Les soques probiòtiques viables i matades per calor milloren la immunitat oral augmentant la concentració d'IgA a la mucosa oral

Resum

La immunitat de la mucosa oral-nasal té un paper crucial en la protecció del cos contra la invasió bacteriana i viral. S'han utilitzat productes probiòtics segurs per millorar la immunitat humana i la salut bucal. En aquest estudi, vam verificar els efectes beneficiosos de les pastilles probiòtiques mixtes viables, que consisteixen en Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 i Lactobacillus paracasei ET-66, i comprimits probiòtics morts per calor, formats per L. salivarius subsp. salicinius AP-32 i L. paracasei ET-66, sobre la immunitat oral entre 45 participants sans. Els participants es van dividir aleatòriament en grups de probiòtics viables, probiòtics morts per calor i placebo. L'administració del tractament va durar 4 setmanes. Es van recollir mostres de saliva a les setmanes 0, 2, 4 i 6, i es van mesurar les poblacions de Lactobacillus, Bifidobacterium i Streptococcus mutans i la concentració d'IgA. Les concentracions d'IgA i els nivells de TGF-beta i IL-10 a les cèl·lules PBMC es van quantificar mitjançant el mètode ELISA. Els resultats van mostrar que els nivells d'IgA salivals van augmentar significativament amb l'administració dels dos viables (119,30±12,63%, ***P).<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat

Introducció

La mucosa oral-nasal, la porta d'entrada per contactar amb antígens inhalats, és la defensa de primera línia del sistema immunitari humà [1, 2]. Normalment, els virus o bacteris patògens envaeixen les superfícies mucoses de la cavitat buco-nasal lluitant contra el sistema immunitari local i la microbiota sana [3]. La inflamació i els símptomes, com ara tos, mal de coll, secreció nasal i febre, es desenvolupen a causa de les respostes immunitàries contra virus i bacteris patògens invasius [4]. A més, la immunoglobulina A (IgA) és el principal factor immunitari de la saliva i regula l'homeòstasi de la microbiota oral [5]. Diversos estudis han informat de la capacitat de la IgA secretora per protegir el cos de la infecció per patògens vírics, inclòs el virus respiratori sincicial [6], el rotavirus [7] i el virus de la grip [7]. La IgA secretora funciona per protegir l'epiteli de la mucosa. Nicolas Millet et al. va descobrir que la IgA de la mucosa pot prevenir la disbiosi comensal de Candida albicans a la cavitat oral [8]. També impedeix l'agregació del patogen oral Streptococcus mutans, que causa placa dental [9].

A més, els investigadors van descobrir que la microbiota oral i els seus metabòlits poden influir localment en la immunitat a la barrera oral [10]. Estudis anteriors van demostrar l'eficàcia dels probiòtics per augmentar la concentració d'IgA a la mucosa oral [11]. Ericson et al. va demostrar que el xiclet que contenia Lactobacillus reuteri va participar en la resposta immune adaptativa de subjectes sans augmentant els nivells d'IgA salival [12]. En humans, les citocines immunitàries TGF-beta i IL-10 estan correlacionades amb la producció d'IgA [13].

Tanmateix, encara no està clar si la microbiota oral va augmentar els nivells secretors d'IgA a través de les citocines TGF-beta i IL-10. A més, els patògens orals inclouen S. mutans, P. gingivalis i F. nucleatum subsp. polimorfisme i A. actinomycetemcomitans van mostrar una alta correlació amb la malaltia periodontal i el mal alè [14]. Els productes probiòtics podrien ser una teràpia alternativa potencial a la periodontitis mitjançant la inhibició dels patògens orals Fusobacterium nucleatum, però Porphyromonas gingivalis i Aggregatibacter actinomicetemcomitans no van mostrar una disminució significativa [15]. La suplementació amb probiòtics també pot prevenir infeccions patògenes [16]. S'ha informat que espècies clau de la microbiota van limitar el creixement de la pneumònia patògena de Streptococcus [17]. Així, mantenir un ecosistema microbià equilibrat mitjançant l'absorció de soques probiòtiques pot ser una forma alternativa de regular la immunitat oral i millorar la salut bucal. Descobriments anteriors sobre la inhibició dels patògens orals per soques probiòtiques han revelat que Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 i Lactobacillus paracasei ET-66 exerceixen excel·lents efectes antibacterians in vitro; tanmateix, no pel mecanisme d'augment dels nivells d'H2O2 [18]. Les principals estratègies per a les soques probiòtiques per limitar el creixement patògen oral van ser la co-agregació de patògens per via oral, la producció de biosurfactants, el canvi de l'entorn oral i la generació de substàncies antimicrobianes [19]. A més, un estudi in vitro va demostrar que L. salicinius AP-32 va mediar l'expressió de citocines inflamatòries [interleucina (IL)-8, IL{-10] a les cèl·lules epitelials humanes [20]. Per tant, en aquest estudi, hem verificat si les pastilles probiòtiques mixtes viables, formades per L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 i L. paracasei ET-66, i comprimits probiòtics morts per calor, formats per L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 i L. paracasei ET-66, van millorar la funció immune mitjançant TGF-beta, IL-10 o van elevar el nivell de concentració d'IgA salival. Es va provar la funció antibacteriana de l'absorció de productes probiòtics a la cavitat oral.

Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Material i mètodes

Participants

En total, es van reclutar 45 participants sans d'entre 20 i 40 anys i es van dividir aleatòriament en tres subgrups: la tableta oral probiòtica viable, la pastilla oral probiòtica assassinada per calor i els grups placebo. Cada grup estava format per 15 participants. Es van excloure els participants amb hàbits de consum de nous de betel i fumadors. Les tauletes orals es van assignar a cegues als participants. Tots els participants van prendre les pastilles orals tres vegades al dia (matí, migdia i vespre) durant 4 setmanes. Es van recollir mostres de saliva (2 ml) per mesurar la concentració d'IgA i les poblacions de microorganismes a les setmanes 0, 2, 4 i 6. Es va obtenir el consentiment informat de tots els participants inclosos en aquest estudi. El protocol va ser aprovat pel Comitè de Revisió Institucional de la Universitat Mèdica Chung Shan, Taiwan (CS19052).

Tauletes orals probiòtiques viables

La pastilla oral probiòtica viable (1 g) contenia tres soques probiòtiques viables, L. salivarius subsp. salicinis AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 i L. paracasei ET-66. Hem barrejat 0.01 g d'1011 unitats de formació de colònies (CFU) probiòtic únic a la pastilla oral. Cada soca probiòtica es va mesurar al voltant de 0,33 * 109 CFUs/g. El contingut total de probiòtics a la pastilla oral va ser de 109 UFC de colònies/g. La dosi activa de la pastilla oral probiòtica va seguir treballs publicats anteriorment [18]. Totes les soques probiòtiques es van obtenir del laboratori de Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan). L. salivarius subsp. salicinius AP-32 es va aïllar d'un intestí humà sa i es va dipositar a l'Institut de Recerca i Desenvolupament de la Indústria Alimentària, Taiwan (ID: BCRC 910437) i a la Universitat de Wuhan, Xina (ID: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. El CP làctic-9 es va aïllar de la llet materna humana sana i es va dipositar a l'Institut de Recerca i Desenvolupament de la Indústria Alimentària, Taiwan (ID: BCRC 910645) i a la Universitat de Wuhan (ID: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 es va aïllar de la llet materna humana sana i es va dipositar a l'Institut d'Investigació i Desenvolupament de la Indústria Alimentària, Taiwan (ID: BCRC 910753) i al Centre de Col·lecció General Microbiological Culture de la Xina, Beijing, Xina (ID: CGMCC{ {22}}). Lactobacil. salivarius subsp. salicinius AP-32 i L. paracasei ET-66 es van cultivar en plaques d'agar de Man, Rogosa i Sharpe (MRS) (110.660, Merck, Darmstadt, Alemanya) i es van incubar en condicions anaeròbies facultatives a 37 graus. durant 48 h. B. animalis subsp. Lactis CP-9 es va cultivar en agar MRS complementat amb un 0,05% de cisteïna i es va incubar anaeròbicament a 37 graus durant 48 h. Es va realitzar el recompte de colònies per quantificar la CFU bacteriana després de cultivar soques probiòtiques [18].

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

Comprimits orals probiòtics morts per calor

Els comprimits orals probiòtics morts per calor (1 g) consistien en L. salivarius subsp. salicinis AP-32 i L. paracasei ET-66. Les soques viables es van cultivar i incubar, tal com es va descriure anteriorment. Aleshores, AP-32 i ET{-66 es van inactivar incubant les soques viables en medis MRS a 100 graus durant 1 h. El contingut de probiòtics a la pastilla oral era d'1 × 1010 cèl·lules/g. La dosi activa de comprimits orals probiòtics morts per calor va seguir les proves in vitro publicades anteriorment [11]. Tots els procediments experimentals es van realitzar al laboratori de Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan).

Mesura de les poblacions de Lactobacillus i Bifidobacterium en mostres de saliva

Es van recollir mostres de saliva (2 ml) de cada participant a les setmanes 0, 2, 4 i 6. Les mostres de saliva (100 µL) es van diluir en sèrie i es van afegir a MRS plaques. Per mesurar les poblacions de Lactobacillus, Lactobacillus es va cultivar i es va incubar a les plaques d'agar MRS en condicions anaeròbiques facultatives a 37 graus durant 48 h. Per mesurar les poblacions de Bifdobacterium, Bifdobacterium es va cultivar i es va incubar de manera anaeròbica en agar MRS suplementat amb 0, 05% de cisteïna a 37 graus durant 48 h. Es va realitzar el recompte de colònies per quantificar la CFU bacteriana després de cultivar soques probiòtiques. Les taxes de població de Lactobacillus i Bifidobacterium es van normalitzar al nombre de població probiòtica a la setmana 0. La taxa de població de Lactobacillus i Bifidobacterium recollida a la setmana 0 es va considerar del 100%. El mètode experimental va seguir treballs publicats anteriorment [18].

Mesura de la concentració d'IgA a la mucosa oral

Es van recollir mostres de saliva (2 ml) de cada participant a les setmanes 0, 2, 4 i 6 i es van mantenir a 20 graus. Per analitzar la concentració d'IgA es va utilitzar el kit ELISA sense recobriment humà IgA (núm. de catàleg 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EUA). En primer lloc, hem recobert anticossos anti-IgA humans en una placa de 96-pou. Es va afegir IgA salival present a la mostra o estàndard al micropouet i després es va afegir un anticòs anti-IgA humà conjugat amb HRP a temperatura ambient durant 1 h. Pipetejar el substrat TMB a cada pou durant 30 min. Finalment, es va mesurar la concertació d'IgA en un espectrofotòmetre a 450 nm. Tot el procediment experimental es va realitzar per triplicat, segons les instruccions del fabricant. La taxa de concentració d'IgA recollida a la setmana 0 es va considerar del 100%. El mètode experimental va seguir treballs publicats anteriorment [18].

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Mesura de la concentració de TGF-Beta i IL-10 en PBMC

Les proves de l'elevació induïda per probiòtics dels nivells de TGF-beta i IL-10 després de l'estudi anterior [20]. Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) es van obtenir a partir de mostres de sang de donants sans (Tainan Blood Center, Taiwan Blood Services Foundation). La centrifugació de sang sencera a través d'un gradient de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Suècia) i es va eluir la fracció de densitat de llum de la interfície del 42,5% -50%. Sembrar cèl·lules PBMC extretes de 4 * 105 cèl·lules en 100 µl de RPMI-1640 amb un 1% de FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) a cada pou de plaques de 96 pous. A continuació, afegiu 5 * 105 ufc/20 µl de tractament probiòtic a cada bé sembrat de PBMC (cèl·lules: soques probiòtiques=1:10). Els controls positius van afegir 10 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) (Sigma-Aldrich, Munic, Alemanya) als pous sembrats de PBMC per a la producció de TGF-, IL-10 respectivament [21]. Co-cultiu de probiòtics amb PBMC durant 48 h. Mesura del sobrenedant que conté citocines IL-10 i TGF- mitjançant anàlisi d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, EUA). Tots els experiments es van mesurar i van seguir el protocol comercial almenys per triplicat.

Avaluació de la funció antibacteriana a la cavitat bucal

Streptococcus mutans és una amenaça comuna per a la salut bucodental, que causa càries dental mitjançant la formació de pesta o biofilm [22]. Es van recollir mostres de Streptococcus mutans dels hisops, mitjançant els quals vam recollir S. mutans a la part supragingival, les genives i la mucosa oral, a les setmanes 0, 2, 4 i 6. S. mutans es va mantenir en tríptic brou de soja (TSB, 5 ml) suplementat amb un 50% de glicerol. El medi S. mutans es va diluir en sèrie i es va afegir a la placa Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL), que es va incubar a 37 graus durant 2 dies. Finalment, es va comptar el nombre de colònies de S. mutans a cada mostra participant per calcular les taxes de supervivència patògena; la taxa de supervivència de S. mutans recollida a la setmana 0 es va considerar del 100%. El mètode experimental va seguir treballs publicats anteriorment [18].

Activitat antibacteriana in vitro de les pastilles orals

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFUs) es van dissoldre soques probiòtiques en TSB i medi d'infusió de cor cerebral, respectivament, per obtenir una concentració final de 0,1 g/mL. Només es va utilitzar el medi per al grup en blanc, mentre que les pastilles (1 g) sense components probiòtics es van dissoldre als mitjans respectius per al grup placebo. A continuació, es van introduir patògens orals (106 UFC) a les solucions de comprimits i es van co-incubar a 37 graus durant 2 (S. mutans) o 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum i Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) d. Els patògens es van obtenir del BCRC. La taxa d'inhibició del patògen oral (%) es va calcular de la següent manera: (control CFUblank–grup CFUexperimental)/control CFUblank. El mètode experimental va seguir proves publicades anteriorment [11].

Anàlisi estadística

Es va utilitzar el programari GraphPad Prism per a l'anàlisi estadística dels resultats de les proves t de dues cues. Les dades es van presentar com la desviació estàndard mitjana (SD) o la mitjana dels resultats de dos o tres experiments independents. Les diferències estadístiques es van considerar significatives al valor P<0.05.

Resultats

Les pastilles probiòtiques van augmentar la població de bifidobacterium a la cavitat oral

La població de Bifidobacterium es va elevar de manera estable a la cavitat oral després de l'administració de comprimits probiòtics. Les poblacions bacterianes després dels tractaments es van normalitzar per poblacions bacterianes abans dels tractaments (% =taxa de població CFU posttractament/UFC pretractament). En el grup de probiòtics viables, la taxa de població va augmentar significativament fins al 244,14±164,96% a la setmana 2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Les pastilles probiòtiques van augmentar la població de lactobacils a la cavitat oral

El canvi en la població oral de Lactobacillus a causa de l'administració de comprimits probiòtics va revelar un patró similar al seguit pel canvi en la població oral de Bifidobacterium. Les poblacions bacterianes després dels tractaments es van normalitzar per poblacions bacterianes abans dels tractaments. En el grup de probiòtics viables, la taxa de població de Lactobacillus va augmentar significativament fins al 447,74±337,89% a la setmana 2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Fig. 1 a Mesura de poblacions de Bifidobacterium a les superfícies de la mucosa oral. V pastilles probiòtiques viables; H comprimits probiòtics inactivats per calor; C comprimits de placebo (control); i bacteris àcid làctic LAB. Es va realitzar la recollida i l'anàlisi de mostres de salival a les setmanes 0, 2, 4 i 6. Les dades es van presentar com a desviació estàndard mitjana (SD). Es va utilitzar una prova t de dues cues per analitzar les diferències estadístiques. Els significats estadístics es van marcar amb *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Les pastilles probiòtiques que contenen AP-32, ET-66 i CP-9 van augmentar significativament la concentració d'IgA a la mucosa oral

Com que s'ha demostrat que el consum de comprimits probiòtics (viables o morts per calor) eleva els nivells de Bifidobacterium i Lactobacillus a la cavitat oral, es van analitzar més els canvis de concentració d'IgA salival, que es van produir a causa de l'absorció de productes probiòtics. Els nivells d'IgA després dels tractaments es van normalitzar pels nivells d'IgA abans dels tractaments. En el grup de probiòtics viables, la concentració d'IgA salival va augmentar lleugerament fins a 103,24 ± 8,10% a la setmana 2 (Fig. 2) i 104,81 ± 13,26 a la setmana 4, però sense diferències estadísticament significatives. No obstant això, la concentració d'IgA salival en el grup de probiòtics viables, en comparació amb el grup placebo, va augmentar significativament fins a 119,30 ± 12,63% a la setmana 6 (sense administració de comprimits de probiòtics viables durant 2 setmanes després de la setmana 4), en comparació amb la setmana 0 ( ***Pàg<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Les soques viables van augmentar els nivells d'IL-10 i TGF-Beta en PBMC

El control positiu d'10 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) va elevar amb èxit els nivells d'IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P <0,001, figura 3a) i TGF- (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Fig. 2 Concentració d'immunoglobulina A (IgA) a les mostres de saliva. V pastilles probiòtiques viables; H comprimits probiòtics inactivats per calor; C comprimits de placebo (control); i bacteris àcid làctic LAB. Es va realitzar la recollida i l'anàlisi de mostres de salival a les setmanes 0, 2, 4 i 6. Les dades es van presentar com a desviació estàndard mitjana (SD). Es va utilitzar una prova t de dues cues per analitzar les diferències estadístiques. Estadístic

Les pastilles probiòtiques que contenen AP-32, ET-66 i CP-9 van prohibir la població de S. mutans a la saliva

Les poblacions elevades de Bifidobacterium i Lactobacillus i l'augment de la concentració d'IgA salival poden contribuir a la lluita contra els microorganismes patògens orals. En l'experiment posterior, vam provar l'alteració de la població de patògens orals S. mutans a causa de la intervenció probiòtica. Les poblacions bacterianes després dels tractaments es van normalitzar per poblacions bacterianes abans dels tractaments. En el grup de probiòtics viables, la població de S. mutans es va reduir significativament a les setmanes 2 (53,55 ± 31,60%, *** P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Fig. 3 Les soques viables van augmentar els nivells d'IL-10 i TGF-beta a les PBMC. El nivell d'IL-10 i b TGF-beta en PBMC es va provar tractant soques probiòtiques. Afegint 5 * 105 ufc/20 µl de soques viables de CP-9, AP-32 i ET-66 a PMBC 10 µg/ml. La fitohemaglutinina (PHA) es va utilitzar com a control positiu. El control negatiu eren els PBMC tractats només amb el medi RMPI-1640. Es van realitzar proves per triplicat. Les dades es van presentar com a desviació estàndard mitjana (SD). Es va utilitzar una prova t de dues cues per analitzar les diferències estadístiques. Les significacions estadístiques es van marcar amb P<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Fig. 4 Mesura de poblacions patògenes de Streptococcus mutans a les superfícies de la mucosa oral. V pastilles probiòtiques viables; H comprimits probiòtics inactivats per calor; C comprimits de placebo (control); i bacteris àcid làctic LAB. Es va realitzar la recollida i l'anàlisi de mostres de salival a les setmanes 0, 2, 4 i 6. Les dades es van presentar com a desviació estàndard mitjana (SD). Es va utilitzar una prova t de dues cues per analitzar les diferències estadístiques. Les significacions estadístiques es van marcar amb *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Confirmació de la capacitat de les pastilles probiòtiques per inhibir el creixement de patògens orals mitjançant una prova in vitro

L'estudi in vitro va revelar que les pastilles probiòtiques viables van inhibir significativament la taxa de supervivència dels patògens orals (Fig. 5a). Les poblacions bacterianes després dels tractaments es van normalitzar per poblacions bacterianes abans dels tractaments. La taxa de supervivència de S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum i A. actinomy cetemcomitans en el grup de probiòtics viables, en comparació amb en el grup placebo, es va reduir al 4,23% (***P < 0 .001, placebo=91%), 8,64% (***P < 0,001, placebo{=89%), 5,77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Discussió

En comparació amb el grup placebo, les poblacions orals de Lactobacillus i Bifidobacterium augmentarien significativament alimentant comprimits probiòtics viables o comprimits probiòtics morts per calor durant 4 setmanes. A més, els nombres de Lactobacillus i Bifidobacterium es van mantenir en nivells significativament alts durant 2 setmanes després de la suspensió del consum de consum de probiòtics viables (Fig. 1a i b). De la mateixa manera, Camila Casuccio Almeida et al. va demostrar que una administració de quatre setmanes d'un tractament probiòtic podria persistir per millorar els símptomes en pacients intolerants a la lactosa durant almenys 3 mesos després d'aturar el consum de probiòtics [23]. Tanmateix, l'efecte persistent dels probiòtics en el tractament a llarg termini s'hauria d'avaluar en el futur. A més, la concentració d'IgA salival va augmentar significativament amb l'administració de comprimits probiòtics viables i morts per calor. Tant els grups probiòtics morts per calor com els viables van augmentar la IgA salival administrant comprimits orals durant 4 setmanes, però sense mostrar diferències estadístiques amb el placebo. La concentració d'IgA en grups probiòtics morts per calor i viables va mostrar un augment significatiu a la setmana 6. No obstant això, el mecanisme d'elevació d'IgA després d'aturar l'administració de probiòtics durant 2 setmanes s'hauria d'investigar més (Fig. 2) Braathen et al. van informar resultats similars sobre el paper immunomodulador de les soques probiòtiques a la cavitat oral [24]. A més, s'ha informat que les soques probiòtiques augmenten significativament la concentració d'IgA fecal en truges i garrins [25]. Tanmateix, els estudis sobre símptomes que alleugen IgA en infeccions de les vies respiratòries superiors segueixen sent insuficients. El mecanisme molecular detallat d'inhibició i prevenció de les infeccions de les vies respiratòries superiors per soques probiòtiques CP-9, AP-32 i ET-66 es podria investigar en estudis futurs. En el present estudi, les soques viables CP-9, AP-32 i ET-66 elevarien el nivell d'IL-10 i TFG-beta a les cèl·lules PBMC. AP-32 va mostrar una capacitat efectiva per augmentar IL-10 i TFG-beta en PBMC comparant-los amb el control positiu PHA (Fig. 3a i b). Es va suposar que les soques viables CP-9, AP-32 i ET-66 podrien induir IL-10 i TFG-beta secretores de cèl·lules B per augmentar els nivells d'IgA salival. Tanmateix, la correlació entre IL-10 salival, TFG-beta i IgA salival s'hauria de provar més endavant [26]. A més, encara no està clar si els probiòtics morts per calor van elevar IgA mitjançant la inducció de IL-10 i TFG-beta. Una prova in vitro va indicar que l'AP-32 mort per calor va promoure la secreció d'interferó i IL-12p70 i va disminuir els nivells d'IL-13 [27]. Així, en aquest estudi clínic, la capacitat de les soques probiòtiques CP{-9, AP{-32 i ET{-66 i AP{-32 i ET-66 morts per calor Les soques per inhibir els bacteris patògens a la cavitat oral es van validar encara més (Fig. 4). Les pastilles probiòtiques viables presentaven una millor capacitat antipatògena que les pastilles mortes per calor mitjançant la secreció d'àcids orgànics, pèptids antimicrobians [28], exopolisacàrids (EPS) [29] bacteriocines [30] (Fig. 5a i b). Els components antimicrobians funcionals produïts per soques probiòtiques viables s'han de detectar mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) i cromatografia líquida (LC)-espectrometria de masses en el futur [31]. S'informa que els probiòtics morts per calor posseïen avantatges clau dels probiòtics viables, però sense els certs problemes de seguretat de les soques probiòtiques viables [32]. Tanmateix, els components antimicrobians dels probiòtics morts per calor s'han de verificar més.

Fig. 5 Confirmació de la capacitat de les pastilles probiòtiques per inhibir el creixement de patògens orals mitjançant una prova in vitro. Es va validar la capacitat de les pastilles probiòtiques viables i morts per calor per inhibir la taxa de supervivència dels patògens orals, inclosos Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum i Aggregatibacter actinomicetemcomitans. Grup en blanc, només mitjà; grup placebo, comprimits (1 g) sense cap component probiòtic. Es van realitzar proves per triplicat. Les dades es van presentar com a desviació estàndard mitjana (SD). Es va utilitzar una prova t de dues cues per analitzar les diferències estadístiques. Les significacions estadístiques es van marcar amb *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Conclusió

Comprimits probiòtics viables mixtes, formats per L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. CP làctic-9 i L. paracasei ET-66, i probiòtics morts per calor, incloent L. salivarius subsp. salicinius AP-32 i L. paracasei ET-66, van exercir les seves funcions beneficioses elevant les poblacions orals de Lactobacillus i Bifdobacterium, reduint S. mutans a la cavitat oral i augmentant la concentració d'IgA salival en participants sans. Els resultats de les proves in vitro van validar que els probiòtics viables inhibien eficaçment els patògens orals, inclosos S. mutans, P. gingivalis i F. nucleatum subsp. polimorfisme, i A. actinomicetemcomitans. La immunitat de la mucosa oral-nasal és la primera línia de defensa contra els microorganismes invasors, i això s'ha convertit en un tema crucial. Així, aquest estudi oferirà una estratègia alternativa (la suplementació amb probiòtics) per mantenir la immunitat bucal i la salut bucal.

Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari

Referències

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Resposta immune de la mucosa al teixit limfoide associat al nas després de l'administració intranasal per adjuvants. J Innate Immun 10(5–6):515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) El sistema immunitari de la mucosa a la cavitat oral: una orquestra de diversitat de cèl·lules T. Int J Oral Sci 6(3):125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) The microbiota of the respiratory tract: gatekeeper to respiratory health. Nat Rev Microbiol 15(5):259–270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Infeccions del tracte respiratori superior en nens petits: durada i freqüència de les complicacions. Pediatria 87(2):129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Ecologia microbiana oral i el paper de la immunoglobulina salival A. Microbiol Mol Biol Rev 62 (1): 71–109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et al (1996) L'anticòs IgA monoclonal intranasal del virus respiratori sincitial protegeix els micos rhesus contra la infecció del tracte respiratori superior i inferior. J Infect Dis 174(2):256–261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) La immunoglobulina A antirotavirus neutralitza el virus in vitro després de la transcitosi a través de cèl·lules epitelials i protegeix els ratolins nadons de la diarrea. J virol 72(4):2708–2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) La mucosa IgA prevé la disbiosi comensal de Candida albicans a la cavitat oral. Front Immunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) Respostes protectores de la immunoglobulina A salival contra la infecció per Streptococcus mutans després de la immunització intranasal amb l'antigen I/II de S. mutans acoblat a la subunitat B de la toxina del còlera . Infect Immun 61(5):1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Immunitat específica del teixit a la barrera de la mucosa oral. Trends Immunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Les pastilles amb soques probiòtiques milloren la resposta immune oral i la salut . Dis. oral. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Resposta d'IgA salival a bacteris probiòtics i estreptococs mutans després de l'ús de xiclet que conté Lactobacillus reuteri. Pathog Dis 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) La interleucina 10 i el factor de creixement transformant beta cooperen per induir cèl·lules B humanes ingènues activades anti-CD40-per secretar immunoglobulina A. J Exp Med 175(3):671–682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) Detecció i prevalença de patògens periodontals en una població uruguaiana amb periodontitis crònica mitjançant metodologia convencional i metagenòmica. Odontoestomatologia 17(25):23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Alternativa probiòtica a la clorhexidina en teràpia periodontal: avaluació de paràmetres clínics i microbiològics. Microorganismes 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) Probiòtics per a la prevenció i el tractament de les infeccions del tracte respiratori en nens: una revisió sistemàtica i metaanàlisi d'assajos controlats aleatoris. Medicina 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Comunitats microbianes del tracte respiratori superior i otitis mitjana en nens. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.00245-10

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Activitat antibacteriana de soques probiòtiques viables i morts per calor contra patògens orals. Lett Appl Microbiol 70(4):310–317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Probiòtics per a la salut bucal: mite o realitat? J Can Dent Assoc 75(8):585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) Potencial de les soques probiòtiques per modular les respostes inflamatòries de les cèl·lules epitelials i immunitàries in vitro. New Microbiol 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) La producció de TGF i IL-10 per les cèl·lules T CD8+ específiques del VIH està regulada per CTLA{ {5}} senyalització a les cèl·lules T CD4+. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: s'ha convertit en un principal autor de manifestacions orals? J Microbiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Els efectes beneficiosos del consum a llarg termini d'una combinació probiòtica de Lactobacillus casei Shirota i Bifidobacterium breve Yakult poden persistir després de la suspensió de la teràpia en pacients intolerants a la lactosa. Nutr Clin Pract 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) La presència de Lactobacillus reuteri a la saliva coincideix amb una IgA salival més alta en adults joves després de la ingesta de pastilles probiòtiques. Benef Microbes 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Impacte dels bacteris probiòtics Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) i Bacillus cereus var. a vostè NCIMB 40112 sobre el desenvolupament d'IgG sèrica i IgA fecal de truges i els seus garrins. Arch Anim Nutr 61(4):223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Efectes dels probiòtics sobre les citocines salivals i les immunoglobulines: una revisió sistemàtica i metaanàlisi dels assaigs clínics. Sci Rep 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Els bacteris làctics morts per calor milloren el potencial immunomodulador inclinant la resposta immune cap a la polarització Th1. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Propietats antivirulència dels probiòtics en la lluita contra la patogènesi microbiana. Adv Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Activitats d'exopolisacàrids a partir de bifidobacteris probiòtics: efectes immunomoduladors (en macròfags J774A. 1) i propietats antimicrobianes. Int J Food Microbiol 144(1):104–110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) Detecció i activitat de la lactacina B, una bacteriocina produïda per Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Caracterització i identificació de l'estructura d'un pèptid antimicrobià, hominina, produït per Staphylococcus hominis MBBL 2–9. Biochem Biophys Res Commun 399(2):133–138

32. Piqué N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Beneficis per a la salut dels probiòtics morts per calor (Tyndallized): una visió general. Int J Mol Sci 20(10):2534