L'equinacòsid protegeix contra la 6-disfunció mitocondrial induïda per hidroxidopamina i les respostes inflamatòries a les cèl·lules PC12 mitjançant la reducció de la producció de ROS

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 i Guan-Hua Du1,2

La malaltia de Parkinson (MP) és un trastorn neurodegeneratiu caracteritzat per la pèrdua progressiva de neurones dopaminèrgiques (DA) a la substància negra. La disfunció mitocondrial i les respostes inflamatòries estan implicades en el mecanisme de dany cel·lular en la MP. 6-La hidroxidopamina (6-OHDA), un anàleg de la dopamina, danya específicament les neurones dopaminèrgiques.Echinacòsid(ECH) és un glicòsid feniletanoide aïllat de les tiges deCistanche salsa, mostrant una varietat d'efectes neuroprotectors en estudis anteriors. El present estudi era investigar el seu efecte contra la neurotoxicitat induïda per 6-OHDA i els possibles mecanismes a les cèl·lules PC12. Els resultats van mostrar que 6-OHDA va reduir la viabilitat cel·lular, va disminuir l'activitat d'oxidació-reducció, va disminuir el potencial de membrana mitocondrial i va induir l'apoptosi mediada per mitocondris en comparació amb les cèl·lules PC12 no tractades. Malgrat això,equinacòsidel tractament va atenuar significativament aquests canvis induïts per 6-OHDA. A més,equinacòsidtambé podria alleujar significativament les respostes inflamatòries induïdes per 6-OHDA. Investigacions posteriors ho van demostrarequinacòsidpodria reduir 6-la producció de ROS induïda per OHDA a les cèl·lules PC12. Aquests resultats suggereixen que el mecanisme subjacent deequinacòsidcontra 6-la neurotoxicitat induïda per OHDA pot implicar atenuar la disfunció mitocondrial i les respostes inflamatòries reduint la producció de ROS.

1. Introducció

malaltia de Parkinson (PD)és un trastorn neurodegeneratiu caracteritzat per la degeneració lentament progressiva de les neurones de dopamina a la substància negra pars compacta [1]. Tot i que les característiques neuropatològiques de la MP estan ben descrites, l'etiologia encara no està definida. En particular, diverses observacions suggereixen que la disfunció mitocondrial està implicada en la patogènesi de la MP i la degeneració de les neurones dopaminèrgiques [2, 3]. Els mitocondris contenen molts enzims redox i les ineficiències naturals de la fosforilació oxidativa generen espècies reactives d'oxigen (ROS) [4]. Recentment, l'evidència creixent d'estudis humans i animals ha suggerit que la neuroinflamació també és un contribuent important a la pèrdua neuronal en la MP [5].

6-La hidroxidopamina (6-OHDA) és específica de les neurones dopaminèrgiques en models de rosegadors intraestriatal i en algunes cèl·lules [6–11]. La cèl·lula PC12 s'ha convertit en un model cel·lular popular per a la investigació de la PD perquè aquesta línia cel·lular posseeix moltes característiques de les neurones DAèrgiques. S'ha utilitzat com a model in vitro per a l'estudi de la MP i per determinar l'efecte dels agents protectors i terapèutics. L'equinacòsid (figura 1) és un glicòsid feniletanoide aïllat i purificat de les tiges deCistanche salsa[12], una planta paràsita originària del nord-oest de la Xina, que s'utilitza com a prova de mecanismes subjacents d'echinacòsid contra 6-danys induïts per OHDA a les cèl·lules PC12.

2. Materials i Mètodes

2.1. Materials. L'echinacòsid es va obtenir dels Instituts Nacionals de Control d'Aliments i Drogues (Beijing, Xina). Es van obtenir RPMI-1640 i sèrum boví fetal de Gibco

(Grand Island, NY, EUA). 6-OHDA, MTT, 2,7-diacetat de diclorodihidrofluoresceïna, iodur de propidi (PI) i resazurina es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). El kit d'assaig bioluminescent d'ATP es va obtenir de Promega (Madison, EUA). El kit d'assaig de 5,5,6,6 -tetracloro{-1,1,3,3 -tetraetil benzimidazolil carbocianina iodur (JC{-1) es va obtenir del Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, Xina). El kit ELISA del citocrom C i el substrat fluorogènic Ac-DVD-AMC es van obtenir d'Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Els kits IL-1 i IL{-6 ELISA es van obtenir de Boster Bio-engineer limited company (Wuhan, Xina). El lector de microplaques Spectramax M5 es va comprar a l'empresa Molecular Devices (Sunnyvale, CA, EUA).

2.2. Cultiu i tractament cel·lular. Les cèl·lules PC12 es van cultivar en RPMI-1640 complementat amb un 10 per cent de sèrum de cavall i un 5 per cent de sèrum fetal boví. Les condicions es van mantenir a 37 ∘ C en una atmosfera humidificada que contenia un 5 per cent de CO2 [19]. Les cèl·lules es van xapar en plaques de 96-pous a una densitat de 2 × 105 cèl·lules/ml. Després d'una confluència del 80 per cent, les cèl·lules es van preincubar amb diferents concentracions d'echinacòsid en un medi RPMI-1640 sense sèrum durant 1 h. A continuació, es va afegir 6-OHDA als pous a una concentració final de 100 M i es va incubar per a un altre Després del tractament, es van observar canvis morfològics sota un microscopi. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant un assaig MTT [19]. Breument, després del tractament, es va afegir MTT a la concentració final de 0, 5 mg/ml a cada pou i es va incubar durant 4 h a 37 ∘ C.

2.3.Assaig de canvis morfològics i viabilitat de cèl·lules PC12. Després del tractament, es van observar canvis morfològics al microscopi. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant un assaig MTT [19]. Breument, després del tractament, es va afegir MTT a la concentració final de 0,5 mg/ml a cada pou i es va incubar durant 4 h a 37 ∘ C. A continuació, es va eliminar el sobrenedant i el producte de formazà es va dissoldre en 100 L de sulfòxid de dimetil amb agitació durant 15 min en un agitador de plaques de microtitulació i es va llegir l'absorbància a 570 nm mitjançant un lector de microplaques Spectramax M5. Medicina alternativa i complementària basada en l'evidència

2.4. Assaig del nivell d'ATP intracel·lular. El nivell d'ATP cel·lular es va mesurar amb un kit d'assaig bioluminescent d'ATP segons les instruccions del fabricant. La luminescència es va controlar en un lector de microplaques en mode de luminescència després de l'addició de 100 L de luciferina i luciferasa [20].

2.5. Mesura de l'activitat d'oxidació-reducció dels mitocondris per resazurina. Després del tractament, es va afegir resazurina a una concentració final de 5 M als pous i es va examinar la intensitat de la fluorescència a una excitació de 530 nm i una emissió de 590 nm [21].

2.6. Mesura del potencial de la membrana mitocondrial per JC-1. El potencial de la membrana mitocondrial es va mesurar mitjançant el kit d'assaig JC-1 segons les instruccions del fabricant. Després del tractament, es va retirar el medi de cultiu i es va carregar amb una solució JC-1 durant 15 min a 37 ∘ C a la foscor. La intensitat de fluorescència de la relació vermell/verd es va determinar a una excitació de 490 nm i una emissió de 530 nm (monòmers fluorescents verds) i 590 nm (agregats fluorescents vermells), respectivament [22].

2.7. Quantificació de l'alliberament del citocrom C. Els nivells de citocrom C citosòlic es van mesurar mitjançant un kit ELISA segons les instruccions del fabricant [23]. Breument, després del tractament, les cèl·lules es van lisar i es van centrifugar a 1000 g durant 15 min, i després es va recollir el sobrenedant com a fracció citoplasmàtica i es va utilitzar per mesurar l'alliberament del citocrom C.

2.8. Determinació de l'activitat de la caspasa-3. L'activitat de caspasa-3 es va realitzar segons les referències amb modificació [24]. Breument, després del tractament, es va afegir el tampó de lisi a cada pou i després es va centrifugar a 12 000 g durant 10 min. L'activitat de la caspasa-3 es va provar en els sobrenedants resultants mesurant la divisió proteolítica del substrat fluorogènic Ac-DVD-AMC amb una longitud d'ona d'excitació de 380 nm i una longitud d'ona d'emissió de 460 nm.

2.9. Assaig de citometria de flux en cèl·lules PC12. Després del tractament, les cèl·lules es van tripsinitzar, es van rentar dues vegades amb PBS, es van centrifugar a 1000 r / min durant 5 min i després es van fixar amb etanol al 70 per cent durant la nit a 4 ∘ C. Les cèl·lules es van centrifugar i es van rentar dues vegades amb PBS, es van tornar a suspendre en PBS (que contenia 50 g/mL de RNaseA), es van tacar amb PI a la concentració final de 10 M durant 30 min a temperatura ambient a la foscor i es van llegir en un citòmetre de flux a 488ºC. excitació nm [10].

2.10. Mesura del nivell IL-1 i IL-6 mitjançant assaig ELISA. El medi de cèl·lules PC12 cultivades es va recollir després del tractament i les concentracions d'IL-1 i IL{-6 es van mesurar mitjançant kits ELISA disponibles comercialment segons el protocol del fabricant home.

2.11. Determinació del nivell d'espècies d'oxigen reactiu intracel·lular. Després de la incubació amb 6-OHDA, les cèl·lules es van carregar amb 10 M H2DCFH-DA durant 30 min a 37 ∘ C a la foscor. La intensitat de fluorescència del DCF es va mesurar en una excitació

Longitud d'ona de medicina alternativa i complementària basada en l'evidència de 495 nm i longitud d'ona d'emissió de 530 nm en un lector de microplaques [25].

2.12. Anàlisi estadística. Totes les dades s'expressen com a mitjana ± SD. L'anàlisi estadística dels resultats es va dur a terme mitjançant anàlisi de variància unidireccional (ANOVA), seguida de -test. La significació estadística es va acceptar a <>

3. Resultats

3.1. Efecte de l'equinacoside en la morfologia i la viabilitat cel·lular en cèl·lules PC12 danyades per 6-OHDA. Tal com es mostra a la figura 2 (A), la viabilitat de les cèl·lules PC12 no tenia cap diferència significativa a la concentració de 0.1 ~ 10 M de tractament amb equinacòsid per a

24 h. Tal com es mostra a la figura 2 (B), dins de les 24 hores posteriors al tractament amb 6-OHDA només, la majoria de les cèl·lules PC12 havien sofert canvis morfològics, com ara el buit de membrana i la contracció cel·lular. El tractament complementari amb equinacòsid va protegir les cèl·lules del dany 6-OHDA. L'assaig MTT va demostrar que el tractament de cèl·lules PC12 només amb 6-OHDA va donar lloc a una reducció d'aproximadament un 25 per cent de la supervivència cel·lular en 24 hores, mentre que el cotractament amb {{10}}, 1 M, 1 M, i l'echinacòsid de 10 M va mostrar una reducció de la citotoxicitat mediada per 6-OHDA (tots < 0,="" 01,="" figura="" 2="">

3.2. Efecte de l'echinacòsid sobre la disfunció mitocondrial induïda per 6-OHDA a les cèl·lules PC12. Els nivells d'ATP cel·lular es van reduir significativament després d'una incubació de 24 hores amb 100M 6-OHDA, mentre que el cotractament amb 1 Mand 10 M d'equinàcòsid va alleujar 6-ATP mediat per OHDA disminueix els canvis anabòlics a les cèl·lules PC12. . Els resultats van mostrar que el cotractament amb 1 Mand 10 M d'equinacòsid podria atenuar significativament el deteriorament de l'activitat d'oxidació-reducció dels mitocondris induït per 6-OHDA (tant < 0,="" 05="" com="" la="" figura="" 3="">

Com es mostra a la figura 3 (c), el tractament amb 100 M de 6- OHDA durant 24 h va donar lloc a una disminució significativa del potencial de la membrana mitocondrial en comparació amb el grup no tractat (< {="" {11}}.01).="" no="" obstant="" això,="" la="" disminució="" del="" potencial="" de="" membrana="" mitocondrial="" induïda="" per="" 6-ohda="" es="" va="" atenuar="" significativament="" pel="" cotractament="" amb="" 0,="" 1="" m,="" 1="" m="" i="" 10="" m="" d'echinacòsid="" (tots="">< 0,="">

3.3. Apoptosi d'echinacòsid mediada per anti-mitocondris a les cèl·lules PC12 contra la neurotoxicitat 6-OHDA. Els resultats van mostrar que l'exposició a 6-OHDA va provocar un augment del citocrom C citosòlic en un 167 per cent respecte al grup no tractat ( < 0.{{10}}1).="" l'echinacòsid="" a="" la="" dosi="" de="" 0,1="" m,="" 1="" m="" i="" 10m="" podria="" reduir="" significativament="" l'alliberament="" de="" citocrom="" c="" al="" citosol="" induït="" per="" 6-ohda=""><0,05,><0,01 i="">< 0,01,="" resp.;="" figura="">

L'activitat de la caspasa{{0}} es va incrementar uns 3.3-vegades en comparació amb el grup no tractat després de l'6-exposició a l'OHDA (<0.01. ).="" en="" canvi,="" el="" cotractament="" amb="" 1="" m="" i="" 10="" m="" d'equinacòsid="" va="" mostrar="" una="" disminució="" significativa="" de="" l'activitat="" de="" la="" caspasa-3="" en="" comparació="" amb="" les="" cèl·lules="" tractades="" amb="" 6-ohda,="" respectivament="" (tant="">< 0,="" 05="" com="" la="" figura="" 4="" (="" b)).pi="" és="" la="" permeabilitat="" de="" la="" membrana="" i="" generalment="" s'exclou="" de="" les="" cèl·lules="" viables.="" per="" tant,="" s'utilitza="" habitualment="" per="" identificar="" cèl·lules="" mortes="" en="" una="" població.="" els="" resultats="" van="" mostrar="" que="" la="" taxa="" d'apoptosi="" va="" augmentar="" significativament="" després="" d'incubacions="" de="" 24="" h="" amb="" 100="" m="" 6-ohda,="" mentre="" que="" el="" tractament="" complementari="" amb="" 1="" i="" 10="" m="" equinacòsid="" va="" reduir="" significativament="" l'6-apoptosi="" induïda="" per="" 6-ohda="">< 0,="" 05,="">< 0,="" 01,="" resp.,="" figura="">

3.4. Efecte antiinflamatori de l'equinacòsid a les cèl·lules PC12 induït per 6-OHDA. Els resultats van mostrar que 6-l'exposició a l'OHDA va donar com a resultat un augment del nivell de IL-1 en comparació amb el grup no tractat (<0.{05; figura="" 4(a)).="" tanmateix,="" 10="" m="" d'equinacòsid="" podrien="" reduir="" significativament="" l'alliberament="" d'il-1="" induït="" per="" 6-ohda=""><0, 05;="" figura="" 5="">

El nivell d'IL{{{0}} també va augmentar significativament en comparació amb el grup no tractat (<0.01). tanmateix,="" el="" cotractament="" amb="" 0,="" 1,="" 1="" i="" 10="" m="" d'echinacòsid="" va="" disminuir="" significativament="" l'alliberament="" d'il-6="" en="" comparació="" amb="" les="" cèl·lules="" tractades="" amb="" 6-ohda="" (tant="">< 0,="" 05="" com="" la="" figura="" 5="">

3.5. Efecte de l'ECH sobre la producció de ROS induïda per 6-OHDA a les cèl·lules PC12. Les cèl·lules tractades amb 6-OHDA van mostrar un augment significatiu (aproximadament 1,4- vegades) de ROS intracel·lular en comparació amb les cèl·lules no tractades (<0.01). aquest="" augment="" es="" va="" atenuar="" significativament="" per="" la="" coincubació="" amb="" 0.1,="" 1="" i="" 10="" mequinacòsid=""><0.05,><0.01, i=""><0.01, resp.;="" figura="" 6)="">

4. Discussió

L'echinacòsid és un dels components principals dels glicòsids feniletanoides extrets d'un famós echinacòsid tradicional que té propietats antiapoptòtiques i neuroprotectores en malalties neurodegeneratives [18]. L'estudi in vivo va informar que l'echinacòsid va tenir efectes neuroprotectors i una millora del comportament en el model de ratolí de dany neuronal dopaminèrgic induït per MPTP, mentre que una investigació posterior va revelar que l'equinacòsid induïa la baixada de l'activació de la caspasa-3 i la caspasa-8 en MPP plus. -apoptosi induïda de les neurones granulars cerebel·loses [16]. Un altre estudi in vivo va informar dels efectes neuroprotectors de l'equinacòsid sobre les neurones dopaminèrgiques estriatals lesionades per 6-OHDA [17]. Tanmateix, els mecanismes cel·lulars i moleculars que subjauen a aquestes accions no s'entenen del tot, especialment per la seva influència en la funció mitocondrial i les respostes a la inflamació. Així, el nostre estudi actual va investigar els efectes de l'equinacòsid sobre la funció mitocondrial i les respostes a la inflamació per dilucidar el seu mecanisme contra la PD. Els resultats van mostrar en primer lloc que l'echinacòsid va alleujar significativament la neurotoxicitat induïda per 6-OHDA a les cèl·lules PC12 mitjançant la protecció de la funció mitocondrial i la antiinflamació.

La disfunció mitocondrial ha estat implicada durant molt de temps en la mort de les neurones dopaminèrgiques nigrostriatals en la malaltia de Parkinson i els seus models experimentals [26]. Els mitocondris estan profundament implicats en la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) a través dels portadors d'electrons de la cadena respiratòria en malalties neurodegeneratives [27]. Una àmplia varietat de ROS es produeix en el curs del metabolisme normal en sistemes biològics, però la seva acumulació més enllà del

La quantitat necessària pot danyar els lípids, les proteïnes i els àcids nucleics.

6-OHDA, un anàleg de catecolamines, provoca una degeneració específica de les neurones de la substància negra. La neurotoxicitat induïda per 6-OHDA es deu, en part, a la producció de ROS [28–32].

L'OHDA condueix a la mort neuronal afectant la funció dels mitocondris, inclosa la reducció de la producció d'ATP, la alteració del metabolisme de ROS i la inducció de l'apoptosi [10, 33, 34]. En el present estudi, els nostres resultats també van demostrar que 6-OHDA va danyar la funció de reducció oxidativa mitocondrial, va disminuir el potencial de membrana mitocondrial, va induir l'apoptosi mediada per mitocondris i va augmentar la producció de ROS a les cèl·lules PC12.

La resazurina és un indicador fluorescent que només és intermedi entre les reduccions finals d'oxigen molecular i de la citocrom oxidasa. Per tant, el potencial de reducció oxidativa de la resazurina permet que la cadena respiratòria funcioni gairebé a la seva fi, cosa que proporcionarà una indicació més precisa i sensible de la funció mitocondrial. JC-1 és una sonda sensible al potencial de membrana que es localitza a la membrana mitocondrial interna on forma monòmers (verd) o agregats (vermell) basats en el potencial de membrana mitocondrial. Així, la resazurina i la JC-1 són eines analítiques valuoses per examinar la funció mitocondrial [35]. El present estudi va indicar que la disminució de l'activitat de reducció oxidativa mitocondrial i el potencial de membrana mitocondrial poden tenir un paper important en la neurotoxicitat dopaminèrgica induïda per 6-OHDA. El nostre resultat també va mostrar l'activitat de reducció oxidativa mitocondrial i el potencial de membrana mitocondrial. Aquests resultats proporcionen que la millora de la disfunció mitocondrial pot ser una millor manera de frenar la neurodegeneració dopaminèrgica progressiva associada habitualment a la MP.

En general, s'accepta que l'apoptosi cel·lular induïda per 6- OHDA està mediada per una disfunció mitocondrial, caracteritzada per l'alliberament de citocrom C i l'activació de la caspasa-3 [36]. Un estímul apoptòtic desencadena l'alliberament del citocrom C dels mitocondris al citosol on després activa la caspasa-3 i altres caspases aigües avall. En el present estudi, els resultats van mostrar que les cèl·lules PC12 exposades a 100 M de 6-OHDA milloraven l'alliberament del citocrom C i l'alliberament del citocrom C i les activacions de la caspasa- 3 depenent de la caspasa. Aquests resultats suggereixen que l'echinacòsid podria inhibir l'apoptosi mediada per mitocondris reduint l'alliberament del citocrom C dels mitocondris a l'activació del citosol i la caspasa-3.

La inflamació és una característica neuropatològica dels cervells de Parkinson i també en models experimentals de la malaltia. Les estratègies terapèutiques orientades a reduir la inflamació i inhibir la producció d'aquests factors inflamatoris poden ser una estratègia neuroprotectora prometedora per al tractament de la malaltia de Parkinson i condicions relacionades [37]. Diversos estudis realitzats també al líquid cefaloraquidi i durant l'anàlisi postmortem en pacients parkinsonians van revelar un augment dels nivells de citocines, com la interleucina-1 (IL{-1) i la interleucina{-6 (IL{{{4}). }), que suggereix l'activació de la resposta aproinflamatòria [38, 39]. En el present estudi, els resultats van mostrar que l'exposició a 100 Mof6-l'alliberament de IL{-1 i IL-6 Mof6-OHDA a les cèl·lules PC12. No obstant això, el tractament amb equinacòsid podria inhibir en funció de la dosi l'alliberament d'IL-1 i IL-6 induït per 6-OHDA. Els resultats suggereixen que la reducció de les respostes inflamatòries també està implicada en els mecanismes de l'echinacòsid contra la neurotoxicitat induïda per 6-OHDA.

En conclusió, els resultats d'aquesta investigació van demostrar que l'echinacòsid va ser capaç de bloquejar la neurotoxicitat induïda per 6-OHDA a les cèl·lules PC12 i els mecanismes poden estar relacionats amb la protecció mitocondrial i la antiinflamació mitjançant la reducció de la producció de ROS. La informació proporcionada per aquest treball serà útil per dilucidar el mecanisme de l'echinacòsid per a l'anti-PD. Es conclou que l'echinacòsid pot ser una opció terapèutica prometedora per a la prevenció i el tractament de la MP.

Conflicte d'interessos

Els autors no han declarat cap conflicte d'interessos

Agraïments

Aquest treball va comptar amb el suport de subvencions de la National Natural Science Foundation de la Xina (81473383) i el National Science and Technology Major Project (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; i 2013ZX09102106).