Cistanche: Echinacoside suprimeix el creixement cel·lular de l'adenocarcinoma pancreàtic induint l'apoptosi mitjançant la via de la proteïna quinasa activada per mitogen

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG i XINFENG LI

Resum.

L'aplicació clínica de productes naturals derivats de la medicina tradicional xinesa ha cridat l'atenció en la quimioteràpia contra el càncer.Echinacòsid(ECH), un dels feniletanoides, aïllat de les tiges deCistanche(una herba medicinal xinesa) té efectes protectors dels teixits i antiapoptòtics sobre el sistema nerviós central. No obstant això, continua essent molt difícil de saber si ECH posseeix una activitat supressora de tumors. En el present estudi, es va demostrar que l'ECH pot inhibir notablement la proliferació de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic induint la producció d'espècies reactives d'oxigen i la pertorbació del potencial de membrana mitocondrial i, per tant, desencadenant l'apoptosi. A més, es va dilucidar que ECH(Echinacòsid)reprimeix el creixement de cèl·lules tumorals mitjançant la modulació de l'activitat MAPK. En conclusió, aquest estudi revela una nova funció de l'ECH(Echinacòsid) per prevenir el desenvolupament del càncer, i implica que l'ús de l'ECH podria ser una estratègia quimioterapèutica potencial per al càncer.

Introducció

La via del supressor de tumors p53 mitjançant la inducció del supressor de tumors, ARF mitiga la degradació de p53 mediada per l'E3-lligasa de ratolí de doble minut (MDM)2- oncogènica (3). Aquest és un mecanisme autoregulat i autoprotector que impedeix que les cèl·lules es transformin malignes. En particular, p53 pot reprimir l'activitat de Myc activant transcripcionalment, per exemple, miR-145 que té com a objectiuMycARNm per al silenciament de la traducció (4, 5), formant així un bucle regulador de retroalimentació negativa.

L'estratègia més senzilla i eficaç per tractar el càncer és matar les cèl·lules canceroses. S'ha demostrat que els fàrmacs anticancerígens utilitzats habitualment, com el cisplatí (6), l'actinomicina D (7) i l'adriamicina (8), inhibeixen el creixement del tumor afavorint l'apoptosi. Recentment, l'evidència creixent ha demostrat que una sèrie de productes naturals i derivats de les plantes, especialment de les plantes medicinals utilitzades en la medicina tradicional xinesa (MTC), presenten una funció supressora de tumors en induir l'apoptosi de les cèl·lules cancerígenes i tenen el potencial d'aplicació clínica. en la teràpia del càncer (9). Per exemple, l'emodina antraquinona natural està aïllada de nombrosos tipus de cèl·lules canceroses (10,11). Camptothecin, derivat de l'"arbre feliç" xinès,Camptotheca acuminat, és un producte natural valuós que inhibeix la lligadura de l'ADN després de trencaments de cadena mediats pel topo I (12). En un altre estudi de cohort retrospectiu basat en la població d'un total de 729 pacients amb càncer de mama avançat, es va suggerir que la teràpia TCM pot contribuir al tractament del càncer. D'aquesta cohort, 115 pacients eren usuaris de TCM mentre que 614 pacients no van utilitzar TCM. L'anàlisi multivariant va demostrar que, en comparació amb els no usuaris, l'ús de TCM es va associar amb una disminució significativa del risc de mortalitat per totes les causes (13). Totes les troballes esmentades indicaven que la MTC és una medicina alternativa i complementària important que es pot utilitzar en el tractament del càncer.

ratolins amb lesió pulmonar aguda (16,17). També, ECH(Echinacòsid)s'ha demostrat que té efectes protectors sobre el teixit nerviós i millora els trastorns del comportament en models murins de la malaltia de Parkinson (18). En particular, s'ha trobat que ECH promou la proliferació cel·lular i inhibeix l'apoptosi a les cèl·lules epitelials intestinals MODE-K del ratolí (19). Fins ara, però, s'ha prestat menys atenció al paper potencial de l'ECH en la prevenció del càncer.

En aquest estudi, es va explorar si el tractament amb ECH afecta el creixement i la proliferació de cèl·lules tumorals i si ECH(Echinacòsid)indueix l'apoptosi, augmenta la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i redueix el potencial de membrana mitocondrial (MMP) i, en conseqüència, suprimeix el creixement de cèl·lules tumorals. A més, el present estudi pretenia identificar els mecanismes moleculars responsables de la inhibició del creixement cel·lular mediat per ECH.

Materials i mètodes

Cèl·lula línia, reactiu, i anticossos.Les cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic SW1990 (ATCC, Manassas, VA, EUA) es van cultivar en medi Eagle modificat de Dulbecco complementat amb sèrum boví fetal al 10%, penicil·lina 50 U/ml i estreptomicina 0,1 mg/ml a 37 °C en un Atmosfera humidificada amb un 5% de CO2. ECH(Echinacòsid)es va comprar a Jrdun Biotechnology Corp. (Xangai, Xina). Els anticossos contra AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 i GAPDH es van comprar a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA); anti-Bax i anti-Bcl-2 es van comprar a Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA); i l'anti-Caspase-3 es va comprar a Abcam (Xangai, Xina).

Cèl·lula viabilitatassaig. Per avaluar la taxa de creixement de les cèl·lules tumorals, es va utilitzar el kit de recompte de cèl·lules {{0}} (CCK{-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, EUA) segons les instruccions del fabricant. Les suspensions cel·lulars es van sembrar a 5,000 cèl·lules per pou amb tractament ECH durant 0, 12, 24, 48 o 72 h en plaques de cultiu de 96 -pous. La inhibició del creixement cel·lular es va determinar afegint el reactiu WST-8 del kit CCK-8 a una concentració final del 10% a cada pou, i l'absorbància de les mostres es va mesurar a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA).

Hoechst 33342 tinció.Les cèl·lules (60 per cent de confluència) es van tractar amb Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Xina) a una concentració final d'1µg/ml, incubat en una incubadora a 37 °C durant 15 min, rentat amb solució salina tamponada amb fosfat dues vegades, fixat en paraformaldehid al 4 per cent durant 30 min a temperatura ambient i muntat sobre portaobjectes. Els canvis morfològics dels nuclis cel·lulars es van observar amb un microscopi de fluorescència (Olympus BX51, Melville, NY, EUA). Els nuclis normals eren rodons i tenyits de blau clar, mentre que els nuclis apoptòtics estaven reduïts i tenyits de blau brillant.

Activat per fluorescència cel·la classificació (FACS) anàlisis.Per a l'avaluació de l'apoptosi, es va utilitzar el kit de detecció d'apoptosi d'isotiocianat de fluoresceïna (FITC)-Annexin V (BD Biosciences, Xangai, Xina) segons les instruccions del fabricant. Breument, es van rentar 5x104 cèl·lules amb PBS gelat, es van tornar a suspendre en tampó d'unió de 0, 1 ml (Beyotime Institute of Biotechnology) i es van tacar amb 10 ml d'Annexina V conjugada amb FITC (10 mg/ml) i 10 ml de iodur de propidi (PI) (50 mg/ml). Després de la incubació durant 15 min a temperatura ambient a la foscor i l'addició de 400 ml de tampó d'unió, les cèl·lules es van analitzar mitjançant un citòmetre de flux (C6; BD Biosciences, Xangai, Xina).

Mesurament de reactiu oxigen espècies (ROS).Per avaluar la producció de ROS, es va utilitzar el kit d'assaig d'espècies d'oxigen reactiu (Vigorous Biotechnology, Beijing, Xina) segons les instruccions del fabricant. Breument, les cèl·lules (80 per cent de confluència) es van collir i es van rentar amb PBS abans de la tinció amb la solució de dihidroetidi (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). A continuació, es van analitzar les cèl·lules mitjançant anàlisis citomètriques de flux.

Mesurament de mitocondrial membrana potencial (MMP).

Es va utilitzar un kit d'assaig d'èster metílic de tetrametilrodamina (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, EUA) per detectar els canvis en MMP. Breument, es van recollir cèl·lules (80 per cent de confluència), es van rentar amb PBS i es van tacar amb TMRM durant 15-20 min en una incubadora a 37 °C. Les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS i es van sotmetre a anàlisis citomètriques de flux.

Immunoblottinganàlisis. Les cèl·lules (80 per cent de confluència) es van recollir i lisar en tampó RIPA (Jrdun Biotechnology) que constava de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 1 per cent de NP-40, 1 per cent d'àcid desoxicòlic sòdic i 0,1 per cent de SDS i inhibidors del proteasoma recentment afegits. Es van utilitzar quantitats iguals de lisat de cèl·lules clares per a l'anàlisi d'immunoblot tal com es va descriure anteriorment (20).

Estadístic anàlisi.Les dades quantitatives s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard. Les diferències estadístiques es van avaluar mitjançant la prova t de Student sense aparellament mitjançant el programari estadístic SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultats

ECH (Echinacòsid)suprimeix tumor cel·lacreixement. Encara que s'ha informat que ECH(Echinacòsid)presenta un paper protector mitjançant la inhibició de l'apoptosi i els senyals inflamatoris a les cèl·lules somàtiques, com les cèl·lules epitelials neuronals i intestinals (16-19), segueix sent difícil de veure si l'ECH controla el creixement i la proliferació de cèl·lules canceroses. Per provar-ho, es va realitzar un assaig de supervivència cel·lular tractant cèl·lules SW1990, derivades d'un adenocarcinoma pancreàtic de grau II, amb dosis titulades d'ECH com es mostra a la figura 1. En particular, es va demostrar que l'ECH retarda significativament la proliferació de cèl·lules tumorals en una dosi. de manera dependent durant un període de cultiu 5-dia (Fig. 1).ECH desencadenantsapoptosi. Com que la pèrdua d'apoptosi és un dels principals mecanismes causants subjacents a la proliferació incontrolada de cèl·lules canceroses de pàncrees (21), el present estudi va realitzar un conjunt d'experiments per determinar si l'ECH desencadena l'apoptosi. En primer lloc, tenyint els nuclis de les cèl·lules tumorals amb Hoechst 33342, es va demostrar que l'ECH dóna lloc a l'apoptosi d'una manera dependent de la dosi (Fig. 2A). A més, es van realitzar anàlisis FACS mitjançant la tinció d'Annexina V/PI per confirmar encara més l'efecte apoptòtic de ty ECH (Fig. 2B). El percentatge mitjà de cèl·lules apoptòtiques va ser de l'1,1 per cent en condicions de cultiu normals, mentre que aquest percentatge va augmentar significativament fins al 10,6, 21,4 i 51,3 per cent en resposta al tractament amb ECH de manera dependent de la dosi (Fig. 2C). Aquests resultats, juntament amb l'assaig de viabilitat cel·lular que es mostra a la figura 1, demostren que el tractament amb ECH suprimeix la proliferació de cèl·lules tumorals provocant l'apoptosi.

generar etidio que s'intercala amb l'ADN, es va utilitzar en aquest estudi per avaluar la producció de ROS. Es va trobar que, com altres fàrmacs anticancerígens, l'ECH també estimula la producció de ROS de manera dependent de la dosi, tal com mostra l'elevada intensitat de fluorescència després del tractament amb ECH (Fig. 3).

ECH (Echinacòsid)redueix MMP.S'ha demostrat que la disfunció mitocondrial està implicada en la inducció de l'apoptosi. S'ha demostrat que l'obertura del porus de transició de la permeabilitat mitocondrial indueix la despolarització del potencial transmembrana i l'alliberament de factors pro-apoptòtics (23). Per tant, es va provar si ECH podria induir la pèrdua de MMP a les cèl·lules tumorals mitjançant un assaig TMRM, que és un enfocament ben establert, ja que la intensitat de la fluorescència TMRM és proporcional al potencial de membrana. Es va demostrar que el tractament amb ECH redueix significativament la MMP d'una manera dependent de la dosi (Fig. 4).ECH controls tumor cel·la creixement via proteïna activada per mitògenses va examinar la base molecular de la mort de cèl·lules tumorals mediada per ECH, l'activitat de diverses vies de senyalització vitals, com ara MAPK i AKT (24, 25), que controlen la supervivència i la mort cel·lulars. Els MAPK són proteïnes cinases Ser/Thr dirigides per prolina conservades evolutivament, incloses les cinases regulades per senyal extracel·lular (ERK), la quinasa terminal c-Jun NH2-terminal (JNKs) i els membres de la família p38 que s'activen mitjançant tres cascades de senyalització de quinasa de nivell (26, 27). En aquest estudi, es va avaluar l'expressió de MAPK i AKT, així com les seves formes fosforilades activades, i es va revelar que ECH suprimeix notablement l'activitat de JNK i ERK1/2, però millora l'activitat de p38 (Fig. 5). En particular, es va demostrar que l'activitat de l'AKT, que també és fonamental per a la proliferació cel·lular, no es veu afectada pel tractament amb ECH (Fig. 5). A més, es va demostrar que el tractament amb ECH augmenta l'expressió de Bax i Caspasa-3 alhora que redueix l'expressió de Bcl-2 (figura 5), ​​que és coherent amb la figura 2. Així, els resultats indiquen que L'ECH desencadena l'apoptosi de les cèl·lules tumorals mitjançant la via MAPK.

Discussió

Segons el que sabem, aquest és el primer estudi que demostra que l'ECH té una funció supressora de tumors provocant l'apoptosi (Fig. 2), promovent la producció de ROS (Fig. 3) i induint la despolarització del potencial de la membrana mitocondrial (Fig. 4). , la qual cosa condueix a la inhibició del creixement de cèl·lules tumorals (Fig. 1). A més, es va demostrar que la base molecular de la mort de cèl·lules tumorals mediada per ECH es produeix mitjançant la regulació de les vies de senyalització MAPK (Fig. 5). Aquestes troballes demostren una nova funció de l'ECH en la prevenció de la tumorigènesi i, per tant, suggereixen que pot ser un agent candidat per a la teràpia contra el càncer.

La majoria dels fàrmacs anticancerígens poden induir l'apoptosi de les cèl·lules tumorals, la senescència i/o l'aturada del cicle cel·lular, la qual cosa condueix a la inhibició del creixement i la proliferació de cèl·lules tumorals. L'aturada del cicle cel·lular és una resposta cel·lular a senyals d'estrès lleus que permeten a les cèl·lules reparar l'ADN danyat abans d'iniciar la síntesi replicativa d'ADN o la mitosi, mentre que l'apoptosi i la senescència (aturada permanent del cicle cel·lular) es produeixen en resposta a senyals d'estrès que eliminen cèl·lules irreparables o malignes. 28,29). Per tant, en aquest estudi només es va avaluar l'efecte apoptòtic de l'ECH sobre les cèl·lules tumorals, ja que matar cèl·lules canceroses és un criteri important per avaluar la potència d'un agent anticancerígen. En particular, es va demostrar que ECH indueix l'expressió deBax(Fig. 5), un gen pro-apoptòtic, activat transcripcionalment pel supressor de tumors p53 (30). Per tant, val la pena provar si ECH pot activar la via de senyalització p53. Si és així, l'ECH també pot provocar l'aturada del cicle cel·lular, la senescència, l'apoptosi o l'autofàgia depenent de p53-. En aquest estudi, es va dilucidar la funció supressora del tumor de l'ECH a la línia cel·lular d'adenocarcinoma pancreàtic SW1990. Tanmateix, es requereixen estudis addicionals que observen més línies cel·lulars de càncer de pàncrees. S'ha demostrat que les mutacions de la proteïna oncogènica RAS i del supressor de tumors p53 s'associen amb el desenvolupament de càncer de pàncrees (31); tanmateix, la línia cel·lular SW1990 no alberga cap mutació p53, segons la base de dades p53 de l'IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Per tant, és important investigar si l'ECH pot afectar el creixement i la proliferació d'altres línies cel·lulars de càncer de pàncrees amb diferents mutacions de p53. A més, seria interessant determinar si l'ECH és capaç de promoure l'apoptosi i inhibir el creixement d'altres tipus de tumors.

L'elevació de ROS i la reducció de MMP, que van ser causades pel tractament amb ECH, s'ha demostrat que són essencials en la inducció de l'apoptosi (22). A més, s'ha trobat que les ROS poden induir l'oxidació dels porus mitocondrials contribuint a l'alliberament de citocrom.c, un intermedi en l'apoptosi, a causa de la interrupció de la MMP (22). Per tant, queda per determinar si l'ECH altera la MMP indirectament mitjançant la inducció de ROS. A més, també s'ha demostrat que l'estrès oxidatiu provocat per ROS està implicat en la modulació d'una infinitat de senyals de control del creixement cel·lular, inclosos p53, NF-κB, HIF i PI3K (32). Queda per determinar si i, si és així, com ECH regula aquestes vies de senyalització importants. En particular, l'estrès oxidatiu causa diverses malalties neurodegeneratives a causa de l'elevat consum d'oxigen, sistemes antioxidants febles i característiques de diferenciació terminal del sistema nerviós central (33). No obstant això, diversos estudis han demostrat que l'ECH té efectes protectors i antiapoptòtics sobre el teixit nerviós. En aquest sentit, és raonable plantejar la hipòtesi que l'ECH pot reduir la producció de ROS a les cèl·lules neuronals diferenciades terminals. Per tant, també queda per determinar si la regulació de la producció de ROS per ECH depèn de l'estat de diferenciació cel·lular. Per tant, els resultats actuals juntament amb altres estudis revelen que l'ECH, el TCM àmpliament utilitzat, pot ser una estratègia quimioterapèutica important no només per al tractament de malalties neurodegeneratives sinó també per als carcinomes malignes.

Recentment, l'ús de la MTC en la teràpia del càncer ha guanyat cada cop més atenció. El potencial dels productes naturals a partir de plantes medicinals utilitzats en la MTC ha estat reconegut per la comunitat científica fins i tot al món occidental (9). Es requereixen esforços per dilucidar els mecanismes d'acció subjacents d'aquests productes naturals, que eventualment poden conduir al desenvolupament de medicaments eficients i segurs per a la teràpia del càncer.

En conclusió, el present estudi va demostrar la funció inhibidora del tumor de l'ECH i també elabora la base molecular de la supressió del tumor mediada per ECH, suggerint així la possible aplicació clínica de l'ECH en la teràpia del càncer.

Agraïments

Aquest estudi va ser finançat i recolzat pel Programa Clau d'Investigació Científica de la FMU (subvenció núm. 09ZD014). Els autors volen agrair a Biomedworld (Xangai, Xina) l'ajuda per editar el manuscrit.

Referències

1. Hanahan D i Weinberg RA: Característiques del càncer: la propera generació. Cel·la 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transcripció: els efectes transcripcionals de MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ i Roussel MF: la senyalització de Myc mitjançant el supressor de tumors ARF regula l'apoptosi i la immortalització depenent de p53-. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K i Mo YY: p53 reprimeix c-Myc mitjançant la inducció del supressor de tumors miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X i Lu H: nous coneixements sobre les funcions de p53 a través dels seus microRNAs objectiu. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB i Lippard SJ: Cisplatina i reparació de l'ADN en quimioteràpia contra el càncer. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H i Korc M: L'actinomicina D indueix l'apoptosi i inhibeix el creixement de cèl·lules canceroses de pàncrees. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P i Dass CR: Doxorubicina: una actualització sobre l'acció molecular anticancerígena, la toxicitat i els nous sistemes de lliurament de fàrmacs. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS i Kaina B: de la medicina tradicional xinesa a la teràpia racional del càncer. Tendències Mol Med 13: 353-361, 2007.