Expressió gènica i resposta glial de receptors semblants a un peatge distintius en diferents regions cerebrals de la tremoladora natural part 2

2.2. Característiques neuropatològiques a l'hipocamp d'ovelles infectades naturalment amb serapie

A les ovelles de control i infectades per la tremoladora, es van examinar amb més detall les quatre àrees hipocampals següents per a tots els marcadors patològics: les capes cel·lulars piramidals CA1, CA3 i CA4 i el SLM (figura 3).

Estudis recents han demostrat que la capa cel·lular piramidal té un paper important en la memòria. La capa de cèl·lules piramidals és neuronal del cervell principalment responsable de la percepció de l'entorn extern i l'emmagatzematge de la memòria.

Durant l'aprenentatge i la memòria, la capa de cèl·lules piramidals allibera alguns neurotransmissors, que poden estimular la comunicació entre neurones, millorant així l'emmagatzematge i la recuperació de la memòria. A més, la capa de cèl·lules piramidals també pot filtrar i integrar informació en el procés d'aprenentatge i memòria, ajudant-nos a dominar ràpidament nous coneixements i habilitats.

Els estudis també han trobat que la funció i la salut de la capa de cèl·lules piramidals tenen un gran impacte en el rendiment de la memòria. Si la capa de cèl·lules piramidals està danyada o molt estressada, la memòria es pot veure molt afectada. Per tant, hem de parar atenció a la salut i el manteniment de la capa de cèl·lules piramidals per mantenir bones capacitats d'aprenentatge i memòria.

Les recomanacions per a la salut i el manteniment de la capa de cèl·lules piramidals inclouen la dieta, l'exercici i el son. Per exemple, una dieta rica en àcids grassos i antioxidants pot ajudar a promoure la salut de la capa de cèl·lules piramidals; l'exercici regular pot millorar la funció i la resistència del sistema nerviós; i els bons hàbits de son poden ajudar a reduir l'estrès a la capa de cèl·lules piramidals i afavorir la consolidació i recuperació de la memòria.

En resum, la capa cel·lular piramidal té un paper important en l'aprenentatge i la memòria. Hem de parar atenció a la salut i el manteniment de la capa de cèl·lules piramidals per millorar les nostres capacitats d'aprenentatge i memòria.

Feu clic a Coneix la memòria a curt termini com millorar

Al mateix temps, hem d'evitar el cansament i l'estrès excessius, proporcionar al cervell un temps de descans i recuperació adequat i permetre que la nostra memòria es millori i perfeccioni contínuament.

Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria. Cistanche pot millorar significativament la memòria perquè té efectes antioxidants, antiinflamatoris i antienvelliment, que poden ajudar a reduir l'oxidació i les reaccions inflamatòries al cervell, protegint així la salut del sistema nerviós. A més, Cistanche també pot promoure el creixement i la reparació de les cèl·lules nervioses, millorant així la connectivitat i la funció de la xarxa neuronal.

Aquests efectes poden ajudar a millorar la memòria, la capacitat d'aprenentatge i la velocitat de pensament, i també poden prevenir l'aparició de disfuncions cognitives i malalties neurodegeneratives.

Figura 3. Distribució de lesions neuropatològiques (HE), deposició de PrPSc, astrogliosi (GFAP), i microgliosi (Iba1), en quatre regions hipocampals diferents en ovelles infectades per la tremola i control: capes de cèl·lules piramidals CornuAmmonis (CA) 1, 3 i 4 , i l'estrat lacunosum-moleculare (SLM).

Els gràfics mostren valors d'avaluació semiquantitatius per a cada paràmetre analitzat. (A) Es van observar canvis espongiformes lleus a totes les regions de l'hipocamp analitzades. (B) Patró PrPSc intraneuronal (L42) a CA1, CA3 i CA4 i patró PrPSc granular fi estès a l'SLM. ( C ) Augment de la tinció d'Iba1 en ovelles infectades amb tremolar versus control.

Les imatges ampliades mostren algunes de les diferències morfològiques observades. (D) Signes d'astrogliosi reactiva moderada en ovelles infectades amb tremolar en comparació amb els controls. Les puntuacions oscil·len entre 0 (negatiu) i 5 (intensitat màxima).

Les diferències significatives es van determinar mitjançant la prova t de Student o la prova U de Mann-Whitney per a dades distribuïdes de manera normal i no normal, respectivament. * p < 0.05, ** p < 0,01. Barra d'escala=200 µm.

L'espongiosi a l'hipocamp era molt lleu i es van observar vacúols ocasionals al CA1, CA3 i CA4 i al SLM (figura 3A). Aquesta pèrdua neuronal limitada contrastava amb la deposició de PrPSc escassa, però focalment intensa a CA1 i CA3 (figura 3B).

Es va observar una tinció de PrPSc molt lleu al CA4 i al SLM. Es van observar patrons diferents de PrPSc en aquestes àrees del cervell (figura S2). Mentre que els patrons de PrPSc intraneuronals i associats a neuropils van predominar al CA1 i CA3, la deposició intraglial va ser el patró morfològic principal observat al SLM.

Es van observar constantment patrons de PrPSc intraneuronals lleus i associats a neuropils al CA4, tot i que la intensitat era inferior a la observada a CA1 i CA3. Iba1 es va expressar de manera constitutiva i es va distribuir poc a les mostres de control. Per contra, es va observar una marcada microgliosi en CA1, CA3 i CA4 i el SLM en ovelles infectades per la tremoladora.

Tanmateix, les característiques morfològiques de la microglia difereixen significativament entre aquestes regions cerebrals. A la capa piramidal CA1, la majoria de cèl·lules microglials presentaven processos curts amb cossos cel·lulars engrandits, característics de la morfologia hipertròfica.

A CA4, les cèl·lules microglials també eren hipertròfiques, però mostraven branques més llargues i primes que les cèl·lules microglials CA1. Mentrestant, la microglia hipertròfica del SLM va mostrar processos curts i prims amb cossos cel·lulars inflats. Per contra, a CA3, vam observar la morfologia de la vareta-micròglia esmentada [42].

Aquestes cèl·lules microglials tenien cossos cel·lulars allargats, amb un procés primari paral·lel llarg orientat perpendicularment a la capa de cèl·lules piramidals CA3 i branques subsidiàries que eren més curtes que els processos primaris llargs.

La immunotinció de GFAP es va incrementar significativament a les capes de cèl·lules piramidals CA1 i CA3 de les ovelles infectades per la tremoladora versus control. Curiosament, les puntuacions de PrPSc van ser més altes a CA1 i CA3. No es van observar diferències a la capa cel·lular piramidal CA4 ni a l'SLM.

2.3. Neuropatologia de ratolins tg338 infectats per la tremola

Els mateixos marcadors neuropatològics d'espongiosi, deposició de PrPSc, microgliosi i astrogliosi analitzats en ovelles es van examinar al tàlem de ratolins tg338 afectats clínicament que havien estat infectats intracerebralment amb scrapie (figura 4).

En comparació amb els controls, es van observar diferències significatives (p <{0}}.05) en l'espongiosi en el tàlem de ratolins infectats per la tremoladora, en els quals els vacúols estaven restringits al neuropil.

Els dipòsits de PrPSc es van distribuir àmpliament a nivell del citoplasma i del neuropil. L'avaluació de la gliosi va revelar diferències significatives en la immunotinció d'Iba1 i GFAP entre els ratolins infectats amb scrapie i els ratolins control, amb astròcits i microglia que presenten morfologies hipertròfiques.

WB també va avaluar l'acumulació de PrPres en tots els ratolins infectats amb la tremoladora, revelant un patró de bandes constant de 19 kDa (figura 5). La intensitat del senyal PrPres en els ratolins tg338 va ser més homogènia entre els individus que en les ovelles, com s'esperava per a la infecció experimental en què es controlava la dosi, l'edat d'inoculació i el temps de sacrifici.

No es va detectar cap senyal en els ratolins control inoculats amb homogeneïtat cerebral normal, no d'acord amb els resultats negatius de l'IHC.

Figura 4. Seccions de tàlem de ratolins infectats per la tremola (inoculació intracerebral) i ratolins controlats per l'edat tg338 immunostinguts per avaluar l'espongiosi (hematoxilina-eosina), la deposició de PrPSc (anticòs R486), els astròcits (glial fibril·lar àcid), la proteïna calcificada i la microglia (fibril·lar AP); -molècula adaptadora d'unió-1 Iba1). (A, E) Lesions espongiformes greus localitzades principalment al neuropil de ratolins infectats per la tremoladora versus control. (B, F) Diverses neurones positives per PrPSc són evidents en ratolins infectats amb scrapie, però absents dels controls. (C, G) Micròglia activada que mostra processos d'immunotinció i gruixuts més intensos en ratolins infectats per la tremoladora versus controls. (D, H) Augment de l'astrogliosi amb cossos cel·lulars hipertròfics i processos en ratolins infectats per la tremoladora versus controls. Les puntuacions oscil·len entre 0(negatiu) i 5 (intensitat màxima).

Es van determinar diferències significatives mitjançant la prova de Mann–Whitney U de Student t-tester per a dades distribuïdes de manera normal i no normal, respectivament. * p < 0.05,** p < 0,01. Barra d'escala=200 µm.

Figura 5. Detecció de Western blot de l'acumulació de PrPres al SNC de ratolins tg338 clínicament afectats i inoculats intracerebralment amb scrapie en comparació amb els controls coincidents.

Es van carregar quantitats de proteïnes equivalents per a una comparació adequada i es van executar immunoblots mitjançant anticorp monoclonal SHA31. Els marcadors de pes molecular (kDa) estan indicats a la part esquerra de la immunoblot.

La regulació de l'expressió de TLR en resposta a Prpsc s'ha informat anteriorment en condicions experimentals in vivo i in vitro, per tant, després de caracteritzar la presència dels principals canvis neuropatològics induïts per prions al SNC en el context de la malaltia natural i experimental, hem investigat. si aquests canvis es correlacionen amb alteracions en l'expressió del gen TLR.

Amb aquesta finalitat, vam realitzar qPCR utilitzant mostres de les quatre regions cerebrals d'ovelles per avaluar l'expressió de MyD8g i Trif, les dues proteïnes adaptadores principals implicades en la senyalització TLR; CD36, un receptor d'eliminació que coopera amb els TLR; i ARNm de TLR.

A més, vam mesurar els nivells de quatre pro- i anti-. citocines inflamatòries al tàlem i a l'hipocamp de les ovelles per avaluar encara més la resposta inflamatòria. En ratolins tg338, vam mesurar els nivells d'ARNm de MyD88 i TLR1-9 al tàlem.

Els gens per als quals es van observar diferències significatives pel que fa als controls i els canvis de plec corresponents es mostren a la taula $l, i els valors d'ACt de les ovelles de control i infectades per la tremoladora es representen a la figura $3.

El nombre de gens alterats va disminuir en direcció caudal-rostral. La medul·la oblongata de les ovelles infectades amb tremolar va ser la regió on es van observar els majors canvis en l'expressió del gen TLR (figura 6). En aquesta regió, l'expressió de TLR2, 3, 4, 6,7, 8, 9 i CD36 va ser significativament més alta (p <0.01) en els animals infectats per la tremoladora versus els animals control.
Al tàlem, TLR6, MyD88 i CD36 estaven significativament augmentats en el grup infectat per la scrapie (p <{4}}.05), mentre que TLR2 i TLR3 mostraven una tendència cap a la regulació (p <{{12}). }.1). A l'escorça frontal (la zona més rostral), TLR4 i CD36 eren els únics gens sobreexpressats (p <0, 05).

Notablement, es van trobar patrons d'expressió contrastats a l'hipocamp de les ovelles infectades per la tremoladora, en què TLR2 i MyD88 estaven regulats a la baixa (p <{3}}.01) i TLR1 va mostrar una tendència a la regulació a la baixa (p < 0,1) .

A més, l'hipocamp va ser l'única àrea en què l'expressió de CD36 no va augmentar. En general, el TLR4 va ser el gen més regulat en les ovelles infectades per scrapie versus control a les quatre regions del cervell, tot i que no es van observar diferències significatives al tàlem o a l'hipocamp a causa de la variabilitat intraindividual.

L'anàlisi dels nivells de citocines va revelar la sobreexpressió de TGF-, IL-10 i IL{-6 al tàlem de les ovelles infectades per la tremoladora versus control, però no hi ha alteracions a l'hipocamp (figura 7).

Figura 6. Expressió gènica de TLR 1-10, MyD88, Trif i CD36 a la medul·la oblongada (A), el tàlem (B), l'escorça frontal (C) i l'hipocamp (D) de les ovelles controlades i infectades per la tremoladora .

Les dades es representen com l'augment mitjà ± SEM de les ovelles control (expressat com una puntuació d'1). Les puntuacions mitjanes es van comparar mitjançant la prova t de Student o la prova U de Mann-Whitney per a dades de distribució normal i no normal, respectivament. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

Figura 7. Expressió gènica de les citocines antiinflamatòries TGF- i IL-10, i de les citocines proinflamatòries TNF- i IL{-6, al tàlem (A) i a l'hipocamp (B) de control i de la tremola natural. - ovelles infectades.

Les dades es representen com la mitjana ± canvi de plec SEM pel que fa als controls (expressat com una puntuació d'1). Les puntuacions mitjanes es van comparar mitjançant la prova t de Student o la prova U de Mann-Whitney per a dades de distribució normal i no normal, respectivament. * p < 0.

Per examinar si els canvis en l'expressió de TLR al SNC en malalties naturals són comparables als induïts en el model murií tg338 després d'una infecció intracerebral amb scrapie, es van avaluar els nivells de transcripció de TLRs i MyD88 en el tàlem oftg338 ratolins (Figura 8). Els nivells d'ARNm de TLR1 i TLR2 van augmentar significativament (p <{6}}.01) en comparació amb els controls, i hi va haver una tendència a la regulació a l'alça de TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Figura 8. Expressió gènica de TLR1-7, TLR9 i MyD88 al tàlem de ratolins tg338 afectats clínicament inoculats intracerebralment amb inòcul positiu per a la tremorosa versus controls (inòcul negatiu per la tremorosa). Els resultats s'expressen com la mitjana ± canvi de plec SEM pel que fa als controls (expressat amb una puntuació d'1). Les puntuacions mitjanes es van comparar mitjançant la prova t de Student o la prova U de Mann-Whitney per a dades distribuïdes de manera normal i no normal, respectivament. # p < {{10}},1, ** p < 0,01.

2.5. L'avaluació dels nivells de proteïna TLR4 confirma la regulació positiva detectada per qPCR en ovelles infectades amb Scrapie

Per confirmar que l'augment observat de l'ARNm de TLR4 es tradueix en canvis en els nivells de proteïnes, WB va avaluar TLR4 a la medul·la oblongada, el tàlem, l'hipocamp i l'escorça frontal de quatre ovelles infectades amb tremolar i quatre ovelles de control (figura 9).

D'acord amb els resultats de la qPCR, els nivells de proteïna TLR4 van augmentar significativament (p < 0,05) a les quatre regions cerebrals de les ovelles infectades amb la tremola.

Figura 9. Expressió de la proteïna TLR4 a la medul·la oblongata (Mo), el tàlem (Th), l'hipocamp (Hc) i l'escorça frontal (Fc) d'ovelles infectades amb tremolar versus ovelles control (n=4 per grup). -L'actina es va utilitzar com a control de càrrega.

El gràfic mostra els valors de densitometria i indica un augment significatiu de l'expressió de TLR4 a totes les regions en ovelles infectades per tremolar versus control. Les dades s'expressen com a temàtica ± SEM. Les puntuacions mitjanes es van comparar mitjançant la prova t de Student. * p < 0.05.

3. Discussió

En els darrers anys, l'estudi de la resposta neuroinflamatòria en malalties priòniques ha permès entendre millor els mecanismes subjacents i les conseqüències.

La neuroinflamació implica microgliosi i astrogliosi reactives [43], ambdues que es poden detectar abans de l'aparició dels signes clínics i precedeixen l'espongiosi i la pèrdua neuronal [7,8,18].

Si l'activació de la microglia en malalties priòniques és beneficiosa o perjudicial segueix sent un tema de debat. Alguns autors argumenten que l'activació i la proliferació de la microglia contribueixen al procés neuroinflamatori i la consegüent neurodegeneració [8,18,44].

Tanmateix, altres apunten a un paper protector general de la microglia, i els estudis in vitro indiquen que la microglia pot interioritzar i degradar PrPSc [27,45]. En línia amb aquestes troballes, els experiments in vivo han demostrat que l'esgotament de la microglia disminueix el període de supervivència, probablement a causa de la reducció de l'eliminació de PrPSc [46,47].

Per tant, és plausible que existeixin múltiples fenotips microglials reactius durant el procés de la malaltia, exercint un efecte neuroprotector en les primeres etapes de la malaltia i, a mesura que la malaltia avança, donant pas a un fenotip proinflamatori que provoca efectes perjudicials [9,10]. Una hipòtesi proposa que la senyalització TLR media l'activació de cèl·lules glials en malalties priòniques.

Se sap que la captació de fibres amiloides de la microglia a la malaltia d'Alzheimer està promoguda per l'activació de TLR [48,49]. Així, mentre que l'activació de TLR a les cèl·lules glials pot tenir un paper en l'eliminació de proteïnes agregades o anormals (per exemple, proteïnes priòniques), l'activació crònica pot ser perjudicial per a l'hoste, donant lloc a neurotoxicitat i mort de cèl·lules neuronals [50].

Fins ara, les dades sobre el paper dels TLR en la prionpatogènesi són molt limitades. Pocs estudis han mesurat els canvis en l'expressió de TLR al SNC en models murins, i un ha informat de canvis en l'expressió de TLR a la sang dels xais, amb tots els casos utilitzant animals infectats experimentalment amb malaltia priònica [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com