L'equinacòsid retarda la senescència cel·lular de les cèl·lules fibroblàstiques humanes MRC-5
Mar 10, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
L'ingredient actiu de Cistanche: Com fa l'echinacòsid contra l'envelliment?
Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1
En aquest estudi, es van investigar els efectes de l'echinacòsid, un dels feniletanoides aïllats de les tiges de la salsa Cistanches, una medicina tradicional xinesa a base d'herbes, sobre les cèl·lules fibroblàstiques MRC-5 de pulmó d'embrions humans. L'activitat de la proliferació cel·lular es va avaluar amb Alamar Blue, demostrant que el tractament amb echinacòsid podria retardar la senescència. Els resultats de la citometria de flux mostren que l'echinacòsid podria provocar que les cèl·lules de la fase G1 entrin a la fase S i la fase G2 i podria millorar la degradació de ROS. Els resultats de l'assaig del cometa indiquen que l'echinacòsid podria protegir les cèl·lules del dany a l'ADN, dilucidant en part el mecanisme dels seus efectes. Tots els resultats anteriors suggereixen que l'echinacòsid té una activitat potencial antisenescència.
Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més
1. Introducció
Les cèl·lules normals cultivades in vitro proliferen durant un nombre limitat de duplicacions de població (el 'límit de Hayflflick') i entren en una etapa de senescència replicativa. Les cèl·lules senescents pateixen una aturada del creixement cel·lular en la fase G1 i un canvi en la morfologia i el metabolisme, inclòs l'ampliació cel·lular, l'augment de la biogènesi dels lisosomes i l'expressió d'una activitat més alta de la -galactosidasa a pH 6 (-galactosidasa associada a la senescència, SA- - -Gal). ) (Hayflflick i Moorhead 1961; Dimri 1995). L'acumulació de cèl·lules senescents pronostica la disminució relacionada amb l'edatteixit/òrganfuncions. Per accedir a la manera de retardar o revertir l'envelliment, els esforços per descobrir substàncies anti-envelliment actives no han cessat mai.Echinacòsidés un dels feniletanoides aïllats de les tiges deSalsa de cistanches, una herba medicinal tradicional xinesa, que té potencials activitats biològiques, tant com a antiserum comantifatigaagent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). També s'ha informat que es comporta in vitro com un potentlliureradicalcarronyaire(Facino et al. 1995) i exposicionsneuroprotectoractivitatsin vitro i in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). L'echinacòsid pot ser un candidat per a una substància anti-envelliment, i una activitat anti-envelliment podria ser una de les seves propietats biològiques. Així, vam tractar una línia cel·lular fibroblàstica de pulmó d'embrió humà senescent MRC-5 amb echinacòsid, esperant que pogués retardar o revertir la senescència.
2. Investigacions i resultats
En primer lloc, hem afegit echinacòsid al medi de cultiu per comprovar la seva influència en el creixement cel·lular i els cicles cel·lulars. Es va observar que la viabilitat de les cèl·lules amb 48 h d'exposició a l'echinacòsid augmentava evidentment en relació amb el control, a mesura que augmentava la concentració (Fig. 1A), cosa que indica que l'equinacòsid ajudava a proliferar cèl·lules senescents. El resultat de la tinció de SA-Gal va mostrar que el nivell de SA--Gal va disminuir òbviament després del tractament de l'echinacòsid (dades no mostrades), cosa que suggereix que una part de les cèl·lules senescents es va invertir de la senescència. Per confirmar si les cèl·lules senescents eren realment impulsades per proliferar per echinacòsid, es va introduir una citometria per comprovar l'alteració de la fase del cicle cel·lular de les cèl·lules senescents MRC-5 després del tractament amb equinacòsid. En el nostre estudi, vam observar que amb l'augment de la concentració d'echinacòsid, la proporció de cèl·lules en el període G1 es va reduir gradualment. Per contra, es van impulsar més cèl·lules per entrar a la fase S i la fase G2 (Fig. 1B). L'acumulació de focus d'heterocromatina associats a la senescència (SAHF) és un altre biomarcador específic de cèl·lules senescents (Shay i Wright 2001). Les cèl·lules senescents mostraven focus d'ADN puntuats que es van visualitzar per tinció de Hoechst (Fig. 1C). En canvi, les cèl·lules MRC-5 tractades amb equinacòsid semblaven tenir menys SAHF.
El nivell d'espècies reactives d'oxigen (ROS) augmenta a mesura que les cèl·lules s'acosten al límit de Hayflflick (Hutter et al. 2002). El tractament continu de cèl·lules amb nivells subletals de ROS no només augmenta el nivell de productes de dany oxidatiu com la lipofuscina (Sitte et al. 2001), sinó que també provoca una aturada permanent del creixement acompanyada de l'activació del p53-inhibidor del creixement. via (Toussaint et al. 2000). Per tant, a nivell cel·lular, les ROS tenen un paper clau en la inducció de la senescència. El colorant fluorescent FL DCFH-DA es va utilitzar per mesurar el contingut de ROS amb citometria companya. Es va demostrar que, en comparació amb el control, el contingut de ROS es va reduir evidentment a les cèl·lules incubades amb echinacòsid (Fig. 2A). Aquests resultats ho indiquenequinacòsidpodria actuar com a antioxidant, reduint la producció de ROS o accelerant l'eliminació de ROS.
Les espècies reactives d'oxigen (ROS) acumulades causen un deteriorament notable de les macromolècules a les cèl·lules, incloses les proteïnes, l'ADN i els telòmers (Kovtun et al. 2007). Els danys oxidatius de l'ADN desencadenen l'aturada del creixement G1 depenent de p53-, després de l'expressió de p21Waf-1/SDI{-1/Cip1 (Chen et al. 1998) i la senescència cel·lular en fibroblasts humans normals. Hem utilitzat un assaig de cometes per mesurar el dany de l'ADN i la seva reparació. La mida dels fragments d'ADN i el nombre de trencaments determinen la migració i el patró del cometa vist. El contingut d'ADN de la cua (producte de la longitud de la cua i el contingut d'ADN de la cua) augmenta amb el dany. Els nostres resultats mostren que el pretractament amb echinacòsid pot promoure en part la reparació del dany a l'ADN, almenys protegir les cèl·lules de les lesions d'ADN causades per H2O2 (Fig. 2B). A partir d'aquests fets, concloem que l'echinacòsid té activitat antisenescència almenys a les cèl·lules MRC-5. Els resultats del nostre estudi mostren que l'echinacòsid pot reduir l'acumulació de ROS, protegir les cèl·lules del dany a l'ADN, promoure les cèl·lules MRC-5 de la fase G1 a les fases S i G2 i millorar així la proliferació de les cèl·lules. En termes generals, els efectes de l'echinacòsid sobre les cèl·lules MRC-5 es podrien dividir en dos aspectes: promoure la proliferació cel·lular i reduir l'acumulació de ROS. Tot i que encara es desconeix el mecanisme precís de la senescència cel·lular i la xarxa de regulació del cicle cel·lular segueix sent controvertida, hem demostrat que l'echinacòsid pot protegir les cèl·lules del dany oxidatiu. Per tant, especulem amb aixòequinacòsidpodria ser un bon candidat per regular la senescència, tot i que el mecanisme subjacent precís segueix sent una qüestió oberta i hi ha més estudis en curs.
3. Experimental
3.1. Cultiu i tractament cel·lular
La línia cel·lular fibroblàstica de pulmó d'embrions humans MRC{{0}} (Institut de Bioquímica i Biologia Cel·lular, SIBS, CAS) es va mantenir en un medi essencial mínim modificat (Gibco/BRL) i es va complementar amb sèrum boví fetal al 10%. Les cèl·lules MRC-5 experimenten una senescència replicativa després de múltiples passos cel·lulars, avaluada per l'alentiment del metabolisme i el cessament de la divisió en 7 dies. Tots els cultius es van sembrar a una densitat cel·lular de 104/cm2 tret que s'indiqui el contrari i es van deixar proliferar, sense molèsties, durant 7 dies. Es van afegir diverses concentracions d'echinacòsid 48 h abans de l'examen amb dissolvent com a control tret que s'indiqui el contrari. La concentració de DMSO en cultius va ser inferior al 0,3 per cent (v/v). Per al tractament amb H2O2, les cèl·lules es van induir amb 250 M H2O2 durant 12 h.
3.2. Assaig de la taxa de supervivència
Les cèl·lules es van cultivar i es van tractar amb echinacòsid en plaques de 96 pous. Abans de la detecció, es va afegir un 10 per cent d'Alamar BlueTM al medi i es va incubar durant 4 h. Es va mesurar l'absorbància amb un espectrofotòmetre.
3.3. Anàlisi per citometria de flux
Es va introduir la citometria de flux per mesurar el contingut d'ADN i els nivells intracel·lulars de ROS mitjançant iodur de propidi i DCFH-DA respectivament. Les cèl·lules es van xapar a una densitat d'105 cèl·lules/10 ml de solució cel·lular en plats de 100 mm de diàmetre i es van complementar amb echinacòsid durant 48 h després de la sembra de cèl·lules. Després de 48 h de tractament, les cèl·lules es van collir i es van rentar en PBS després de la centrifugació, després es van tornar a suspendre en solució de PBS amb RNasa al 0, 1 per cent i iodur de propidi 50 g/ml o medi de cultiu que contenia 10 M DCFH-DA durant 30 min. A continuació, es va determinar el contingut d'ADN o ROS mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència FL en un sistema de citometria de flux Beckman Coulter. Les dades es van analitzar mitjançant el programari MultiCycle.
3.4. Tinció de Hoechst
Les cèl·lules es van cultivar i es van tractar amb echinacòsid durant 48 h en una placa de 96 pous. Es va eliminar el medi, es van rentar les cèl·lules amb PBS, després es van fixar amb un 4 per cent de formaldehid en PBS durant 20 min, seguides amb un rentat amb PBS una vegada i es van tenyir amb colorant Hoechst durant 10 min. Es van capturar imatges.
3.5. Electroforesi en gel unicel·lular (assaig de cometes)
L'assaig de cometes es va dur a terme tal com es va informar (Olive i Banath 2006). Les imatges de cometes individuals es van analitzar amb el programari CometScore. Agraïment: aquest treball va comptar amb el suport financer del Programa Nacional de Recerca Bàsica (Projecte 973) de la Xina (núm. 2007CB507406), la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (núm. 30572341) i el Fons de Ciències Mèdiques Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008). ).
