Efecte dels extractes de Cistanche Tubulosa sobre la funció reproductiva masculina en rates diabètics induïdes per estreptozotocina-nicotinamida-Ⅰ

1. Introducció

La diabetis mellitus (DM) és una condició en la qual hi ha un augmentnivells de glucosaa la sang a causa de la ineficiència del pàncrees per produir prou insulina o la incapacitat del cos per utilitzar-la de manera eficaç. Segons l'OMS, el nombre de persones amb diabetis va passar de 108 milions el 1980 a 422 milions el 2014 [1]. Hi ha quatre categories principals: pre-diabetis (una etapa abans de la diabetis), tipus 1 (on el pàncrees no produeix insulina), tipus 2 (el cos no fa servir la insulina) i diabetis gestacional (que es produeix durant l'embaràs). L'estrès oxidatiu es produeix a causa del desequilibri entre la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i antioxidants [2] que finalment condueix a la condició diabètica. Les complicacions de la diabetis inclouen insuficiència renal, dany als nervis, ceguesa, ictus, atac de cor, mort fetal i infertilitat. [1]. Els estudis mostren que els nuclis d'esperma, l'àcid desoxiribonucleic (ADN) i els mitocondris es van danyar significativament en pacients diabètics masculins [3]. L'estrès oxidatiu durant el transport d'espermatozoides alterarà el procés del sistema reproductor masculí [4,5].

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

El procés d'espermatogènesi està controlat per l'eix hipotàlem-hipofisi-gonadal (HPG). L'hormona alliberadora de gonadotropina (GnRH) produïda per l'hipotàlem estimula la producció de l'hormona luteïnitzant (LH) i l'hormona fol·liculoestimulant (FSH). Les cèl·lules de Leydig es troben adjacents al túbul seminífer iproduir testosteronasota el control de LH. La FSH desencadena la producció de proteïnes d'unió a l'antigen (ABP) que ajuda a passar l'hormona masculina. Així, la infertilitat i altres problemes sorgeixen principalment a causa de les alteracions que es produeixen en l'eix HPG. L'administració de la combinació d'estreptozotocina-nicotinamida indueix diabetis en rates experimentals. L'estreptozotocina és un compost químic tòxic per a les cèl·lules productores d'insulina del pàncrees i la nicotinamida és una vitamina soluble en aigua que protegeix les cèl·lules del dany total [6].

Cistanche tubulosa és una espècie de planta del desert també coneguda com "Rou Cong-Rong" [7]. És una planta parasitària no clorofílica que creix principalment a l'arrel de l'arbre Calotropis procera i està àmpliament distribuïda a les terres àrides de Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongòlia, Iran i Índia. El nom comú de Cistanche tubulosa és "Jacint del desert". És àmpliament acceptat a la medicina tradicional xinesa i se li ha donat el nom de "Ginseng del desert". S'utilitza àmpliament en el camp medicinal per tractar la leucorrea mòrbida, la metrorràgia profusa, les malalties renals cròniques, el restrenyiment, la impotència i la infertilitat. Components químics deCistanche tubulosa consisteix en glucòsids feniletanoides no volàtils(PHG), iridoides, lignans, olis volàtils, alditols, oligosacàrids i polisacàrids [8]. Els estudis ho demostrenequinacòsidd'aquesta herba protegeix el fibroblast danyat regulant els nivells de ROS [9]. Aquest compost produeix activitats antioxidants, vasorelaxants i antiinflamatòries juntament amb neuroprotecció i prevenció de l'osteoporosi [10,11].

Aquest estudi pretenia investigar l'efecte deExtracte de Cistanche tubulosaque conté ECH sobre la disfunció reproductiva de la rata diabètica induïda per estreptozotocina-nicotinamida.

2. Materials i Mètodes

2.1. Materials

ECH i CTE es van comprar a Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Els productes finals de glicació avançada (AGE) es van comprar a Biovision (San Francisco, CA, EUA). Les línies cel·lulars LC-540 i TM3 es van comprar a l'Institut de Recerca i Desenvolupament de la Indústria Alimentària (Hsinchu, Taiwan). Es van comprar rates mascles Sprague-Dawley (SD) de cinc setmanes al National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® es va comprar a PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2, es va obtenir 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) de Sigma (St. Louis, MO, EUA). També es van comprar metanol i 4-(2-hidroxietil)-1-àcid piperazineetansulfònic (HEPES) a Sigma. El medi Eagle modificat de Dulbecco/F12 i la tripsina-EDTA es van obtenir de GIBCO (Nova York, NY, EUA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il){-2, 5-bromur de difeniltetrazoli (MTT), diacetat de dicloro-dihidro-fluoresceïna (DCFH-DA), El sulfòxid de dimetil (DMSO) i el tetrazoli nitroblau (NBT) es van comprar a Sigma. Els kits enzimàtics de glucosa es van obtenir de Kyokutoseiyaku, Tòquio, Japó. Els kits d'ELISA d'insulina es van comprar a Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suècia). El reactiu d'extracció de proteïnes de teixit T-PER es va adquirir a Thermo Scientific (Chicago, IL, EUA). Els anticossos policlonals anti-humà/ratolí/rata-kappa B NF-κB es van comprar a Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA. Receptor anti-ratolí/rata per a productes finals de glicació avançada (RAGE), anticossos policlonals anti-humà/ratolí/rata StAR i anticossos monoclonals anti-humà/ratolí/rato del citocrom P450 17A1 es van comprar a Gene Tex (Irvine, CA, EUA). Els anticossos policlonals anti-humà/ratolí/rata CYP11A1 es van obtenir de Cell Signaling Technology (Beverly, PA, EUA). El reactiu Easy-Blue es va comprar a Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, EUA). L'agarosa i el marcador d'ADN de 100 pb es van obtenir de Promega, Corporation (Madison, WI, EUA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit es va comprar a QIAGEN, Hilden, Alemanya.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Mètodes

2.2.1. Anàlisi in vitro

Cultiu cel·lular LC{{{0}} i TM3: les línies cel·lulars LC-540 es van cultivar a 37 ◦C en medi de solució salina equilibrada d'Earle (EBSS) complementat amb bicarbonat de sodi (1,5 g/L), L-glutamina (2 mM), aminoàcids no essencials (0,1 mM), piruvat de sodi (1,0 mM) i sèrum fetal boví (FBS) (10%) en un Incubadora de CO2 al 5% (incubadora de CO2, Napco 5410, Taiwan). La línia cel·lular TM3 es va cultivar en medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb glucosa (4,5 g/L), piruvat de sodi (0,5 mM), L-glutamina (2,5 mM), bicarbonat de sodi (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hidroxietil)-1-àcid piperazineetansulfònic (HEPES, 15 mM) i sèrum fetal de vedella (FCS, 10%) o sèrum de cavall (5%) a 37 ◦C en un 5% Incubadora de CO2.

Determinació de la viabilitat cel·lular deEchinacòsid (ECH): es va utilitzar el reactiu 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- per a l'assaig de viabilitat cel·lular (MTT). La concentració cel·lular es va ajustar a 2 × 105 cèl·lules/ml en una placa de 96-pou. A continuació, es van afegir 20 µL d'ECH (diluït al 2% del medi) i es van incubar durant 24 h a 37 ◦ C en una incubadora al 5% de CO2. Més tard, es van afegir 100 µL de reactiu MTT i es van incubar durant 4 h a 37 ◦ C en condicions fosques. L'absorbància es va mesurar a 570 nm (lector ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suïssa).

Viabilitat cel·lular relativa (%)=[(Una mostra a 570 nm - Ablank a 570 nm)]/[(Acontrol a 570 - Ablank a 570)] × 100.

Assaig de reducció de tetrazoli nitroblau (NBT) i assaig de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH): el nombre de cèl·lules es va ajustar a 1 × 1{{10}}6 cèl·lules/ mL. A continuació, es van afegir 5 0 mg/mL d'ECH, resveratrol (RES) i productes finals de glicació avançada (AGEs) (control) i es van cocultivar durant 18 h a 37 ◦C. A continuació, es van afegir 0, 3 ml de solució de NBT (0, 1 mg/ml de NBT, 5% de FBS i 3% de sulfòxid de dimetil (DMSO) dissolts en 10 ml de DMEM) i es van incubar a 37 ◦ C en 5% de CO2 durant 1 h. Després de la centrifugació (a 800 × g durant 3 min) es va eliminar el sobrenedant i es va afegir 200 µL de DMSO i es va agitar durant 5 min en un oscil·lador ultrasònic (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). L'absorbància es va mesurar a 630 nm. Per a l'assaig de radicals DPPH, es va prendre Trolox (en alcohol al 95%) com a estàndard. A continuació, es van barrejar 75 µl de solució de DPPH 0,5 mM amb 25 µl de mostres i es van deixar reaccionar a temperatura ambient en un lloc fosc durant 30 min. La mescla es va agitar i es va mesurar l'absorbància a 517 nm.

Anàlisi del contingut d'espècies reactives d'oxigen (ROS): el nombre de cèl·lules es va ajustar a 2 × 105 cèl·lules/ml en una placa de pou 12-conté un 2% de FBS. A continuació, es van afegir 50 µL/mL d'ECH, RES i AGEs a ​​la placa i es van incubar a 37 ◦ C durant 24 h. Després de 24 h, es va afegir 20 70 -diacetat de diclorofluoresceïna (DCFH-DA) i es va incubar a 37 ◦ C durant 30 min. Després de la centrifugació (400 × g, 5 min), es va eliminar el sobrenedant i les cèl·lules es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). Després, les cèl·lules es van suspendre en 1 ml de PBS i es van determinar els nivells de ROS mitjançant un citòmetre de flux (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, EUA).

Identificació i anàlisi quantitativa de proteïnes: Les proteïnes es van extreure mitjançant un reactiu d'extracció de proteïnes (T-PER). La densitat cel·lular es va ajustar a 2 × 105 cèl·lules/mL en una placa de pou 12- i 50 µL/mL d'ECH, RES i un receptor per a l'antagonista del producte final de glicació avançada (RAGE), i es van afegir i incubar AGE. a 37 ◦C en una incubadora al 5% de CO2 durant 24 h. Després, es van afegir 400 µL de T-PER, es van raspar les cèl·lules i es van centrifugar a 125, 000 × g durant 20 min (4 ◦C). El sobrenedant es va recollir i emmagatzemar a -80 ◦ C (-80 ◦ C congelador, Nuaire, Plymouth, MN, EUA) per a una anàlisi posterior. Es va utilitzar un kit d'àcid bicinconínic (BCA) per a la quantificació de proteïnes. A continuació, es van afegir 10 µL de solució cel·lular estàndard i 200 µL de reactiu BCA a les plaques de pous 8- i es van incubar a 37 ◦ C en una incubadora al 5% de CO2 durant 30 min. L'absorbància es va mesurar a 562 nm. L'anàlisi d'identificació de proteïnes es va realitzar mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de dodecil sulfat de sodi. Les mostres es van preparar afegint lisat de proteïnes a un tampó de càrrega de proteïnes i es va realitzar una anàlisi de Western blot per detectar les proteïnes específiques.

2.2.2. Anàlisi in vivo

Disseny del model animal: es van comprar seixanta rates mascles Sprague–Dawley (SD) d'{{0}}setmanes d'edat al National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Cada rata es va allotjar individualment en gàbies d'acer inoxidable desinfectants a temperatura controlada (23 ± 1 ◦ C) i humitat (40-60%) amb un cicle de 12 h de llum / 12 h de foscor. El menjar i l'aigua es van proporcionar ad libitum. Cada rata va ser domesticada la primera setmana i es va administrar la dieta de rosegadors de laboratori 5001 com a dieta principal. Tots els procediments van seguir l'estàndard del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals (aprovació IACUC núm. 101026) de la National Taiwan Ocean University, Taiwan. Després de la domesticació, les rates es van dividir en dos grups: el grup control (Con) que es va alimentar amb la dieta de laboratori 5001 i el grup diabètic que es va alimentar amb una dieta alta en greixos (HFD, 40%) durant tot l'experiment. Després de ser alimentats amb HFD durant 4 setmanes, les rates del grup diabètic van ser injectades amb estreptozotocina (65 mg/kg) (STZ) per induir diabetis mellitus (DM). Dins dels 15 minuts posteriors a la injecció de STZ, es va injectar nicotinamida (230 mg/Kg de pes corporal). Una setmana després de la injecció, es va realitzar una prova de tolerància a la glucosa oral (OGTT) per determinar l'èxit de la inducció de la diabetis mellitus (DM). Després d'això, els animals es van dividir en sis grups: el control (alimentat amb la dieta de laboratori 5001); grup DM (DM + 45% HFD); Grup DMR (DM + rosiglitazona: 0,571 mg/kg de peso corporal) + 45% HFD; Grup DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg de peso corporal) + 45% HFD; Grup DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg de peso corporal) + 45% HFD; i grup DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg de peso corporal) + 45% HFD. La rosiglitazona (RSG) es va prendre com a control positiu. Es van utilitzar tres dosis de CTE (80, 160 i 320 mg/kg) segons la recomanació de les directrius d'avaluació funcional dels aliments saludables de la Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Els tractaments es van donar fins al final de l'experiment. Totes les rates experimentals es van sacrificar després de 6 setmanes. La sang recollida de les rates es va centrifugar a 3000 rpm durant 15 min a 4 ◦C. El sobrenedant es va examinar per a l'anàlisi següent:

Determinació de glucosa total, triglicèrids i colesterol: La determinació de glucosa es va dur a terme mitjançant kits enzimàtics de glucosa. A continuació, es van afegir 20 µL de mostres de plasma sanguini als reactius i es van mantenir a 37 ◦ C durant 5 min. Els triglicèrids totals i la concentració de colesterol total es van determinar mitjançant kits enzimàtics de triglicèrids i colesterol. A continuació, es van afegir 10 µL de plasma sanguini als reactius i l'experiment es va dur a terme segons les instruccions del fabricant. L'absorbància es va mesurar a 510 nm.

Glucosa/triglicèrids/colesterol total en plasma (mg/dL)=(Mostra - ABblanc)/(Astandard - ABblanc) × 200.

Exemple: Absorbància de mostres de sang, ABblanc: valor d'absorbància dels kits sense mostra, Aestàndard: valor d'absorbància del reactiu estàndard, 200: reactius estàndard a una concentració de 200 mg/dL.

Avaluació del model d'insulina, leptina i homeostàtica - Determinació de la resistència a la insulina (HOMA-IR):El nivell d'insulina es va determinar mitjançant kits d'ELISA d'insulina. Aquí, 25µS'hi va afegir L de plasma sanguinireactius i es va mesurar l'absorbància a 450 nm. El contingut total de leptina es va determinar mitjançant aKit d'assaig immunomètric d'enzims de leptina.Aleshores, 100µEs va analitzar L de plasma i l'absorbànciaes va mesurar a 450 nm mitjançant un lector ELISA. Tot l'experiment es va dur a terme segonsinstruccions del fabricant. El valor HOMA-IR es va determinar a partir del model d'homeòstasiequació d'avaluació=Concentració d'insulina plasmàtica en dejú (mg/ml)× glucosa plasmàtica en dejuniconcentracions (mmol/L)/22,5.

Peroxidació de lípids de plasma: aquí, es va barrejar {{0}},5 ml de plasma sanguini amb 1 ml de reactiu (15%, p/v àcid tricloroacètic en {{{0},25 N àcid clorhídric (HCl) ) i 0,375%, p/v àcid tiobarbitúric en HCl 0,25 N) i col·locat en un bany maria (bany maria, BUCHI 461, Zuric, Suïssa) a 100 ◦C durant 15 min. Després de refredar-se, es va afegir 1 ml de n-butanol, es va sacsejar vigorosament i es va centrifugar a 1500 × g durant 10 min. Es va recollir el sobrenedant i es va mesurar l'absorbància a 532 nm [12].

Concentració de malondialdehid (MDA) (nM/mL)=[(Una mostra a 532 nm − Un blanc a 532 nm)/ (Un estàndard a 532 nm − Un blanc a 532 nm)] × 5.

estàndard a 532 nm − Ablank a 532 nm)] × 5. Determinació dels nivells de testosterona plasmàtica i hormona luteïnitzant (LH): es va utilitzar el kit ELISA de testosterona per mesurar el nivell de testosterona al plasma sanguini. Es va utilitzar el kit RIA per determinar la concentració de LH. A continuació, es van afegir 50 µL de plasma i els càlculs es van basar en la concentració de l'hormona LH-RP-3 (estàndard). Els passos posteriors es van realitzar segons les instruccions del fabricant.

Determinació de la concentració del factor de necrosi tumoral (TNF) i d'interleucina-6 (IL-6): l'anticòs capturat es va diluir 250 vegades en tampó de recobriment, afegit a un 96- placa de pou (100 µL/pou) i es manté a 4 ◦ C durant la nit. El sobrenedant es va aspirar i es va rentar cinc vegades amb tampó de rentat (1 vegada PBS, 0, 05% Tween 20). Després de la incubació (1 h) amb 200 µg de diluent d'assaig, les cèl·lules es van rentar 5 vegades amb tampó de rentat i es van afegir 100 µl de solució estàndard de TNF o mostres de prova a cada pou i es van incubar durant 2 h. Després del rentat, es van afegir 100 µL d'anticossos detectats amb IL-6- i es van incubar durant 1 h a temperatura ambient. El sobrenedant es va aspirar i es va rentar 5 vegades. A continuació, es van afegir 480 µl de l'enzim avidina-peroxidasa de rave picant (HRP) i es van incubar durant 30 min a temperatura ambient. El sobrenedant es va aspirar i es va rentar cinc vegades amb un tampó de rentat. A continuació, es van afegir 100 µL de solució de substrat i es van incubar durant 15 min a temperatura ambient. Més tard, es van afegir 50 µL de solució de parada (àcid fosfòric 1 M) a cada pou i es va mesurar l'absorbància a 450 nm.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER REPARAR LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Anàlisi dels paràmetres d'esperma i testicles

Recollida de mostres d'esperma: La recollida de mostres d'esperma es va realitzar segons el mètode que s'ha informat anteriorment a [13]. Els espermatozoides es van recollir del sobrenedant i es van utilitzar per a una anàlisi posterior.

El nombre d'espermatozoides, la motilitat dels espermatozoides i els espermatozoides anormals: el nombre d'espermatozoides es va calcular mitjançant l'hemocitòmetre i la solució de blau tripà. A continuació, es van barrejar 100 µL de líquid d'esperma amb una solució de blau tripà i es va calcular el nombre d'espermatozoides, la motilitat i els espermatozoides anormals mitjançant un hemocitòmetre i un microscopi [14].

Reducció de NBT de tetrazoli blau nitro i peroxidació lipídica d'esperma i testicles: La peroxidació de lípids i la reducció de NBT es van analitzar segons el mateix procediment d'anàlisi de plasma.

Determinació de l'activitat de la superòxid dismutasa (SOD) i de la catalasa: es va analitzar l'activitat de la superòxid dismutasa (SOD) mitjançant el kit RANSEL. Aquí, {{0}}.{0Es van afegir 5 ml d'homogeneïtats testiculars a 1,7 ml de solució de reacció (0,05 mM de xantina, 0,025 mM 2-({{{0}}}). {9}}iodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-clorur de feniltetrazoli (INT)). Després de la barreja, es van afegir 0, 25 ml de xantina oxidasa (80 U/L) i es va fer reaccionar a temperatura ambient durant 30 s. L'absorbància es va mesurar a 505 nm. La concentració de proteïnes de l'homogenat testicular es va determinar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes Bio-Rad DC i es va calcular la seva activitat específica (proteïna U/mg). L'activitat de la catalasa (CAT) es va determinar segons un mètode informat anteriorment [15].

Tinció H&E (hematoxilina i eosina).

El testicle es va remullar en un 10% de formalina durant 24 hores i es va emmagatzemar a 4 ◦C. Els teixits tenien una mida micro i estan units a la diapositiva. Després de la fixació (95% metanol + 5% àcid acètic), les diapositives es van submergir en hematoxilina durant 3 minuts, es van rentar amb aigua corrent durant 5 minuts i després es van remullar amb alcohol al 50%, 70% i 90% per un minut. Després d'això, les diapositives es van tacar amb eosina durant 10 s i es van remullar amb alcohol al 100% durant un minut fins que es va esvair. Finalment, el portaobjectes es va remullar amb xilene durant un minut. Més tard, el portaobjectes es va assecar a l'aire i es va tancar. El tub tacat es va col·locar en un microscopi de contrast de fase invertida (microscopi de diferència de fase invertida, Olympus CK-2, Tòquio, Japó) per observar la morfologia.

Anàlisi de l'hipotàlem

El ratolí KISS1, el receptor acoblat a proteïnes G (GPR) 54, supressor de la senyalització de citocines 3 (SOCS-3) i les seqüències gèniques de la sirtuina 1 (SIRT1) es van identificar a la base de dades de gens NCBI (Centre Nacional d'Informació Biotecnològica). i es va dissenyar una imprimació específica utilitzant Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EUA.). Els primers utilitzats en l'experiment es mostren a la taula 1.

Extracció d'àcid ribonucleic (ARN) de l'hipotàlem. L'extracció d'ARN de l'hipotàlem del cervell es va dur a terme mitjançant el kit RNeasy Lipid Tissue Mini. Els ARNm obtinguts es van mesurar quantitativament mitjançant transcripció inversa (RT) i reacció en cadena de la polimerasa (PCR). L'ADN de compliment obtingut de l'anàlisi RT es va emmagatzemar a -20 ◦ C per a un ús posterior. L'ADN extret es va sotmetre a una anàlisi de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la polimerasa Taq. A continuació, es van prendre 5 ~ 10 µL del producte de PCR i es van analitzar mitjançant electroforesi en un col·loide d'agar a l'1,5%. La imatge es va prendre en un sistema d'imatge UVP BioDoc-It. Es va prendre àcid desoxiribonucleic complementari (ADNc) transcrit a la inversa i es va realitzar PCR mitjançant el kit IQ SYBR Green Supermix. Posteriorment, es va analitzar amb iQTM 5 Optical System Software. Les proteïnes es van extreure mitjançant un reactiu d'extracció de proteïnes (T-PER). A continuació, es van afegir 20 mg d'homogeneïtat testicular a 400 µL de T-PER i es van centrifugar (centrífuga d'alta velocitat, Hettich CR-12, Tuttlingen, Alemanya) a 4 ◦C (125,000× g). ) durant 20 min. El mètode següent era similar a l'anàlisi "identificació i quantificació de proteïnes" en anàlisi in vitro.

2.3. Anàlisi estadística

Els resultats experimentals es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (mitjana ± SD) i les dades es van analitzar mitjançant el programari Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, Nova York, NY, EUA. Les diferències entre els grups es van analitzar mitjançant anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). Es van analitzar múltiples comparacions de diferents grups mitjançant la prova de Duncan amb el valor de p <0,05 com a nivell significatiu.

3. Resultats

3.1. Anàlisi in vitro

3.1.1. Comparació d'activitats antioxidants d'ECH, CTE i RES

A llarg termini hL'estrès oxidatiu alt i la inflamació crònica són les principals causes de la diabetiscomplicacions [16]. Els CTE contenen diversosglicòsids feniletanoides com l'equinacòsid(ECH) i acteòsid, amb el potencial d'activitat antioxidant [17]. Eliminació radical de DPPHes va realitzar un assaig per avaluar l'activitat antioxidant de l'ECH. Trolox i resveratrol(3,5,4'-trihidroxistilben, RES) es van prendre com a control estàndard i positiu respectivament. Com es mostraa la figura1, ECH va mostrar una millor activitat d'eliminació de radicals i l'activitat va ser significativament més altaque el del control positiu (RES).

3.1.2. Viabilitat cel·lular de l'ECH a les cèl·lules de Leydig LC-540 i TM3

Es va realitzar un assaig MTT per avaluar la viabilitat cel·lular de diferents concentracions d'ECH. Les cèl·lules de Leydig LC-540 i les cèl·lules de Leydig TM3 van mostrar més del 80% de viabilitat després de ser tractades amb ECH (figura 2). En comparació amb les altres concentracions, una concentració de 100-µM (dilucions de 100 µM en 2% FBS) d'ECH va mostrar una millor viabilitat cel·lular a les cèl·lules de Leydig TM3. El resultat va indicar que l'augment de la concentració d'ECH no aporta cap toxicitat significativa a les cèl·lules.

3.1.3. Efecte de l'ECH sobre la producció de superòxid induïda per l'edat mitjançant assaig NBT en cèl·lules LC-540 i TM3 Leydig

Els AGE causen danys oxidatius al cos a causa de l'oxidació de la glucosa i la formació de radicals lliures com ara O2-, radicals hidroxil i grups carbonil [18]. Després de ser estimulades amb 50 ug/mL d'AGEs, les cèl·lules LC-540 (Figura 3a) i TM3 (Figura 3b) es van tractar amb ECH i RES (5 μM i 10 μM cadascuna). Els resultats van mostrar que la producció d'anió superòxid va augmentar en el grup de control (AGEs estimulats), però la producció d'anió superòxid es va reduir després del grup control (AGEs estimulats), però la producció d'anió superòxid va disminuir després de la producció de superòxid i es va protegir. les cèl·lules pel dany oxidatiu. En el cas de les cèl·lules LC-540, 10 µM ECH van mostrar una activitat gairebé similar amb el grup normal. La producció de superòxid a ambdues cèl·lules es va reduir amb un augment de la concentració tant d'ECH com de RES.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Efecte de l'ECH sobre la producció d'H2O2 en cèl·lules de Leydig LC-540 estimulades per AGE

Es va realitzar un assaig DCFH-DA per detectar la presència d'espècies oxidatives. Després d'entrar a les cèl·lules, el colorant fluorescent DCFH-DA s'oxida per H2O2 intracel·lular i forma diclorofluoresceïna (DCF). Com es mostra a la figura 4, hi va haver un augment significatiu de la producció intracel·lular d'H2O2 en el grup estimulat per AGE (control), mentre que l'addició de 10 µM ECH i RES va reduir significativament la producció d'H2O2 a les cèl·lules. L'administració de 10 µM d'ECH va donar lloc a només un 47,1% de la producció d'H2O2, significativament inferior a la del grup control.

3.1.5. Efecte de l'ECH sobre els nivells d'expressió de proteïnes RAGE i NF-κB en cèl·lules de Leydig LC-540 estimulades per AGE

Es va realitzar una anàlisi Western blot per confirmar la presència de RAGE a les cèl·lules de Leydig LC-540. L'efecte de l'ECH sobre els nivells d'expressió de proteïnes RAGE (Figura 5a) i NF-κB (Figura 5b) a les cèl·lules de Leydig estimulades per AGEs es va mostrar a la figura 5. Els resultats van mostrar que una concentració de 50 µg/mL d'AGEs induïa RAGE i NF- més alts. L'expressió κB a les cèl·lules de Leydig LC-540 i la concentració de 10 µM d'ECH i RES van reduir significativament l'expressió de RAGE i NF-κB. L'expressió de NF-κB va ser significativament menor en RES i ECH que en antagonistes de RAGE. Així doncs, els resultats van confirmar que l'ECH va reduir el nivell d'inflamació disminuint el nivell de RAGE i NF-κB.

3.1.6. Efecte de l'ECH sobre la via de síntesi de testosterona en cèl·lules de Leydig LC-540 estimulades per AGE.

El procés d'espermatogènesi i la infertilitat masculina depèn de la presència de testosterona. Com es mostra a la figura 6, les expressions de les proteïnes StAR (figura 6a), CYP11A1 (figura 6b), CYP17A1 (figura 6c) i HSD17 3 (figura 6d) es van reduir significativament en LC{{11} estimulada per AGE. }} Cèl·lules de Leydig (grup control). Les expressions de les proteïnes StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 van augmentar significativament quan es van afegir l'antagonista RAGE, RES i ECH. L'augment de l'expressió de les proteïnes StAR i CYP11A1 es va observar tant en els grups tractats amb ECH com amb RES. El nivell d'expressió de CYP17A1 era gairebé similar en els grups RES i ECH. Les expressions de la proteïna HSD17 3 a les cèl·lules de Leydig tractades amb ECH eren molt més altes que les de les cèl·lules tractades amb antagonistes de RES i RAGE. L'augment de l'expressió de proteïnes StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 va indicar la producció normal de testosterona.