Immunitat protectora induïda per la vacunació d'ADN contra la infecció SARS CoV-2 en hàmsters

Fig 2. Resposta d'anticossos en ratolins després de la immunització amb vacunes d'ADN SARS-CoV i SARS-CoV-2S.

(A) Els ratolins BALB/c (n=4 per grup) es van immunitzar intramuscularment dues vegades a un interval de 3-setmanes amb 100 ug de plasmidi indicat, seguit d'electroporació. Les mostres de sèrum es van recollir en els moments indicats després de la primera immunització. (BD, F, G) Els anticossos contra la proteïna espiga de longitud completa SARS-CoV-2, la regió S2 i el RBD es van avaluar mitjançant ELISA. (E, H) L'anticòs neutralitzant induït per la vacuna contra SARS-CoV-2 es va avaluar mitjançant un assaig de neutralització. Els títols d'anticossos es presenten com a mitjana ± SEM i els títols de neutralització s'expressen com a mitjana geomètrica amb un interval de confiança del 95%. *pàg<0.05 by the Mann-Whitney test.

Per investigar més si la substitució de la seqüència líder pot augmentar la secreció de proteïnes, hem utilitzat una seqüència líder d'un activador de plasminogen tissular per fusionar diferents variants de la proteïna SARS-CoV-2 S. Totes les variants contenen la regió RBD de la proteïna SARS-CoV-2 S. Després de dues dosis d'immunització d'ADN, els sèrums recollits a la setmana 4 i a la setmana 6 es van analitzar per als títols d'anticossos IgG i d'anticossos neutralitzants. La immunització amb ptSARS2-S va induir títols d'anticossos més alts contra la proteïna S de longitud completa a la setmana 4 que la immunització ptRBD, ptRBDTM i ptSdTM (S1A Fig). Els títols d'anticossos anti-RBD de la immunització ptRBD van ser més alts que els de la immunització ptSARS2-S (1496,2 vs. 530,9, p=0,057) a la setmana 4 (S1B Fig). Tanmateix, la immunització ptRBD i ptSARS2-S va induir nivells similars d'anticossos neutralitzants a la setmana 4 (S1C Fig). Els mateixos resultats es van observar en l'anàlisi de sèrum de la setmana 6; La immunització ptRBD va induir nivells més alts d'anticossos anti-RBD en comparació amb la immunització ptSARS2-S (12589,3 vs. 1000,0, p=0,028) però els mateixos nivells d'anticossos neutralitzants (9,3). vs. 9,6 (log2)) (Fig 2F, 2G i 2H). Com que les variants fusionades amb la seqüència líder de tPA no van induir títols d'anticossos neutralitzants més alts que la immunització pSARS2-S, vam utilitzar pSARS2-S per a una investigació més profunda.

Unió competitiva d'anticossos sèrics i ACE2 al SARS-CoV-2 RBD

Per examinar la capacitat dels anticossos sèrics d'interferir amb la interacció ACE2-RBD, vam realitzar un assaig de serologia competitiva SARS-CoV-2. En aquest assaig, es van afegir anticossos sèrics a plaques ELISA recobertes prèviament amb proteïna SARS-CoV-2 RBD, seguida de l'addició de proteïna ACE2 humana. Es va utilitzar com a referència un anticòs neutralitzant específic contra SARS-CoV-2 RBD. Com es mostra aFig 3, els anticossos sèrics de ratolins immunitzats amb pSARS2-S es van unir a l'RBD i van bloquejar la unió ACE2, que era equivalent a aproximadament 353 ug/mL d'anticossos de referència, mentre que el sèrum pSARS-S era equivalent a 56 ug/mL d'anticossos de referència. Per tant, les nostres dades suggereixen que la immunització pSARS2-S podria induir anticossos competitius que bloquegen de manera eficient la unió del SARS-CoV-2 RBD al receptor ACE2. Aquest resultat va ser coherent amb el títol ELISA contra SARS-CoV2 RBD (Fig 2D), i recolzat per l'estudi sobre la diferència de seqüències RBD entre SARS-CoV i SARS-CoV-2 [24].

Fig 3. Activitat competitiva de sèrums de ratolí immunitzat contra la interacció RBD/ACE2.

Els ratolins BALB/c (n=4 per grup) es van immunitzar per via intramuscular dues vegades a un interval de 3-setmanes amb 100 ug de vector, pSARS-S o pSARS2-S, seguit d'electroporació. Les mostres de sèrum es van recollir a la setmana 8 després de la primera immunització. Els anticossos sèrics que competeixen amb ACE2 per a la unió a RBD es van avaluar mitjançant un assaig de serologia competitiva SARS-CoV-2. L'activitat competitiva dels sèrums de ratolí s'expressa com el nivell equivalent d'anticossos anti-RBD (proteïna espiga SARS-CoV-2) (anticossos de referència). Els títols d'anticossos es presenten com a mitjana ± SEM. *pàg<0.05 by the Mann-Whitney test.

Immunitat humoral a llarg termini induïda per la vacuna d'ADN SARS-CoV-2 S i ofereix protecció creuada contra el SARS-CoV-2 amb mutació D614G

En particular, es va observar el manteniment a llarg termini dels títols d'anticossos IgG contra S de longitud completa a les 20 setmanes després de la primera immunització (Figura 4A). Els títols mitjans geomètrics (log2) per a l'anticòs neutralitzant SARS-CoV-2 van arribar a 10,8 a la setmana 8 després de les immunitzacions pSARS2-S, disminuint lleugerament a 9,1 a la setmana 12 i a 8,8 a la setmana 20 (Figura 4B). Aquests resultats suggereixen que la immunització pSARS2-S confereix una resposta humoral duradora contra el SARS-CoV-2. A més, la vacuna d'ADN pSARS2-S amb el genotip D614 va induir una resposta d'anticossos neutralitzants contra el virus que conté la mutació D614G (Fig 4C), que és similar als títols de neutralització contra el genotip D614. Per tant, pSARS2-S és capaç de conferir protecció creuada contra la variant D614G més prevalent i dominant del SARS-CoV-2.

Figura 4. La vacuna d'ADN SARS-CoV-2 S va induir immunitat humoral a llarg termini i protecció creuada contra el SARS-CoV-2 amb la mutació D614G.

Els ratolins BALB/c (n=4 per grup) es van immunitzar intramuscularment tres vegades a un interval de 3-setmanes amb 100 ug de vector, pSARS-S o pSARS2-S, seguit d'electroporació. Les mostres de sèrum es van recollir en els moments indicats després de la primera immunització. (A) Els anticossos contra la proteïna espiga de longitud completa SARS-CoV-2 es van avaluar mitjançant ELISA. (B, C) L'activitat neutralitzant induïda per la vacuna contra SARS-CoV-2 amb genotips D614 o G614 es va avaluar mitjançant un assaig de neutralització. Els títols d'anticossos es presenten com a mitjana ± SEM i els títols de neutralització s'expressen com a mitjana geomètrica amb un interval de confiança del 95%. *pàg<0.05 by the Mann-Whitney test.

Inducció de respostes esbiaixades 1- o Th2-

Les cèl·lules T CD4+ efectores es poden subdividir en dos subconjunts funcionals principals, Th1 i Th2, en funció de les citocines secretades després de l'activació. Les cèl·lules Th1 produeixen citocines inflamatòries (IFN-) i participen en respostes immunes mediades per cèl·lules cap a bacteris i virus intracel·lulars, mentre que les cèl·lules Th2 segreguen principalment ajuden a les cèl·lules B a produir anticossos, però també promouen la immunitat mediada pels eosinòfils (IL-5 i IL{ {9}}), donant lloc a respostes humorals o al·lèrgiques [25, 26]. A més, els mecanismes dependents de cèl·lules Th2 poden contribuir a la malaltia respiratòria millorada associada a la vacuna (VAERD), tal com mostren els estudis de candidats a la vacuna SARS-CoV.27, 28], que posen de manifest que una resposta equilibrada de cèl·lules T és fonamental per al desenvolupament segur de la vacuna contra la COVID-19 [29]. Per solucionar aquest problema, els ratolins BALB/c i C57BL/6 es van immunitzar amb vector, pSARS-S i pSARS2-S dues vegades a un interval de 3-setmanes. Els ratolins es van sacrificar 7 dies després de la segona immunització i es van estimular els esplenòcits amb proteïna SARS-CoV-2 S (5 ug/ml) durant 3 dies. En ratolins BALB/c (Fig 5A-5D), la secreció de les citocines de tipus Th1 IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) i IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) va ser alta després de l'estimulació amb proteïna S al pSARS2-S grup d'immunització, però es van detectar nivells molt baixos de les citocines de tipus Th2 IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) i IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2). Es van observar resultats similars en ratolins C57BL/6, el grup d'immunització pSARS2-S va induir una quantitat més gran d'IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) i IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) que això d'IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) i IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Fig 5E-5H). Aquestes dades van suggerir que pSARS2-S podria induir respostes immunitàries esbiaixades per Th{1-.

Figura 5. Resposta de cèl·lules T en ratolins després de la immunització amb vacunes d'ADN pSARS-S i SARS2-S.

Els ratolins BALB/c (AD) i C57BL/6 (EH) (n=4 per grup) es van immunitzar per via intramuscular dues vegades a un interval de 3-setmanes amb 100 ug de vector, pSARS-S o pSARS{{ 8}}S, seguit d'electroporació. Els esplenòcits es van recollir a la setmana 4 després de la primera immunització i els nivells d'IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) i IL secretats -13 (D, H) es van avaluar després de la reestimulació amb proteïna S recombinant SARS-CoV-2. Els títols d'anticossos es presenten com a mitjana ± SEM. *pàg<0.05 by the Mann-Whitney test.

Repte de l'eficàcia profilàctica de les vacunes d'ADN contra el SARS-CoV-2

Per explorar l'eficàcia protectora de la vacunació pSARS2-S, els hàmsters sirians es van vacunar dues vegades amb 100 ug d'ADN a un interval de 3-setmanes i es van desafiar per via intranasal amb el virus SARS-CoV-2 a la setmana 7. (Figura 6A). Després de la immunització, es van recollir sèrums de la setmana 4 i de la setmana 6 per a l'anàlisi de títols d'anticossos anti-spike (IgG) i de títols d'anticossos neutralitzants. La immunització amb pSARS2-S va provocar nivells més alts de títols d'anticossos anti-Spike que la immunització ptRBD a la setmana 4 (1584,9 vs. 50,1) i a la setmana 6 (1995,3 vs. 63,1) en hàmsters (Figura 6B). D'acord amb els títols d'anticossos anti-Spike, els sèrums de hàmsters immunitzats amb pSARS2-S van generar títols d'anticossos neutralitzants molt alts (6,5 a la setmana 4 i 6,4 a la setmana 6 (log2)), però els sèrums de vectors o Els hàmsters immunitzats amb ptRBD no ho van fer (Fig 6C). Després del repte amb SARS-CoV-2, el pes corporal del hàmster es va controlar cada dia. Estudis anteriors van revelar que el títol viral als pulmons dels hàmsters va assolir un nivell alt als 3 dies després del repte.30]. Per tant, la meitat dels hàmsters de cada grup es van sacrificar el dia 3 i es va analitzar la càrrega viral al pulmó. El pes corporal dels hàmsters vacunats amb vectors va disminuir gradualment i el percentatge de pes corporal perdut va ser de l'11,1% als 6 dies posteriors al repte. En canvi, la immunització pSARS2-S va protegir els hàmsters de la pèrdua de pes corporal (Figura 6D). A més, els títols de virus infecciosos i el nombre de còpies d'ARN viral al grup pSARS2-S van mostrar reduccions de 2,29 i 1,37 log10 en comparació amb el grup de control de vectors (Fig 6E i 6F). Aquests resultats suggereixen que la immunització pSARS2-S confereix protecció contra la infecció per SARS-CoV-2 als hàmsters sirians.

Figura 6. Eficàcia profilàctica de la vacuna d'ADN SARS-CoV-2S en hàmsters infectats amb SARS-CoV-2-.

(A) Curs temporal de la vacunació amb ADN i el repte del SARS-CoV-2. Els hàmsters sirians es van vacunar per via intramuscular dues vegades a un interval de 3-setmanes amb 100 ug de control, pSARS-S o pSARS2-S, seguit d'electroporació. Les mostres de sèrum es van recollir mitjançant mostreig de sang retroorbital a les setmanes 4 i 6 després de la primera immunització. A les 4 setmanes després de la segona immunització, els hàmsters sirians van ser desafiats per via intranasal amb 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Els anticossos contra la proteïna espiga de longitud completa SARS-CoV-2 es van avaluar mitjançant ELISA. (C) L'activitat neutralitzant induïda per la vacuna contra SARS-CoV-2 es va avaluar mitjançant un assaig de neutralització. (D) El canvi de pes corporal (%) dels hàmsters es va registrar cada dia després del repte SARS-CoV-2. Els títols de virus (E) i les còpies d'ARN viral (F) als pulmons de hàmsters infectats amb SARS-CoV-2- als 3 dies posteriors al repte es van determinar mitjançant un assaig TCID50 i qRT-PCR, respectivament. Els títols d'anticossos es presenten com a mitjana ± SEM i els títols de neutralització s'expressen com a mitjana geomètrica amb un interval de confiança del 95%. *pàg<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Discussió

S'han posat en marxa més de 80 assaigs clínics de vacunes contra la COVID-19, i els estudis d'immunogenicitat i desafiament viral en animals són passos crítics en els processos de desenvolupament de vacunes. Les vacunes d'ADN per a la infecció per SARS-CoV-2 s'han desenvolupat intensament per a diferents enfocaments de lliurament. L'electroporació és un enfocament prometedor que pot millorar el lliurament d'ADN i l'antigenicitat dels immunogens in vivo. S'han informat dos estudis sobre vacunes d'ADN, per Yu et al. [13] i Smith et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 reduccions log10 de les càrregues virals en el rentat broncoalveolar després del desafiament en comparació amb els controls. Smith et al. va trobar que la immunització de ratolins i conillets d'índies amb INO-4800 (que codifica la proteïna S de longitud completa) amb electroporació podria provocar anticossos neutralitzants contra la infecció per SARS-CoV-2 i bloquejar la unió de la proteïna S al receptor ACE2, però ho va fer. no proporcionar dades de desafiaments amb animals. En aquest informe, hem avaluat diferents variants de candidats a la vacuna d'ADN i hem trobat que la proteïna S de longitud completa (pSARS2-S) és la més adequada per a un estudi immunològic posterior. Tot i que SARS-CoV i SARS-CoV-2 comparteixen un 76% d'homologia a les seves proteïnes S [31, 32], la immunització pSARS-S no pot induir anticossos contra el RBD de la proteïna SARS-CoV-2 S ni títols d'anticossos neutralitzants contra la infecció per SARS-CoV-2 (Fig 2). De fet, els anticossos anti-RBD tenen un paper important en el bloqueig de la infecció viral. Tanmateix, la immunització només amb RBD (ptRBD) va generar títols d'anticossos neutralitzants elevats en ratolins però no en hàmsters (Figs.2Hi6C). Hem especulat que aquest resultat pot ser degut al fet que el pèptid senyal (activador del teixit-plasminogen) no facilita la secreció de la proteïna RBD en hàmsters. El mecanisme detallat requereix més estudi en el futur. També vam observar que la immunització ptRBDTM (que codifica un fragment del RBD al domini transmembrana de S) va induir títols d'anticossos neutralitzants més baixos que la immunització ptRBD (Figs.2HiS1C). Els resultats poden reflectir l'estructura inestable de la proteïna RBD-TM. Per investigar més a fons les respostes immunes Th1/Th2, es van estimular esplenòcits de ratolins immunitzats amb proteïna SARS-CoV-2 S. Vam trobar que la immunització pSARS2-S va induir fortes respostes immunes esbiaixades per Th{1- amb nivells més alts de secreció d'IFN{- -després de l'estimulació (Fig 5), però la immunització pSARS-S només va induir nivells baixos de secreció d'IFN- -. Aquestes dades van indicar que la reactivitat creuada de les respostes de les cèl·lules T entre la proteïna espiga de SARS-CoV i SARS-CoV-2 no és alta (Fig 5). A més, l'assaig IFN-ELISPOT va revelar que es van detectar menys respostes de cèl·lules T contra la regió S1 en ratolins C57BL/6 i BALB/c immunitzats amb pSARS-S (S2 Fig), que també es recolza en l'estudi de Smith [12]. Aquestes dades indicaven que la vacuna contra el SARS pot no proporcionar un efecte protector total contra la infecció per SARS-CoV-2. El desenvolupament de vacunes d'ADN és important per a una resposta ràpida a la infecció pandèmica per coronavirus. Per tant, l'èxit de la vacuna d'ADN contra SARS-CoV-2 es podria aplicar a altres malalties infeccioses emergents.

Les diferents construccions utilitzades a les vacunes d'ADN SARS-SoV-2 van induir diferents nivells de títols d'anticossos neutralitzants. La seqüència líder de tPA s'ha utilitzat per augmentar l'expressió i la secreció d'antigen en vacunes d'ADN.21, 33–35]. Tanmateix, la seqüència líder de tPA no va augmentar significativament els títols d'anticossos en aquest informe. Per augmentar encara més l'eficàcia de la vacuna, es podrien utilitzar diferents seqüències líders per substituir la seqüència líder nativa de la proteïna espiga. La seqüència líder d'IgE es va utilitzar a la vacuna d'ADN INO-4800 i a la vacuna MERS-CoV [5, 12]. A més, la seqüència de proteïnes de punta modificada també pot augmentar la immunogenicitat de la vacuna. S'ha dissenyat una proteïna espiga estabilitzada mutant el lloc de la furina i altres regions per generar una estructura de prefusió (S-2P) que pot augmentar l'expressió de la proteïna espiga ~10-fold [36]. Una vacuna d'ADN ideal hauria d'optimitzar la construcció i el sistema de lliurament d'ADN plasmidi per augmentar el nivell d'expressió de proteïnes.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Els models animals són fonamentals per al desenvolupament de la vacuna contra la COVID-19. S'han utilitzat diversos models animals per avaluar l'eficàcia de les vacunes COVID-19, inclosos els primats no humans [13, 37], ratolins transgènics ACE2 humans [38] i hàmsters sirians [39]. El hàmster sirià ACE2 té una gran similitud amb l'ACE2 humà, i la seva afinitat d'unió amb la proteïna S del SARS-CoV-2 es va predir més alta que l'ACE2 del ratolí.40]. Aquesta és la raó per la qual es van utilitzar ratolins transgènics ACE2 humans com a models de desafiament SARS-CoV-2, però no ratolins de tipus salvatge. Els estudis de transmissió del SARS-CoV-2 han demostrat que el virus pot infectar eficientment hàmsters ingènus mitjançant el contacte directe o mitjançant aerosols [41]. La infecció intranasal del SARS-CoV-2 es pot replicar i induir la patogènesi als pulmons dels hàmsters sirians.30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>reducció del 5% respecte a la línia inicial), que es va associar amb una durada més llarga de la malaltia [42]. Aquestes troballes indiquen que el hàmster sirià també és un model animal adequat per a l'avaluació de vacunes COVID-19. A partir de la disponibilitat de models animals, vam triar hàmsters com a model de repte SARS-CoV-2 per avaluar l'eficàcia de la vacuna. Les nostres dades van demostrar que la immunització amb pSARS2-S, però no amb ptRBD, pot induir títols elevats d'anticossos IgG anti-Spike i títols d'anticossos neutralitzants (Fig 6B i 6C). En conseqüència, els hàmsters immunitzats amb pSARS2-S, però no els hàmsters immunitzats amb ptRBD, van generar respostes immunes contra el repte SARS-CoV-2. Hem observat que la immunització amb ptRBD podria induir nivells elevats de títols d'anticossos neutralitzants en ratolins, però no en hàmsters. Els resultats contradictoris poden ser perquè RBD sol no s'expressa de manera estable en hàmsters. El model de hàmster també es va utilitzar per avaluar la vacuna COVID-19 basada en vectors del serotip 26 (Ad26). Una única immunització amb la vacuna basada en vectors Ad26 que expressa una proteïna espiga estabilitzada per SARS-CoV-2 que va provocar respostes d'anticossos neutralitzants i protegida contra la infecció per SARS-CoV-2 va induir pèrdua de pes, mortalitat parcial i replicació viral. al pulmó [39]. Aquests resultats van indicar que el model de hàmster és adequat per avaluar l'eficàcia de les vacunes COVID-19.

Molts esforços de desenvolupament de vacunes contra el SARS-CoV-2 es basen en l'experiència de recerca de MERS-CoV i SARS-CoV. A nivell mundial, s'han aprovat diverses vacunes contra la COVID-19 per a un ús emergent el desembre de 2020, incloses les vacunes basades en vectors d'ARN i adenovirus COVID-19. S'han discutit els avantatges i desavantatges de diferents plataformes de vacunes [43]. Les vacunes de vectors d'adenovirus poden provocar respostes immunitàries més fortes que les vacunes d'ADN i ARNm, però la seva eficàcia de la vacuna es podria reduir a través d'una immunitat preexistent contra els vectors ad.44]. En comparació amb la vacuna d'ADN, la vacuna d'ARNm necessita una temperatura molt baixa per a l'emmagatzematge i el transport.45]. Per tant, la vacuna d'ADN podria ser una plataforma potencial de vacuna, especialment durant l'ús d'emergència.

El nostre estudi suggereix la possibilitat d'una vacuna d'ADN per a ús humà. Estudis posteriors podrien investigar l'eficàcia d'aquesta vacuna d'ADN administrada mitjançant injecció intradèrmica (ID), que és més convenient per a l'aplicació clínica, perquè l'agulla per a la injecció IM té una profunditat d'aproximadament 18 mm en humans i afecta més teixits que la injecció ID per EP. A més, l'eficàcia de la vacuna s'hauria de provar en ratolins d'edat avançada com a model per a humans grans, perquè aquesta població es veu especialment afectada quan s'infecta pel SARS-CoV-2. Estudis anteriors van demostrar que la resposta de les cèl·lules Th2 s'ha associat amb una malaltia respiratòria millorada (VAERD) després de la vacunació de vacunes de virus inactivats contra el VRS.46], virus del xarampió [47] i SARS-CoV [27, 48]. En canvi, hi ha casos menys greus de SARS-CoV derivats de la inducció de la resposta de les cèl·lules Th1 que s'han informat.49]. Per tant, les fortes respostes immunes esbiaixades de Th1- induïdes per la vacuna d'ADN suggereixen que és poc probable que els efectes secundaris siguin un problema important [50]. A més d'això, s'han plantejat preocupacions sobre les vacunes basades en proteïnes a causa de l'ús de sal d'alumini o d'adjuvants tipus emulsió d'oli en aigua, que condueixen a respostes immunitàries esbiaixades per Th2- i augmenten els possibles efectes secundaris.51, 52]. En resum, la vacuna d'ADN COVID-19 pot tenir un paper important en el control de la pandèmia COVID-19 en un futur proper.

Referències

1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Conseqüències econòmiques del brot de COVID-19: la necessitat de preparar-se per a epidèmies. Front de Salut Pública. 2020;8:241. pmid: 325743072. Centre de Ciència i Enginyeria de Sistemes (CSSE) [Internet]. Tauler de control de la COVID-19. Universitat Johns Hopkins. [citat l'11 de febrer de 2021]. Disponible des de:
2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, et al. Aportacions de les proteïnes estructurals del coronavirus de la síndrome respiratòria aguda severa a la immunitat protectora. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid: 15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. Una vacuna d'ADN indueix la neutralització del coronavirus SARS i la immunitat protectora en ratolins. Naturalesa. 2004;428(6982):561–4. pmid: 15024391
4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Una vacuna d'ADN de proteïnes anti-espiga de consens sintètic indueix una immunitat protectora contra el coronavirus de la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà en primats no humans. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid: 26290414
5. 6. Vacunes de Krammer F. SARS-CoV-2 en desenvolupament. Naturalesa. 2020;586(7830):516–27. pmid: 32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. Immunitat protectora contra els candidats a la vacuna de la subunitat SARS basats en la proteïna Spike: Lliçons per al desenvolupament de la vacuna contra el coronavirus. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid: 32695833
7. 8.Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, et al. Respostes immunitàries humorals i cel·lulars induïdes per vacunes d'ADN 3a contra la síndrome respiratòria aguda severa (SARS) o coronavirus semblant al SARS en ratolins. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(1):73–7. pmid: 18987164
8. 9.Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Obtenció d'anticossos neutralitzants amb vacunes d'ADN que expressen trímers de glicoproteïnes d'embolcall de tipus 1 del virus de la immunodeficiència humana estabilitzats solubles conjugats a C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid: 15078953
9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Optimització d'una vacuna d'ADN contra el SARS. ADN Cel·lular Biol. 2007;26(10):721–6. pmid: 17665998
10. 11.Gary EN, Weiner DB. Vacunes d'ADN: el prime time és ara. Curr Opin Immunol. 2020;65:21–7. pmid: 32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, et al. Immunogenicitat d'una vacuna d'ADN candidata a la COVID-19. Nat Commun. 2020;11(1):2601. pmid: 32433465
12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, et al. Protecció de la vacuna d'ADN contra SARS-CoV-2 en macacs rhesus. Ciència. 2020;369(6505):806–11. pmid: 32434945
13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Mètodes de lliurament per augmentar la captació cel·lular i la immunogenicitat de les vacunes d'ADN. Vacuna. 2016;34(46):5488–94. pmid: 27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, et al. Resposta ràpida a una malaltia infecciosa emergent: lliçons apreses del desenvolupament d'una vacuna d'ADN sintètic dirigida al virus Zika. Els microbis infecten. 2018;20(11–12):676–84. pmid: 2955534516.Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Signatura molecular i cel·lular innata a la pell que precedeix les respostes de llarga durada de les cèl·lules T després de la vacunació amb ADN electroporat. J Immunol. 2020;204(12):3375–88. pmid: 32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et al. Un nou dispositiu prototip per al lliurament de la vacuna d'ADN millorada per electroporació simultàniament tant a la pell com al múscul. Vacuna. 2011;29(39):6771–80. pmid: 21199706
16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS, et al. Immunogenicitat i eficàcia protectora millorades d'una vacuna d'ADN del dengue tetravalent mitjançant electroporació i lliurament intradèrmic. Vacuna. 2019;37(32):4444–53. pmid: 31279565
17. 19. Ramakrishnan MA. Determinació del títol final del 50% mitjançant una fórmula senzilla. Món J Virol. 2016;5(2):85–6. pmid: 27175354
18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Detecció del nou coronavirus del 2019 (2019-nCoV) mitjançant RT-PCR en temps real. Eurovigilància. 2020. pmid: 31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q, et al. La seqüència de senyal de l'activador del plasminogen tissular (tPA) millora la immunogenicitat de la vacuna basada en MVA contra la tuberculosi. Immunol Lett. 2017;190:51–7. pmid: 28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y, et al. Mecanisme de fusió de 2019-nCoV i inhibidors de fusió dirigits al domini HR1 a la proteïna espiga. Cell Mol Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid: 32047258