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP es va comprar a Invivogen. H151 es va obtenir de Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Xina). El kit d'assaig de viabilitat cel·lular luminescent CellTiter-Glo es va obtenir de Promega.
4.2.1. Assaig competitiu d'enllaç HTRF STING
Segons les instruccions dels kits d'unió STING, les solucions següents es van afegir successivament a cada pou de la placa 384-pou: 5 µL dels compostos de detecció o 2 0,30 -cGAMP (control positiu ) amb diferents concentracions o diluent (control negatiu); 5 µL de proteïna marcada amb STING 6His humana (es va afegir un pou de control negatiu al tampó de detecció); 10 µL de lligand STING d2 i solució de treball premesclada Anti 6His-Tb3+. Després de segellar la placa i incubar a temperatura ambient durant 3 h, es van llegir els valors de fluorescència a 665 nm i 620 nm. La relació de les dues intensitats de fluorescència (665 nm/620 nm) es va utilitzar per estimar la potència d'unió dels compostos. Els valors IC50 (concentració inhibitòria del 50%) es van calcular mitjançant el programari GraphPad Prism.
4.2.2. Assaig cel·lular per al cribratge de compostos per a l'activitat agonista
Es van distribuir quantitats de 180 µL de cèl·lules mSTING 293T, cèl·lules 293T hSTING-R232 i suspensió de cèl·lules THP1-KOTING en 96-plaques de fons pla amb una densitat de ~ 50,000 cèl·lules /pou (293T) o ~100,000 cèl·lules/pou (THP1). Es va afegir una quantitat de 20 µL de solució salina o una solució salina d'un compost de prova, o 20,30 -cGAMP com a referència positiva, i les cèl·lules es van incubar a 37 ◦ C amb un 5% de CO2 durant 48 h. Posteriorment, es va afegir una quantitat de 20 µL de sobrenedant a una placa de fons pla de 96-pou, seguida de 180 µL de solució QUANTI-Blue a cada pou. La placa es va incubar a 37 ◦ C durant 3 h i es van determinar els nivells de SEAP (l'activitat de la via IRF) mitjançant un espectrofotòmetre a 620-655 nm.
4.2.3. Assaig cel·lular per al cribratge de compostos per a l'activitat inhibidora
Preexperiment: 180 µL de cèl·lules mSTING 293T, cèl·lules 293T hSTING-R232 (~ 50, 000 cèl·lules/pou) es van estimular durant 48 h a 37 ◦ C en un Incubadora de CO2 al 5% amb 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) i 10 µL H151 (1,0 µM) ). Posteriorment, es va afegir una quantitat de 20 µL de sobrenedant a una placa de fons pla de 96-pou, seguida de 180 µL de solució QUANTI-Blue a cada pou. La placa es va incubar a 37 ◦ C durant 3 h i es van determinar els nivells de SEAP (l'activitat de la via IRF) mitjançant un espectrofotòmetre a 620-655 nm. 180 µL de cèl·lules mSTING 293T, suspensió de cèl·lules 293T hSTING-R232 es van distribuir en 96-plaques de fons pla amb una densitat de ~ 50,000 cèl·lules/pou. Una quantitat de 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3,125 µM) i el compost 11 o el compost 27 (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM Es van afegir µM) o H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) i les cèl·lules es van incubar a 37 ◦ C amb un 5% de CO2 durant 48 h. Posteriorment, es va afegir una quantitat de 20 µL de sobrenedant a una placa de fons pla de 96-pou, seguida de 180 µL de solució QUANTI-Blue a cada pou. La placa es va incubar a 37 ◦ C durant 3 h i es van determinar els nivells de SEAP (l'activitat de la via IRF) mitjançant un espectrofotòmetre a 620-655 nm. Els valors IC50 es van calcular mitjançant el programari GraphPad.
4.2.4. Assaig cel·lular per a la inhibició de les vies duals STING
Es van distribuir 180 µL de suspensió cel·lular THP1-KI-hSTING-R232 en plaques de fons pla de 96-pou amb una densitat de ~ 100,000 cèl·lules/pou. Es va afegir una quantitat de 10 µL 20,30 -cGAMP i 10 µL de compost 11 (20 µM) o compost 27 (33 µM) o H151 (2 µM) i les cèl·lules es van incubar a 37 ◦ C amb un 5% CO2 durant 24 h. Posteriorment, es va afegir una quantitat de sobrenedant a una placa 96-pou blanc (opaca), seguida de la solució QUANTI-Luc o QUANTI-Blue a cada pou, i es van llegir els nivells de luminescència o els nivells de SEAP segons les instruccions del fabricant. Això permet l'estudi simultani de la via del factor regulador de l'IFN (IRF), mitjançant l'avaluació de l'activitat de Lucia luciferase i la via NF-κB, mitjançant el seguiment de l'activitat de SEAP.
4.2.5. Assaig de viabilitat cel·lular luminescent CellTiter-Glo
La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant el kit d'assaig de viabilitat cel·lular luminescent CellTiter-Glo segons les instruccions del fabricant. Breument, les cèl·lules es van incubar amb tres concentracions diferents (5 µM, 10 µM, 100 µM) del compost 11 del compost 27 o H-151 durant 48 h. Es van afegir 100 µl de reactiu CellTiter-Glo a una placa d'assaig de 96-pou durant 10 min, i després es va registrar la luminescència.
4.3. Acoblament molecular del compost 11
L'estructura cristal·lina del complex STING (PDB ID: 6MXE) es va extreure d'una entrada del Banc de dades de proteïnes i es va utilitzar com a punt de partida. La proteïna es va preparar mitjançant la preparació de proteïnes de Maestro i es va dividir en cadena A i cadena B. Vam generar un lloc d'unió al LBD del monòmer STING basat en el lligand original (Merck-18) mitjançant la generació de quadrícula de receptors. Hem utilitzat la precisió SP de Glide-docking per a la part d'acoblament molecular, permetent que el compost 11 generi com a màxim 20 postures. Finalment, vam produir 16 conformacions lligades (totes a la butxaca inferior) i vam provar l'energia lliure d'unió dels complexos mitjançant el mòdul Prime MM-GBSA al programari de Schrödinger. A més, a partir de la puntuació d'acoblament, la puntuació del model de planeig i la puntuació de MMGBSA dG Bind, vam seleccionar la conformació òptima que va obtenir el primer punt de dos i el tercer classificat en un (es veu a la taula S2). Finalment, vam fusionar les millors conformacions de les cadenes A i B per obtenir l'estructura completa d'acoblament.
Referències
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING El reconeixement de l'ADN citoplasmàtic instiga la defensa cel·lular. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [Ref creuat]
2. Wu, J.; Sol, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ El GMP-AMP cíclic és un segon missatger endògen en la senyalització immune innata per part de l'ADN citosòlic. Science 2013, 339, 826–830. [Ref creuat]
3. Abe, T.; Barber, GN Mediada per ADN citosòlic i depenent de STING La inducció de gens proinflamatoris necessita l'activació canònica de NF-κB mitjançant TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [Ref creuat]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ La via cGAS-cGAMP-STING de detecció i senyalització d'ADN citosòlic. Mol. Cèl·lula 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ L'activació de la GMP-AMP sintasa cíclica per part de l'ADN propi provoca malalties autoimmunes. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Activitat antitumoral de cGAMP mitjançant l'estimulació de la resposta immune innata mediada per cGAS-cGAMP-STING-IRF3. Ciència. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA detecció d'ADN per la via cGAS-STING en salut i malaltia. Nat. Reverent Genet. 2019, 20, 657–674. [Ref creuat]
8. Zhang, H.; Tu, QD; Xu, XL Estimulador d'orientació dels gens d'interferó (STING): una perspectiva de química medicinal. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [Ref creuat]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Identificació i caracterització de fosfodiesterases que degraden específicament 30 3 0 -GMP-AMP cíclic. Res cel·lular 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF La via host STING a la interfície del càncer i la immunitat. J. Clin. Investig. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: un agent antivascular amb múltiples respostes de l'hoste. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [Ref creuat]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Assaig aleatoritzat de fase III controlat amb placebo de carboplatina i paclitaxel amb o sense l'agent disruptor vascular Vadimezan (ASA404) en càncer de pulmó avançat no de cèl·lules petites. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [Ref creuat]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Monjos, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. El ratolí, però no el STING humà, s'uneix i fa senyals en resposta a l'agent disruptor vascular 5, 6-dimetilxantenona-4-àcid acètic. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Els flavonoides anticancerígens són agonistes STING selectius per al ratolí. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Detecció específica de l'espècie del compost antiviral de molècules petites CMA per STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [Ref creuat]
16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Disseny d'agonistes del receptor STING d'amido benzimidazol amb activitat sistèmica. Natura 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Activitat antitumoral d'un mimètic de cGAMP no nucleòtid que activa STING. Science 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Efectiu, B.; et al. Un agonista STING no nucleòtid disponible per via oral amb activitat antitumoral. Science 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andreu, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Caracterització d'un nou agonista STING específic per a humans que provoca activitat antiviral contra alfavirus emergents. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sol, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. Els inhibidors de STING es dirigeixen a la butxaca d'unió de dinucleòtids cíclics. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Escotilla, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Descobriment d'un nou lligand competitiu cGAMP de la forma inactiva de STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Orientació a STING amb inhibidors covalents de molècules petites. Natura 2018, 559, 269–273. [Ref creuat]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sol, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Disseny, síntesi i avaluació biològica d'anàlegs d'acridona com a nous agonistes del receptor STING. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Cançó, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. L'anàlisi estructural de la proteïna adaptadora STING revela una interfície de dímer hidrofòbic i un mode d'unió cíclica di-GMP. Immunitat 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. L'estructura de STING unida a di-GMP cíclic revela el mecanisme de reconeixement de dinucleòtids cíclics per part del sistema immunitari. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [Ref creuat]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. La base estructural per a la detecció i la unió de di-GMP cíclic per STING. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [Ref creuat]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Les diferències estructurals dinàmiques entre el STING humà i el ratolí condueixen a una sensibilitat diferent a DMXAA. Biofísica. J. 2018, 114, 32–39. [Ref creuat]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Anàlisi estructura-funció de l'activació de STING per c[G(20,50)pA(30,50)p] i orientació per DMXAA antiviral. Cel·la 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Bases estructurals de la unió de STING i la fosforilació per TBK1. Natura 2019, 567, 394–398. [Ref creuat]
30. Vavrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Interaccions proteïnes-lligands al lloc d'unió STING provat per mutacions d'un sol punt dissenyades racionalment: experiment i teoria. Bioquímica 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; llarg, ZR; Sí, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Les mutacions simples remodelen la xarxa de correlació estructural del complex DMXAA-STING humà. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE El sensor d'ADN immunitari innat cGAS produeix un dinucleòtid cíclic no canònic que activa el STING humà. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Les substitucions de Patel, DJ Binding-Pocket i Lid-Region fan que STING humà sigui sensible al fàrmac específic de l'espècie DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Disseny, síntesi i avaluació biològica de derivats de DMXAA funcionalitzats C7-com a agonistes potencials de STING humà. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]