Efecte de l'extracte de Cistanches Deserticola sobre lesions de RTEC de conill per H2O2

Resum: Es van cultivar cèl·lules epitelials tubulars renals de conill in vitro per estudiar l'efecte de l'H2O2 sobre la proliferació cel·lular i l'extracte de Cistanche deserticola sobre les cèl·lules epitelials tubulars lesionades per H2O2. La morfologia cel·lular es va utilitzar per observar l'efecte de l'H2O2 sobre la proliferació de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill mitjançant el mètode MTT i l'efecte protector de 2,20 i 200 mg·L － 1 C． L'extracte d'aigua de deserticola i l'extracte d'alcohol es van estudiar mitjançant l'alliberament de LDH. Els resultats van mostrar que el nombre de canvis morfològics de les cèl·lules va augmentar gradualment. El nombre de cèl·lules adherides es va reduir gradualment. La taxa d'inhibició de la proliferació cel·lular i l'alliberament de LDH van augmentar juntament amb l'augment de la concentració d'H2O2. Alta dosi de C. L'extracte de deserticola podria disminuir significativament l'efecte inhibidor de la proliferació de ＲTECs per H2O2 (P ＜ 0． 01) ． L'extracció d'aigua i l'extracte alcohòlic de C. deserticola podria disminuir significativament l'alliberament de LDH (P ＜ 0． 01) ． L'H2O2 va tenir alguns efectes en la reacció de proliferació de ＲTEC de conill, mentre que C． L'extracte de deserticola té un efecte protector sobre la lesió de TEC per H2O2.

Paraules clau: Cistanches deserticola; cèl·lula epitelial tubular renal; prefaci de dany cel·lular

Cistanche deserticola, també conegut com a ginseng del desert, és una tija mesòfila seca, escamosa de Cistanche deserticola YC Ma o Cistanche tubulosa (Schenk) Wish de la família Orobaceae. Té els efectes de tonificar el yang del ronyó, beneficiar l'essència i la sang, humitejar els intestins i alleujar el restrenyiment. S'utilitza tradicionalment per a la deficiència de yang renal, deficiència d'essència i sang, impotència i infertilitat, dolor de cintura i genoll, debilitat dels músculs i ossos i sequedat i restrenyiment intestinal, és la medicina tonificant de yang renal més utilitzada a la història.. 

Cistanche deserticola

L'H2O2, com a forma d'espècies reactives d'oxigen, té un fort efecte a l'hora d'induir la peroxidació lipídica i pot reaccionar amb gairebé qualsevol component cel·lular, provocant peroxidació lipídica en cadena i provocant apoptosi i disfunció cel·lular [2,3]. L'experiment investiga principalment l'efecte de l'extracte de Cistanche deserticola sobre la inhibició de la proliferació induïda per H2O2- i lesions de les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill i explora preliminarment el seu efecte protector sobre les cèl·lules epitelials tubulars renals.

1 Material i mètodes

1.1 Medicament experimental

Cistanche deserticola ma es va comprar a Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd. (número de lot 151201).

Cistanche vivent del desert

1.2 Animals

Conill blanc de Nova Zelanda, mascle, de 20 dies, comprat a la base experimental de Guizhou Livestock Research Institute, amb número de llicència animal SCXK (Guizhou) 2012-001.

1.3 Reactius

DMEM/F-12 (1:1), Gbico Corporation; Sèrum boví fetal, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd; Dimetil sulfòxid (DMSO), Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd; Trypsin, Amresco Company; Blau de tiazol (MTT), Genview; Kit de proves de citotoxicitat no radioactiva, Promega Corporation; Etanol anhidre, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Instruments

Incubadora de CO2, tipus 3111, Thermo Fisher Scientific; Marcador enzimàtic, tipus 1510, Thermo Fisher Scientific; Banc de treball ultra net, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; Microscopi de fluorescència invertida, Ningbo Shunyu; Evaporador rotatiu, RE-52AA, fàbrica d'instruments bioquímics de Shanghai Yarong; Assecador de congelació, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Mètode

1. 5.1 Preparació de l'extracte de Cistanche deserticola

Agafeu les herbes medicinals seques de Cistanche deserticola i tritureu-les a trossos petits. Peseu amb precisió 100 g de cada pols i afegiu 10 vegades la quantitat d'aigua destil·lada i un 75 per cent d'etanol a escalfar i reflux per a l'extracció 3 vegades. La primera vegada és de 3 hores, i la segona és de 1 5 hores, la tercera vegada durant 1 hora, fusioneu 3 filtrats, reduïu la pressió i concentreu-vos a l'extracte, calculeu el rendiment de l'extracte com a 22 30 per cent, extracte d'etanol 21 70 per cent , alcohol residual volàtil, un mecanisme de liofilització per obtenir aigua i extractes d'alcohol de Cistanche deserticola, segellats, assecats i emmagatzemats en un lloc fosc per al seu ús futur.

1. 5. 2 Cultiu cel·lular

Construeix un model de cèl·lules epitelials tubulars renals utilitzant el mètode descrit per Zhao Dan et al. [4], aïllar i cultivar cèl·lules epitelials tubulars renals primàries de 20-conills d'un dia d'edat i esperar que les cèl·lules creixin fins al 90 per cent del plat de cultiu i després digerir-les amb tripsina. Utilitzant un medi de cultiu complet DMEM/F-12 que contenia un 1% de sèrum fetal boví a una velocitat d'1 dues × 104 cèl·lules es va inocular en una placa de 96 pous i es va cultivar a 37 graus i un 5% de CO2.

1. 5. 3 Establiment d'un model de lesió de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill induïda per 3 H2O2

Consulteu 1 5. 2 Inoculeu les cèl·lules i, després de 48 hores de cultiu cel·lular estable, utilitzeu H2O2 per danys. Configureu un grup experimental i un grup control en blanc, amb 4 repeticions a cada grup, repetides tres vegades. Grup experimental: Substituïu el medi de cultiu complet per diferents concentracions d'H2O2, amb concentracions d'H2O2 de 550, 500, 450, 400 i 350, respectivament μ Mol · L-1, grup control en blanc: Substituïu el medi de cultiu complet, Continueu cultivant durant 24 hores sota la condició de 37 graus i 5 per cent de CO2, realitzeu l'examen microscòpic i reculli imatges. El mètode MTT [5] es va utilitzar per mesurar la proliferació de cèl·lules després de l'acció de l'H2O2, i el valor d'absorbància (valor OD) es va mesurar a 490 nm. Utilitzant un kit de detecció de citotoxicitat no radioactiu per determinar els canvis en l'alliberament de LDH cel·lular després del tractament amb H2O2, alliberament de LDH (per cent)=quantitat de LDH sobrenedant/(quantitat de LDH sobrenedant més quantitat de LDH de lisat) × 100 per cent. Tinció de fluorescència AO/EB [6]: Agafeu respectivament 100 μ G/mL de solució AO i 100 μ 100 g/mL de solució EB cada μL. Barregeu bé i afegiu-ne 10 μL a cada pou. Col·loqueu-lo immediatament sobre un contrast de fase invertit. microscopi de fluorescència per a l'observació, mantenir el camp de visió d'observació sense canvis en 5 minuts i recollir imatges sota llum blava a 450 ± 10 nm i llum verda a 532 ± 10 nm, respectivament. Utilitzeu un sistema de recollida de fluorescència per a la síntesi de fluorescència per obtenir imatges de tinció de fluorescència.

1. 5. 4 Efecte de la pols d'extracte de Cistanche 4 sobre el dany induït per H2O2-a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill

Cistanche en pols

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche per a malalties renals

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Segons 1 5. 2 Inoculeu les cèl·lules i, després de 24 hores de cultiu cel·lular estable, afegiu 200 ul de medi de cultiu complet que conté extracte de Cistanche deserticola a cada pou per protegir prèviament les cèl·lules durant 24 hores. Configureu un grup experimental, un grup model i un grup de control en blanc, amb tres repeticions per grup. Grup experimental i grup model: substituir per 400 μ Mitjà de cultiu complet amb mol · L-1 H2O2; Grup control en blanc: medi de cultiu complet. Continueu cultivant durant 24 hores. La proliferació cel·lular es va mesurar mitjançant el mètode MTT i els canvis en l'alliberament de LDH cel·lular es van mesurar mitjançant un kit d'assaig de citotoxicitat no radioactiu.

1.6 Tractament estadístic

Els resultats de les dades s'expressen en x ± s utilitzant el programari estadístic SPSS 19 0 per a l'anàlisi estadística. Es va utilitzar l'anàlisi de la variància d'un sol factor per a comparacions entre grups i es va utilitzar el mètode LSD per a comparacions múltiples entre grups, amb P<0 05 indicating statistical significance.

2 Resultats i anàlisi

2.1 Canvis morfològics de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill induïts per H2O2

Després de tractar les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill amb diferents concentracions d'H2O2 durant 24 hores, es va observar la morfologia de les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill al microscopi, tal com es mostra a la figura 1. Amb l'augment de la concentració d'H2O2, el nombre de cèl·lules amb els canvis morfològics va augmentar gradualment, el nombre de cèl·lules adherides a la cèl·lula parietal va disminuir gradualment, algunes cèl·lules es van allargar, la brillantor cel·lular va disminuir i la mida va disminuir. La concentració d'H2O2 va assolir els 550 μ Mol · L-1, els axons desapareixen, les membranes cel·lulars es trenquen, la contracció cel·lular, els buits cel·lulars augmenten i apareixen espais entre les parts de les cèl·lules.

Fig. 1 Efecte de la concentració d'H2O2 sobre la morfologia del conillRTEC (100 ×)

2.2 L'efecte de 2,2 H2O2 sobre la proliferació de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill

Utilitzeu cèl·lules epitelials tubulars renals de conill tractades amb 350, 400, 450, 500 i 550, respectivament, μ Mol · L-1 H2O2 durant 24 hores, i es va mesurar l'absorbància mitjançant el mètode MTT. Els resultats van mostrar que diferents concentracions d'H2O2 tenien un efecte inhibidor sobre la proliferació de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill, amb un valor IC50 de 439 07 μ mol·L － 1.500 μ L'efecte inhibidor de H2O2 amb mol · L -1 sobre la proliferació cel·lular pot arribar a més del 50 per cent després de 24 hores, de manera que aquesta concentració es va seleccionar per a investigacions posteriors.

2.3 L'efecte de 2,3 H2O2 sobre l'alliberament de LDH a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill

Després de 24 hores de tractament amb H2O2 en cèl·lules epitelials tubulars renals de conill, es van mesurar els valors OD de les reaccions de LDH en el sobrenedant cel·lular i el lisat cel·lular mitjançant mètodes de detecció de citotoxicitat no radioactius i es va calcular l'alliberament de LDH de les cèl·lules. Els resultats es mostren a la Taula 1. Les diferents concentracions d'H2O2 poden provocar un augment de l'alliberament de LDH de les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill, i com més gran sigui la concentració d'H2O2, més gran serà l'alliberament de LDH de manera dependent de la concentració. H2O2 a una concentració de 400 mmol · L-1 fa que l'alliberament de LDH cel·lular superi el grup en blanc en més d'un 50 per cent, donant lloc a danys cel·lulars greus.

Tab. 1 Efectes de l'H2O2 sobre l'alliberament de LDH dels RTEC de conill

Nota: en comparació amb el grup de control en blanc, * P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 Resultats de la tinció de fluorescència AO/EB de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill tractades amb 2.4 H2O2

Després de tractar les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill amb H2O2 durant 24 hores, les cèl·lules es van tacar amb fluorescència AO/EB, tal com es mostra a la figura 2. Es va jutjar preliminarment que el mecanisme de H2O2 a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill era principalment provocar necrosi. Diferents concentracions d'H2O2 poden causar diferents graus de necrosi a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill, amb concentracions de H2O2 inferiors a 400 μ A mol · L-1, la cromatina nuclear es redueix en un cercle de color verd, que es considera principalment com apoptosi primerenca. Amb l'augment de la concentració d'H2O2, és de més de 450 μ A mol · L-1, les cèl·lules mostraven una forma de perla no rodona de color vermell ataronjat i el nombre de cèl·lules necròtiques augmentava de manera dependent de la concentració.

2.5 Efecte de 2.5 Cistanche deserticola sobre la proliferació induïda per H2O2-de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill

Estudi experimental sobre Cistanche deserticola

La taxa de supervivència de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill a diferents concentracions (2, 20, 200 mg! L-1) d'extractes d'aigua i alcohol de Cistanche deserticola no va mostrar cap diferència significativa en comparació amb les cèl·lules cultivades en condicions normals sense intervenció. Com es mostra a la figura 3, en comparació amb el grup model, els grups d'alta concentració d'extractes d'alcohol i aigua de Cistanche deserticola van reduir significativament l'efecte inhibidor de l'H2O2 sobre la proliferació de cèl·lules epitelials tubulars renals de conill (P).<0 01).

Fig. 2 Tinció AO/EB del conillRTEC tractats per diferents concentracions d'H2O2 (100 ×)

Nota: en comparació amb el grup de models, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Fig. 3 Efecte de C． deserticola sobre la inhibició de H2O2 - conill induïtRProliferació de TEC

2.6 Efecte de 2.6 Cistanche deserticola sobre el dany induït per H2O2 a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill

Els resultats de l'impacte en l'alliberament de LDH a les cèl·lules es mostren a la figura 4. Els grups de concentració alta, mitjana i baixa d'extracte d'etanol i extracte d'aigua de Cistanche deserticola van donar lloc a un alliberament de LDH significativament menor a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill després de H2O2. tractament que en el grup model (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Nota: en comparació amb el grup de models, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Fig. 4 Efecte de C． deserticola sobre H2O2: alliberament de LDH induït pel conillRTECs

3 Discussió

Cistanche deserticola, conegut com "ginseng del desert", té un valor medicinal extremadament alt i és una famosa medicina tònica xinesa. El "Shennong Materia Medica Classic" [7] descriu la medicina de primer nivell com: "Shangyao... principalment nodreix la vida per respondre al cel, no tòxic, i s'ha de prendre amb freqüència sense fer mal a la gent..." Cistanche deserticola està catalogat com un medicament de primer nivell, amb un sabor dolç i una temperatura suau. La "Llista de metges famosos" [8] assenyala que Cistanche deserticola és "àcida, salada i no tòxica". Després, els registres de la naturalesa, el gust i el meridià de Cistanche deserticola en diverses dinasties de la medicina herbal xinesa són coherents. La seva naturalesa és lleugerament càlida i el seu gust és dolç, àcid i salat, que pertany als meridians del ronyó i l'intestí gros. S'utilitza tradicionalment per a la deficiència de yang renal, el dolor de cintura i genoll i la debilitat muscular i òssia, els seus efectes i mecanismes farmacològics sempre han estat un focus d'investigació. Els estudis farmacològics moderns han demostrat que Cistanche deserticola pot resistir l'envelliment, millorar les capacitats d'aprenentatge i memòria i regular les funcions immunitàries. S'utilitza àmpliament en les prescripcions clíniques de la medicina tradicional xinesa, els medicaments tradicionals de patent xinesa i les preparacions senzilles i els productes sanitaris.

Suplement de Cistanche a prop meu

L'estrès oxidatiu és l'inducció clau d'algunes malalties importants, que es deu al desequilibri entre la formació i l'eliminació d'espècies reactives d'oxigen al cos, donant lloc a un cert grau de dany oxidatiu als histiòcits. Per tant, una investigació en profunditat sobre el mecanisme de la resposta a l'estrès pot trobar una manera raonable de prevenir, millorar o, fins i tot, eliminar eficaçment les malalties d'irritabilitat. L'estrès oxidatiu pot provocar diverses peroxidacions cel·lulars i de proteïnes al cos [9], i l'H2O2 és escollit com una de les substàncies exògenes per danys a la investigació. Té un fort efecte en induir la peroxidació lipídica, provocant reaccions de peroxidació lipídica en cadena i conduint a l'apoptosi i la disfunció cel·lular. Actualment, la investigació sobre la nefrotoxicitat d'aquesta substància exògena i el seu efecte antagònic es basa principalment en l'establiment de models animals, i hi ha relativament pocs informes de literatura sobre l'establiment de models in vitro per a investigacions relacionades. En comparació amb els models animals de nefrotoxicitat, el model de cèl·lules nefrotòxiques in vitro té avantatges com un objectiu clar de l'acció, un cicle de medicació curt i una dosi baixa.

Cistanche d'herbes xineses

Estudiar el model de cèl·lules nefrotòxiques in vitro induït per substàncies exògenes mitjançant canvis en la morfologia cel·lular, efectes inhibidors de substàncies exògenes sobre la proliferació cel·lular i canvis en l'alliberament de LDH cel·lular. Les diferents concentracions d'H2O2 tenen un impacte significatiu en els canvis morfològics de les cèl·lules. A mesura que augmenta la concentració de substàncies exògenes, es constata que augmenta el nombre de deformacions cel·lulars. L'assaig MTT és un mètode d'ús habitual per detectar el nombre de cèl·lules vives. En experiments en què diferents concentracions de Cistanche deserticola protegeixen les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill del dany per H2O2, diferents concentracions de Cistanche deserticola van reduir significativament la taxa d'inhibició de H2O2 a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill i depèn de la concentració. Quan la membrana cel·lular està danyada, la LDH intracel·lular s'alliberarà al medi de cultiu, el contingut de LDH al medi de cultiu cel·lular és un indicador important per detectar la mort cel·lular. Aquest estudi va trobar que el nivell de LDH al medi de cultiu cel·lular del grup model amb H2O2-va provocar danys a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill augmentar significativament, mentre que el nivell de LDH al grup experimental tractat amb diferents concentracions de Cistanche deserticola significativament. disminueix de manera dependent de la concentració.Els resultats de la investigació suggereixen que l'establiment d'un model de dany induït per H2O2-a les cèl·lules epitelials tubulars renals de conill i l'exploració preliminar de l'efecte protector de l'extracte de Cistanche deserticola sobre les cèl·lules epitelials tubulars renals, no només estableix les bases per a la investigació sobre el dany cel·lular causat. per estrès oxidatiu, però també proporciona dades bàsiques per al desenvolupament i utilització de Cistanche deserticola.

referència:

［1］ Cap. P(2015) Vol Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ Kim JH, Choi W, Lee JH, et al. L'astaxantina inhibeix la mort cel·lular apoptòtica mediada per H2O2 a les cèl·lules progenitores neuronals del ratolí mitjançant la modulació de les vies de senyalització p38 i MEK (J). Microbiol Biotechnol, 2009, 19(11): 1355 - 1363.

［3］ Siu PM, Wang Y, Sempre SE. Senyalització apoptòtica induïda per H2O2 - estrès oxidatiu mediat en tubs C2 Cl2 diferenciats［J］．. Life Sci,2009,84(13): 468 － 481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing, etc. Un estudi sobre els efectes de diverses herbes medicinals xineses en la proliferació de cèl·lules epitelials tubulars renals primàries en conills ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei, et al Estudi sobre l'efecte de la ipriflavona sobre l'activitat dels osteoclasts i la proliferació i diferenciació dels osteoblasts ［ J ］. Journal of Mountain Agricultural Biology, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang, et al. Detecció de l'apoptosi induïda per paclitaxel en cèl·lules tumorals de mama canina in vitro mitjançant el mètode de tinció dual AO/EB [J]. Guangdong Livestock and Veterinary Science and Technology, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG,Yang P J. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Beijing: Xueyuan Press, 2013: 73.

［8］ Tao HJ, Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Beijing: People's Medical Publishing House, 1986: 51.

［9］ Cash TP, Pan Y, Simon M C. Ｒespècies actives d'oxigen i detecció cel·lular d'oxigen［J］． Gratuït Ｒadic Biol Med,2007,43(9): 1219 － 1225．