L'extracte d'Herba Cistanche millora la generació d'ATP mitocondrial en cors de rates i cèl·lules H9c2

Contacte: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Hoi Yan Leung i Kam Ming Ko

Per citar aquest article: Hoi Yan Leung i Kam Ming Ko (2008) Herba Cistanche Extract Enhances Mitochondrial ATP Generation in Rat Hearts and H9c2 Cells, Pharmaceutical Biology, 46:6, 418-424, DOI: 10.1080/13880200880355

Resum

Per investigar la base farmacològica de l'acció "Yang-dinamitzadora" de Herbal Cistanche [la planta sencera seca de Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae)], en la medicina xinesa, es van analitzar els efectes de l'extracte de metanol d'Herba Cistanche sobre la capacitat de generació d'ATP mitocondrial. examinat mitjançant un model de cor de rata ex vivo i un assaig de cèl·lules H9c2 in situ. El tractament amb extracte d'Herba Cistanche va augmentar la capacitat de generació d'ATP mitocondrial del miocardi de manera dependent de la dosi en rates, tal com es va avaluar mitjançant mesura in vitro. L'estimulació de la capacitat de generació d'ATP es va associar amb una millora paral·lela del transport d'electrons mitocondrials suportat pel piruvat però no pel succinat. El tractament amb Herba Cistanche també va augmentar les activitats del complex mitocondrial miocardial I i del complex III, sent més gran l'extensió d'estimulació de l'activitat del complex I. El tractament amb Herba Cistanche va produir un augment depenent de la dosi i del temps de la capacitat de generació d'ATP mitocondrial a les cèl·lules H9c2. Els resultats indiquen que el tractament amb Herba Cistanche pot augmentar la generació d'ATP mitocondrial en cors de rates ex vivo i cèl·lules H9c2 in situ, possiblement mitjançant la millora de la fosforilació oxidativa.

Paraules clau:ATP, Cistanche deserticola, cèl·lules H9c2, cor, mitocondris.

Cistanche deserticola YC Ma

Introducció

"La dinamització del yang", que encarna la millora generalitzada de la funció corporal a la medicina xinesa, implica l'ús d'energia per impulsar diversos processos bioquímics. En aquest sentit, l'ATP, que és la moneda universal de l'energia per alimentar la funció cel·lular, es genera principalment mitjançant la fosforilació oxidativa als mitocondris. Hem postulat que les herbes "vigoritzants de Yang" tenen la capacitat d'augmentar la capacitat de generació d'ATP mitocondrial (Ko et al., 2004). Això està recolzat per la nostra recent descoberta que les herbes tonificants xineses "vigoritzants de Yang", però no "nutrients de Yin" podrien millorar la capacitat de generació d'ATP del miocardi als cors de ratolí ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, la planta parasitària seca sencera (excloent la flor) de Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), està classificada com una herba tonificant "vigoritzant del Yang" a la medicina tradicional xinesa (Chen, 1998) i apareix com la més popular. ingredient en diverses formulacions de patents xineses utilitzades per a la dinamització del Yang". A la Xina i el Japó, Herba Cistanche s'utilitza àmpliament per al tractament d'una sèrie de símptomes de deficiència de Yang. Els estudis farmacològics van indicar que Herba Cistanche podria eliminar els radicals lliures (Xiong et al., 1996), produir efectes sedants (Lu, 1998), antienvelliment (Lee et al., 1990), antinociceptius i antiinflamatoris (Lin et al., 2002). ), i millora la funció immune (Wu et al., 2005). El principal ingredient actiu d'Herba Cistanche són els glucòsids feniletanoides (Ouyang et al., 2003), que s'ha trobat que tenen propietats antibacterianes, antiestrès i antioxidants (Xiong et al., 1998), així com efectes antiapoptòtics en cultius. neurones (Tian i Pu, 2005). En l'estudi actual, per investigar les bases farmacològiques de l'acció estimulant del Yang d'Herba Cistanche, es van examinar els efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre la capacitat de generació d'ATP en mitocondris aïllats de cors de rata ex vivo i cardiomiòcits H9c2 cultivats in situ. Per explorar el mecanisme bioquímic subjacent a l'acció de millora de la generació d'ATP, també es van examinar els efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre el transport d'electrons mitocondrials i les activitats complexes I-IV en cors de rates.

Extracte de Cistanche deserticola

Materials i mètodes

Productes químics, cultius cel·lulars i materials vegetals ATP, ADP i bromur de 3-[4,5-dimetiltiozol-2-il]{-2,5-difeniltetrazoli ( MTT) es van comprar a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). La solució de luciferasa (ATPlite) es va obtenir de PerkinElmer (Boston, MA, EUA). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) i el sèrum boví fetal (FBS) es van comprar a GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). La línia cel·lular H9c2 es va comprar a ATTC (Rockville, MD, EUA). Herba Cistanche va ser subministrada per un distribuïdor d'herbes local (Lee Hoong Kee). L'herba va ser autenticada pel proveïdor i es va dipositar un exemplar de val (HKUSTY00301) al Departament de Bioquímica de la Universitat de Ciència i Tecnologia de Hong Kong (HKUST).

Extracció d'herbes

Herba Cistanche (100 g) es va tallar en trossos petits i després es va extreure escalfant a reflux en 300 ml de metanol

a 65◦C durant 2 h. El procediment es va repetir dues vegades. L'extracte combinat es va assecar evaporant el dissolvent a pressió reduïda i l'extracte de metanol d'Herba Cistanche es va obtenir amb un rendiment del 39 per cent (p/p). L'anàlisi química va indicar que l'extracte de metanol d'Herba Cistanche contenia saponines totals, flavonoides totals, lignans totals i polisacàrids a concentracions de l'1,62 per cent (p/p), 0.08 per cent, 0,15 per cent i 75,6 per cent, respectivament.

Cura dels animals

Les rates Sprague-Dawley mascles adults (8-10 setmanes; 250-300 g) es van mantenir sota un cicle fosc/llum de 12-h en una habitació controlada per aire/humitat a uns 22◦C i es van permetre menjar i aigua ad libitum a les instal·lacions de cura d'animals

a HKUST. Els protocols experimentals van ser aprovats pel Comitè de pràctiques de recerca de HKUST.

Tractament farmacològic

Els animals es van dividir aleatòriament en grups, amb de cinc a sis animals cadascun. Als grups de tractament, les rates es van administrar per via intragàstrica amb l'extracte de metanol d'Herba Cistanche (dissolt/suspès en aigua) a dosis diàries creixents ({{0}},031-0,5 g/kg) durant 3 dies. Els animals de control només rebien aigua. Vint-i-quatre hores després de l'última dosificació, el cor es va obtenir d'animals anestesiats amb fenobarbital i es va sotmetre a anàlisi bioquímica.

Preparació de fraccions mitocondrials i mesura de la capacitat de generació d'ATP (ATP-GC) ex vivo

Es van extirpar mostres de teixit ventricular esquerre del cor i es van esbandir amb tampó isotònic fred amb gel (0, 32 M sacarosa, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7, 4). Les fraccions mitocondrials cardíaques es van preparar mitjançant centrifugació diferencial en tampó isotònic a 4 ◦ C. Es va preparar un homogeneïtat cardíac del 10 per cent (p/v) homogeneïtzant el teixit ventricular picat amb un homogeneïtzador de vidre de tefló a 4000 rpm durant 20-30 cops complets. L'homogeneïtat es va centrifugar a 600 g durant 10 min per eliminar els nuclis i les restes cel·lulars. El sobrenedant es va centrifugar a 8000 g durant 30 min per sedimentar els mitocondris (Evan, 1992). Els pellets es van tornar a suspendre en 1 ml de tampó isotònic i es van reconstituir les fraccions mitocondrials. L'ATP-GC mitocondrial dels animals no tractats es va mesurar pel mètode de Leung et al. (2005).

Mesura del transport d'electrons mitocondrials

La mesura del transport d'electrons en mitocondris aïllats, que es basa en la reducció de MTT, es va realitzar tal com descriu Cohen et al. (1997). Els mitocondris es van preparar a una concentració de proteïnes d'1 mg/mL amb un tampó d'incubació (sacarosa 250 mM, HEPES 50 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4) . Es va barrejar una alíquota (40 µL) dels mitocondris amb 100 µL cadascun de 15 mM de piruvat o 0,5 mM de succinat i 0,42 mg/mL de MTT. La mescla de reacció es va incubar a 37 ◦ C durant 10 min amb agitació suau. Després de la incubació, la barreja de reacció es va acabar amb l'addició de 100 µL de tampó de lisi (10 per cent, p/v, dodecil sulfat de sodi i 45 per cent de dimetilformamida, ajustat a pH 4,7 amb àcid acètic glacial). Després de reposar durant 5 min, es van prendre lectures d'absorbància de la barreja de reacció amb un lector de plaques de microtitulació (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) i es van informar com la diferència entre 570 nm i 630 nm. Les dades es van expressar com a percentatge del valor mitjà del grup control (és a dir, Herba Cistanche sense tractar).

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules H9c2, una línia cel·lular permanent derivada de mioblasts cardíacs (Hescheler et al., 1991), es van cultivar com a monocapes en DMEM complementat amb un 10 per cent (v/v) de FBS. El medi contenia glucosa (4,5 g/L) i glutamina (4,5 mM), complementades amb NaHCO3 (17 mM), penicil·lina (100 UI/mL) i estreptomicina (100 µg/mL). Totes les cèl·lules es van cultivar sota una atmosfera de 5% (v/v) de CO2 a l'aire a 37 ◦ C. El medi es va substituir per mitjà fresc cada 2 o 3 dies. Es va cultivar un estoc de cèl·lules en un matràs de cultiu de 75 cm2 i es va dividir abans de la confluència amb una proporció de subcultiu d'1:10. Per a l'assaig ATP-GC, les cèl·lules H9c2 es van sembrar a una densitat de 2,5 104 cèl·lules/pou en una placa 24-pou. Després de la fixació cel·lular, es va aplicar extracte d'Herba Cistanche (dissolt en solució salina tamponada amb fosfat; PBS) al medi i les cèl·lules es van incubar durant períodes creixents (2-16 h) de temps. Les cèl·lules de control (no tractades) només van rebre el PBS.

Mesurament d'ATP-GC in situ

Després dels períodes d'incubació indicats amb extracte d'Herba Cistanche a concentracions creixents (5{{10}}–300 µg/mL), es va realitzar l'assaig ATP-GC. El medi es va aspirar i les cèl·lules es van tractar amb digitonina (50 µg/mL) en un tampó d'incubació (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 per cent de BSA, pH 7,4) per a 7,4. min a 37◦C. Després d'aspirar la digitonina, es van afegir glutamat (5 mM), malat (5 mM) i ADP (60 µM) a les cèl·lules per a la generació d'ATP mitocondrial, que es va controlar a intervals de temps creixents que van de 0 a 15 min. La reacció es va acabar amb l'addició de 60 µL d'àcid perclòric (30 per cent, p/v) i les mescles de reacció es van centrifugar a 600 g durant 10 min a 4 ◦ C. Es va barrejar una alíquota (120 µL) del sobrenedant amb 90 µL de KHCO3 1,4 M per a la neutralització. Les mescles es van centrifugar de nou a 600 g a 4 ◦ C i es va mesurar el contingut d'ATP dels sobrenedants tal com es va descriure anteriorment. L'ATP-GC de les cèl·lules no tractades es va estimar calculant l'àrea sota la corba del gràfic (AUC1) traçant ATP generat (nmol/mg de proteïna) en funció del temps (0-15 min) i expressat en unitats arbitràries. Per a les cèl·lules tractades amb Herba Cistanche, els valors AUC1 dels temps d'incubació creixents (3, 5, 7, 10 i 15 min) es van normalitzar a un valor de control mitjà respectiu de les mostres no tractades i es van expressar com a percentatge de control. A continuació, es va calcular l'àrea sota la corba (AUC2) del gràfic que representava els valors de control percentuals en funció del temps d'incubació (3-15 min) i es va expressar en unitats arbitràries. Les dades dels grups tractats amb Herba Cistanche es van expressar com a percentatge del control de l'equació:

[AUC2(tractat amb HerbaCistanche −)/AUC2(sense tractar)]×100 per cent .

Mesures de les activitats del complex I–IV i de la citrat sintasa

Les activitats del complex I-III de la cadena de transport d'electrons mitocondrials (ETC) es van mesurar mitjançant mètodes espectrofotomètrics utilitzant substrats específics del complex (NADH per al complex I, succinat per al complex II i decilubiquinol per al complex III) tal com es descriu (Grad i Lemire, 2004; Hsu et al. al., 2005; Mark et al., 2001). L'activitat del complex IV es va mesurar mitjançant un kit d'assaig de citocrom c oxidasa de Sigma. L'activitat de la citrat sintasa mitocondrial es va mesurar pel mètode de Srere (1969).

Assaig de proteïnes

Les concentracions de proteïnes de les fraccions mitocondrials i els lisats cel·lulars es van determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BioRad utilitzant albúmina sèrica bovina com a estàndard ({{0}},038–0,600 mg/mL).

Anàlisi estadística

Totes les dades es van expressar com a error estàndard mitjà de la mitjana (SEM). Es van analitzar mitjançant anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). Es van fer múltiples comparacions post hoc amb LSD. Valors P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Resultats

Efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre l'ATP-GC mitocondrial del miocardi en rates

Com es mostra a la figura 1, el tractament amb extracte d'Herba Cistanche a dosis de fins a 0,5 g/kg va augmentar l'ATP-GC mitocondrial del miocardi de manera dependent de la dosi en rates, amb un grau d'estimulació del 89 per cent. a una dosi de 0,5 g/kg.

Efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre el transport d'electrons mitocondrials en cors de rates

L'extensió del transport d'electrons en mitocondris aïllats es va mesurar mitjançant el seguiment de la reducció de MTT. El substrat utilitzat per a l'assaig va ser piruvat o succinat. Com es mostra a la figura 2a, el tractament amb Herba Cistanche va augmentar depenent de la dosi l'extensió del transport d'electrons mitocondrials suportat pel piruvat als cors de rates, amb l'estimulació òptima observable a dosis de 0, 5 g/kg. No obstant això, no es van detectar canvis significatius en l'extensió del transport d'electrons mitocondrials suportat pel succinat en cors de rates tractats amb Herba Cistanche (Fig. 2b).

Efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre les activitats del complex respiratori mitocondrial en cors de rates

Com es mostra a la figura 3, el tractament amb Herba Cistanche a la dosi òptima de 0,5 g/kg va augmentar significativament les activitats del complex I (34 per cent) i del complex III (22 per cent) en cors de rates. L'activitat de la citrat sintasa, un enzim clau per al cicle de l'àcid tricarboxílic, no es va veure afectada pel tractament amb Herba Cistanche (Fig. 3). L'anàlisi de Western blot va indicar que els nivells de proteïnes del complex I i III no es van veure afectats pel tractament amb Herba Cistanche (dades no mostrades).

Curs temporal dels canvis induïts per Herba Cistanche en l'ATP-GC mitocondrial a les cèl·lules H9c2

Els canvis en l'ATP-GC es van examinar en cèl·lules tractades amb Herba Cistanche (50 i 150 µg/mL) després de 2 a 16 h d'incubació. Com es mostra a la figura 4, el tractament amb Herba Cistanche va augmentar l'ATP-GC de manera bifàsica i dependent del temps a les cèl·lules H9c2, amb l'estimulació màxima (44 per cent i 89 per cent, respectivament) observable després de 8 h d'incubació per a ambdues concentracions de fàrmacs. L'ATP-GC va tornar als valors de control no tractats quan el temps d'incubació es va ampliar a 16 h. L'inici de l'estimulació es va produir quan les cèl·lules es van tractar amb una concentració més alta (150 µg/mL) d'extracte d'Herba Cistanche.

Concentració-dependència d'Herba

Augment de l'ATP-GC induït per Cistanche a les cèl·lules H9c2

Les cèl·lules H9c2 es van tractar amb concentracions creixents (50-300 µg/mL) d'extracte d'Herba Cistanche durant 4 h. La figura 5 mostra que el tractament amb Herba Cistanche va augmentar l'ATP-GC de manera dependent de la concentració, amb l'estimulació màxima (82 per cent) observable a la concentració de 300 µg/mL.

Augment de l'extracte de Cistanche en la producció d'ATP

Discussió

La regulació a l'alça de les activitats cel·lulars per millorar la funció corporal, com ara la contracció muscular i les respostes immunitàries mitjançant la dinamització del Yang, requereix l'augment del consum d'ATP, que al seu torn és recolzat per la fosforilació oxidativa mitocondrial. En l'estudi actual, es va trobar que el tractament amb Herba Cistanche augmenta de manera dependent de la dosi la capacitat de generació d'ATP mitocondrial ex vivo en cors de rates. Aquesta observació és coherent amb la nostra troballa anterior que, entre les herbes tonificants xineses estimulants del Yang, el tractament amb Herba Cistanche va produir un grau d'estimulació relativament més gran de la generació d'ATP mitocondrial als cors del ratolí (Ko et al., 2006). La millora de la generació d'ATP mitocondrial va ser paral·lela a l'augment del transport d'electrons mitocondrials impulsat pel piruvat però no pel succinat, tal com es va avaluar per la reducció de MTT. Els resultats obtinguts de la mesura cinètica del complex mitocondrial I-IV van indicar que les activitats dels dos complexos I i III es van incrementar als cors tractats amb Herba Cistanche, amb l'extensió d'estimulació de l'activitat del complex I més gran que la del complex III. Com que l'activitat de la citrat sintasa, un enzim clau del cicle de l'àcid tricarboxílic, no es va veure afectada, la millora de la capacitat de generació d'ATP mitocondrial mitjançant el tractament amb Herba Cistanche es pot atribuir principalment a l'estimulació de les activitats del complex I i/o III. La majoria dels requisits d'ATP del cor són satisfets pels mitocondris, que depenen gairebé completament de l'oxidació lligada al complex I (NADH) d'àcids grassos i glucosa (Stanley et al., 1997; Taegtmeyer, 1998). El complex I, que presenta una activitat menor que altres complexos respiratoris, es considera un factor important en la regulació de la fosforilació oxidativa. Així, l'estimulació o inhibició de l'activitat del complex I pot tenir un gran impacte en l'energia cardíaca. Tot i que l'anàlisi de Western blot no va revelar cap canvi en el nivell de proteïnes d'aquests dos complexos (dades no mostrades), l'augment de l'activitat enzimàtica pot resultar dels canvis en l'estat de proteïnes tiol i/o en l'entorn lipídic (Davey et al., 1998; Paradies). et al., 2004).

Extracte d'herba Cistanchepodria produir l'efecte de millora de la generació d'ATP en cèl·lules H9c2 cultivades in situ. L'inici relativament primerenc de l'acció estimuladora produïda pel tractament amb Herba Cistanche, especialment a dosis altes, és coherent amb l'observació dels estudis ex vivo que indicaven que la síntesi de proteïnes complexes I i III no està implicada en la millora de la generació d'ATP. acció. La demostració de la millora induïda per Herba Cistanche en la generació d'ATP in situ dóna suport a la idea que l'augment de la capacitat de generació d'ATP mitocondrial, tal com s'avalua mitjançant la mesura ex vivo, només pot reflectir un efecte paral·lel produït pel tractament farmacològic in vivo. La mesura de la generació d'ATP en mitocondris aïllats i cèl·lules cultivades utilitzant malat i glutamat com a substrats és una mesura indirecta de la respiració mitocondrial de l'estat 3 (Chen et al., 2003). Utilitzant el mateix assaig d'ATP bioluminescent, la taxa de generació d'ATP mitocondrial en diversos teixits de rates no tractades, tal com es va informar anteriorment al nostre laboratori (Leung et al., 2005), estava d'acord amb les dades publicades recentment (Drew i Leeuwenburgh, 2003). ). La capacitat de generació d'ATP es va estimar mitjançant una integració en dos passos dels canvis que depenen del temps en el nivell d'ATP tant en assajos ex vivo com in situ. Per tant, l'efecte estimulador induït pel fàrmac observat es va augmentar per tal de comparar-lo. La millora de la capacitat de generació d'ATP mitjançant el tractament amb Herba Cistanche en mitocondris del cor de rata ex vivo es va paral·lelament a l'estimulació de la generació d'ATP a les cèl·lules H9c2 in situ. Tenint en compte la presència d'activitat que millora la generació d'ATP a les herbes tonificants xineses estimulants del Yang, inclosa Herba Cistanche, en cors de ratolí ex vivo (Ko et al., 2006), els resultats suggereixen que la mesura de la capacitat de generació d'ATP a les cèl·lules H9c2 en situ es pot utilitzar com a prova farmacològica per a les herbes tonificants xineses estimulants del Yang o la fórmula d'herbes.

En conclusió, el tractament amb extracte d'Herba Cistanche podria millorar la capacitat de generació d'ATP mitocondrial en cors de rates ex vivo i en cèl·lules H9c2 in situ. Les troballes donen suport a la nostra postulació que la base farmacològica de la dinamització Yang implica la millora de les funcions corporals mitjançant l'estimulació de la producció d'ATP mitocondrial.

L'extracte d'herba Cistanche millora la capacitat de generació d'ATP mitocondrial

Referències

Chen P (1998): Herbes tòniques. Sèrie TCM avançada. Beijing, Xina, Science Press, pàgs. 233–320.

Chen Q, Vazquez EJ, Moghaddas S, Hoppel CL, Lesnefsky EJ (2003): Producció d'espècies reactives d'oxigen per mitocondris: paper central del complex III. J Biol Chem 278: 36027– 36031.

Cohen G, Farooqui R, Kesler N (1997): Malaltia de Parkinson: un nou vincle entre la monoaminooxidasa i el flux d'electrons mitocondrials. Proc Natl Acad Sci USA 94: 4890–4894.

Davey GP, Peuchen S, Clark JB (1998): Llindars energètics en mitocondris cerebrals. Implicació potencial en la neurodegeneració. J Biol Chem 273: 12753–12757.

Drew B, Leeuwenburgh C (2003): Mètode per mesurar la producció d'ATP en mitocondris aïllats: producció d'ATP en mitocondris cerebrals i hepàtics de rates Fischer-344 amb restricció calòrica i d'edat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 285: R1259–R1267.

Evan WH (1992): Aïllament i caracterització de membranes i orgànuls cel·lulars. A: Rickwood D, ed. Centrifugació preparativa: un enfocament pràctic. Nova York, Oxford University Press, pàgs. 223–270.

Grad LI, Lemire BD (2004): Les mutacions del complex mitocondrial I en Caenorhabditis elegans produeixen deficiència de citocrom c oxidasa, estrès oxidatiu i acidosi làctica sensible a les vitamines. Human Mol Genetics 13: 303–314.

Hescheler J, Meyer R, Plant S, Krautwurst D, Rosenthal W, Schultz G (1991): Caracterització morfològica, bioquímica i electrofisiològica d'una línia de cèl·lules clonals (H9c2) del cor de rata. Circ Res 69: 1476–1486.

Hsu M, Srinivas B, Kumar J, Subramanian R, Andersen J (2005): l'esgotament del glutatió que resulta en una inhibició selectiva del complex mitocondrial I a les cèl·lules dopaminèrgiques es fa per una via mediada per NO que no implica peroxinitrit: implicacions per a la malaltia de Parkinson. J Neurochem 92: 1091–1103.

Ko KM, Leon TYY, Mak DHF, Chiu PY, Du Y, Poon MKT (2006): una acció farmacològica característica de les herbes tonificants xineses "vigoritzants de Yang": millora de la capacitat de generació d'ATP del miocardi. Phytomedicine 13: 636–642.

Ko KM, Mak DH, Chiu PY, Poon MKT (2004): Bases farmacològiques de la "vigorització Yang" a la medicina xinesa. Trends Pharmacol Sci 25: 3–6.

Lee CJ, Chuan S, Lee SL (1990): Estudi sobre l'efecte anti-envelliment de Cistanche deserticola Ma. Shanghai J Trad Chin Med 11: 22–23.

Lei L, Song ZH, Tu PF, Li YZ, Wu LJ, Chen FK (2001): regulació metabòlica dels glucòsids feniletanoides a partir de cistanches d'herba al sistema gastrointestinal dels gossos. Yao Xue Xue Bao 36: 432–435

Leung HY, Chiu PY, Poon MKT, Ko KM (2005): una fórmula d'herbes xinesa estimulant Yang millora la capacitat funcional mitocondrial i la capacitat antioxidant en diversos teixits de rates mascles i femelles. Rejuven Res 8: 238–247.

Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR (2002): activitat antinociceptiva i antiinflamatòria causada per Cistanche deserticola en rosegadors. J Ethnopharmacol 83: 177– 182.

Lu MC (1998): Estudis sobre l'efecte sedant de Cistanche deserticola. J Ethnopharmacol 59: 161–165.

Mark A, Birch M, Douglass MT (2001): Assaig de l'activitat del complex respiratori mitocondrial en mitocondris aïllats de cèl·lules i teixits humans. Meth Cell Biol 65: 97–117.

Ouyang J, Wang X, Zhao B, Yuan X, Wang Y (2003): efectes dels elements de terres rares sobre el creixement de cèl·lules de Cistanche deserticola i la producció de glucòsids feniletanoides. J Biotech 102: 129–134.

Paradies G, Petrosillo G, Pistolese M, Di Venosa N, Federici A, Ruggiero FM (2004): Disminució de l'activitat del complex mitocondrial I al cor de rata isquèmic/reperfusat: implicació d'espècies reactives d'oxigen i cardiolipina. Circ Res 94: 53–59.

Srere PA (1969): Citrat sintasa. Cicle de l'àcid cítric. Met Enzimol 13: 3–11.

Stanley WC, Lopaschuk GD, Hall JL, McCormack JG (1997): Regulació del metabolisme dels carbohidrats del miocardi en condicions normals i isquèmiques. Potencial d'intervencions farmacològiques. Cardiovasc Res 33: 243–257.

Taegtmeyer H (1998): Metabolisme del substrat energètic com a objectiu per a la farmacoteràpia en el múscul cardíac isquèmic i reperfusat. Heart Metab 1: 5–9.

Tian XF, Pu XP (2005): els glucòsids feniletanoides de la salsa Cistanches inhibeixen l'apoptosi induïda per l'ió 1-metil-4- fenilpiridini a les neurones. J Ethnopharmacol 97: 59–63.

Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF (2005): un arabinogalactan aïllat de les tiges de Cistanche deserticola indueix la proliferació de limfòcits cultivats. Int J Biol Macromol 37: 278–282.

Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S (1998): activitat hepatoprotectora de feniletanoides de Cistanche deserticola. Planta Med 64: 120– 125.

Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T (1996): efectes antioxidants dels feniletanoides de Cistanche deserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.