Efectes de la preparació de plantes herbàcies de Cistanche sobre els efectes de la preparació de plantes herbàcies de Cistanche sobre l'expressió de citocines in vitro N vitro per osteoblasts de rata

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

RESUM

Els osteoblasts (OB) tenen un paper important en la remodelació òssia, els osteoblasts (OB) tenen un paper important en la remodelació òssia mitjançant l'alliberament de citocines com ara gh l'alliberament de citocines com l'osteoprotegerina (OOPG), un activador del receptor del factor nuclear kappa- Lligand B (RA PG), un activador del receptor del factor nuclear kappa-B lligand NKL) i osteopontina (OPN). L'objectiu del nostre estudi era avaluar els efectes dels extractes d'herbes xinesesCistanche(Cistanche deserticola) sobre l'expressió in vitro d'aquestes citocines en cultiu de cèl·lules OB de rata. Els OB primaris es van aïllar del crani de rata mitjançant la digestió de tripsina i col·lagenasa. El fenotip cel·lular es va determinar mitjançant el mètode de tintura suís, la tinció de fosfatasa alcalina, la tinció de Von Kossa i la tinció vermella d'alizarina. L'expressió gènica d'OPG, RANKL i OPN es va analitzar mitjançant PCR quantitativa en temps real. Tots els tractaments amb extractes de plantes herbàcies de Cistanche van augmentar l'expressió gènica d'OPG i RANKL a les 72 hores de cultiu, especialment a concentracions de 5 × 10-2 mg/mL, que eren significativament diferents en comparació amb els cultius control. El tractament va reduir significativament l'expressió de la relació OPG/RANKL a les 48 hores i l'expressió de l'ARNm OPN a les 72 hores de cultiu. L'exposició in vitro d'OB a la preparació de plantes de Cistanche va promoure l'expressió gènica d'OPG i RANKL i va reduir l'expressió gènica d'OPG/RANKL i OPN i, per tant, podria mantenir l'equilibri de formació i reabsorció òssia durant el metabolisme ossi.

Paraules clau:Cistanche, osteoblasts, osteoprotegerina, RANKL, osteopontina, rata

antiosteoblast:Herba de Cistanche

Introducció

La força òssia està determinada per l'estructura i la composició. El teixit ossi s'adapta per adaptar-se a una varietat de càrregues mitjançant el modelatge durant la fase de creixement i la remodelació al llarg de la vida. La remodelació òssia disminueix amb l'envelliment a causa d'una reducció del volum d'os format a la unitat multicel·lular bàsica, la deficiència d'hormones sexuals i la reducció de la formació d'os periòstic (SEEMAN, 2008). El desequilibri en la remodelació òssia pot causar malalties relacionades amb els ossos, com l'osteoporosi, i un augment del risc de fractura.

L'osteoporosi, que causa fractures, dolor i trastorns de la locomoció, afecta milions de persones als Estats Units (NAYAK et al., 2012; SILVERMAN, 2010). El procés clau en la prevenció de la incidència de malalties relacionades amb l'os és mantenir la capacitat de remodelació òssia.

La remodelació òssia és l'equilibri dinàmic de la formació i reabsorció òssia (SEEMAN i DELMAS, 2006). Aquests processos estan controlats principalment pels osteoblasts (OB) i osteoclasts de l'os adult, i per l'expressió de citocines, factors de creixement i hormones (PARFITT, 2000). Els OB, que es deriven de cèl·lules mesenquimàtiques primordials, es troben a la superfície òssia. Els OB són els responsables de la formació òssia i influeixen indirectament en la reabsorció òssia (MACKIE, 2003). Les citocines expressades pels OB, com l'osteoprotegerina (OPG), activador del receptor del lligand del factor nuclear kappa-B (RANKL) i l'osteopontina (OPN), poden promoure la curació de fractures i augmentar la formació òssia en l'osteoporosi (LINKHART et al., 1996). . El desenvolupament de l'OB és un procés seqüencial que inclou la proliferació d'osteoprogenitors, la maduració de la matriu i la mineralització cel·lular (GIUSTINA et al., 2008). Aquest procés està regulat per múltiples gens associats a OB i està molt associat amb el desenvolupament de la formació òssia (HUNG et al., 2010). La progressió de la mineralització osteogènica estimula la formació òssia durant la curació de la fractura òssia. Així, la investigació sobre l'expressió de citocines osteogèniques i els seus efectes sobre la mineralització òssia és fonamental per buscar un agent terapèutic d'origen natural innovador i eficaç per a la prevenció de malalties relacionades amb l'os.

La medicina tradicional xinesa s'ha utilitzat durant milers d'anys en el tractament de malalties relacionades amb els ossos. La planta herbàcia Cistanche, que s'utilitza àmpliament per revitalitzar els ronyons i en la teràpia de malalties òssies, pertany a un gènere de la família de les Orobanchaceae. S'ha informat que els components de l'espècie Cistanche són: glicòsids feniletanoides (PhGs), iridoides, lignans, alditols i oligosacàrids (JIANG i TU, 2009; LI et al., 2010). Les plantes de cistanche són herbes paràsits perennes, que creixen principalment al desert o sobre llepades de sal estèrils, distribuïdes principalment als deserts àrids i càlids del nord-oest de la Xina. A la Medicina Tradicional Xinesa el Cistanche es considera un tònic extraordinari, i rep el nom de "Ginseng del desert". Un estudi realitzat en rates ovariectomitzades (LIANG et al., 2011) va demostrar queExtractes de Cistancheadministrat per via oral va augmentar significativament la densitat mineral òssia i el contingut mineral ossi d'una manera dependent de la dosi. Tanmateix, els mecanismes detallats de l'acció de Cistanche sobre la formació òssia encara no estan clars. Per tant, els objectius d'aquest estudi eren avaluar els efectes de Cistanche sobre l'expressió in vitro de gens de citocines OPG, RANKL i OPN mitjançant cultius de cèl·lules OB de rata, i avaluar els mecanismes pels quals Cistanche promou la cicatrització òssia o prevé/controla. malalties relacionades amb els ossos.

Herba Cistanche per a la prevenció de malalties relacionades amb els ossos

Materials i mètodes

Preparació d'osteoblasts de rata. Els OB de rata es van preparar a partir de calvaries de rates neonatals (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Preparació d'extractes aquàtics de Cistanche en dilucions en sèrie. El Cistanche utilitzat en aquest estudi es va proporcionar a la Farmàcia Tongrentang de la Xina. Trossos secs de Cistanche es van triturar en pols. Els extractes líquids de Cistanche es van preparar decoctant 50 g de pols d'herbes durant 1 hora. A continuació, la preparació es va concentrar a 100 ml mitjançant un evaporador rotatiu i es va filtrar a través de filtres de 0,22 mm. El filtrat es va emmagatzemar a 4 graus a la foscor. L'extracte líquid de Cistanche es va diluir a concentracions en sèrie que van des de 5 × 10 -1 a 5 × 10-4 mg/mL amb el líquid DMEM.

Aïllament d'ARN i PCR de transcripció inversa. La tercera generació d'OBs cultivats es va tractar amb diferents concentracions d'extractes de Cistanche durant 24, 48 i 72 hores. Els tractaments de cultiu cel·lular OB es van realitzar per triplicat. Les cèl·lules es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) dues vegades i es va aïllar l'ARN de les cèl·lules amb reactiu TransZol (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Xina) segons les instruccions del fabricant, i es va extreure amb cloroform, precipitat amb isopropil. alcohol, rentat amb alcohol etílic al 75 per cent i després dissolt en aigua. La transcripció inversa d'ARN (5 μL) es va realitzar mitjançant el Supermix de síntesi d'ADNc de primera cadena TransScript (Trans, Beijing, Xina).

Confirmació de productes de PCR en temps real. Després de l'electroforesi en gel d'agarosa a l'1,5 per cent, es va realitzar la seqüenciació d'ADN per demostrar que els productes de PCR eren els segments gènics codificants d'OPG, RANKL i OPN a l'OB de rata.

Establiment d'un plasmidi que conté el gen diana. La seqüència d'ADN en gel d'agarosa al 2% es va purificar i recuperar mitjançant l'extracció de gel EZNA (Kangweishiji, Xina) i es va transferir a un kit de clonació pEASY-T3 (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Xina). La transformació cel·lular es va aconseguir mitjançant un plasmidi construït que contenia el gen objectiu. Les colònies positives es van seleccionar mitjançant la prova de cribratge de taques blanques i blaves i es van seqüenciar posteriorment. Els plasmidis extrets de les colònies positives, que contenien el gen objectiu, es van diluir proporcionalment amb aigua desionitzada per aconseguir una corba estàndard. PCR quantitativa en temps real (RTQ PCR). Es van construir primers específics segons les seqüències gèniques publicades (NCBI, Nucleotide Database) i sintetitzats per Liuhe-Nuada Gene (Beijing, Xina) tal com es mostra a la taula 1.

L'expressió d'ARNm a les mostres es va quantificar mitjançant les corbes estàndard de plasmidi específiques descrites anteriorment. Els productes es van comparar amb el gen de la casa -actina. La quantitat de gen objectiu es va quantificar mitjançant RTQ PCR, utilitzant el SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, Xina) segons el protocol del fabricant. Les condicions de PCR eren les següents: 94 graus durant 1 minut, 58 graus durant 30 segons, 68 graus durant 1 minut i es van repetir durant 40 cicles. Les dades es van calcular mitjançant el sistema de PCR en temps real 7500 (Applied Biosystems; Waltham, MA, EUA).

Anàlisis estadístics. Les dades es van processar mitjançant ANOVA unidireccional, utilitzant programari estadístic comercial (SPSS 17.0, IBM Corporation; Armonk, NY, EUA). Els resultats es van expressar com la mitjana ± desviacions estàndard dels gens objectiu i la relació -actina. Les diferències es van considerar significatives a P<0.05>

Benefici de l'herba cistanche: prevenir malalties òssies

Resultats

La identificació d'OB de rata. Els OB es van identificar mitjançant mètodes de tinció de cèl·lules específiques i es van demostrar fenotípicament tal com es mostra a la figura 1. (A, B, C i D)

Confirmació dels gens diana. Les mides de les bandes dels gens objectiu es van analitzar en gel d'agarosa al 2% i es va trobar que eren coherents amb la mida esperada (Fig. 2).

Els resultats obtinguts per als segments de gens OPG, RANKL, OPN i -actina que contenien les seqüències de plasmidis del gen objectiu es van comparar amb les seqüències de gens corresponents publicades prèviament al GENBANK mitjançant l'anàlisi BLAST-N, i es va trobar que eren: 100%, 100% , 100 per cent i 99 per cent idèntics, respectivament.

Efecte dels extractes líquids de Cistanche sobre l'expressió OPG, RANKL i OPN. Els nivells de l'ARNm OPG es van reduir quan els OB van estar exposats a totes les concentracions aplicades de Cistanche durant 24 h i 48 h (taula 2).

Es van observar diferències significatives a concentracions de 5×10-1, 5×10-2 i 5×10-4 mg/mL després de 24 hores, i a concentracions de 5×{10-1 i 5 ×10-2 mg/mL després de 48 hores de cultiu (P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Discussió

Els osteoblasts (OB) no només tenen un paper essencial en la creació de l'arquitectura òssia, sinó també en l'homeòstasi del calci, en regular l'activitat osteoclàstica (MACKIE, 2003). Hi ha certes malalties òssies associades a la funció o disfunció de l'OB, com l'osteoporosi. Els marcadors fenotípics de l'aparició de l'OB són principalment la seva proliferació i diferenciació i, secundàriament, la mineralització dels nòduls ossis (PAN et al., 2005). OPG i RANKL són membres de la família de citocines del factor de necrosi tumoral (TNF) i són les proteïnes derivades de l'OB crucials per a la regulació i el manteniment de la massa òssia (HUMPHREY et al., 2006; REINHOLZ et al., 2002). RANKL regula la diferenciació, l'activació i la supervivència dels osteoclasts. RANKL també pot augmentar la reabsorció òssia mitjançant la interacció amb el seu receptor a la membrana osteoclàstica (SODEK et al., 2000). L'OPG és el receptor señu del RANKL i impedeix que RANKL s'uneixi al seu receptor (RANK). La relació RANK/RANKL/OPG controla l'equilibri entre la formació i la reabsorció òssia, mitjançant la regulació de les activitats OB i osteoclasts (SODEK et al., 2000; HUMPHREY et al., 2006; MAZZIOTI et al., 2012). En conseqüència, es podria concloure que una disminució de la relació OPG/RANKL pot induir la reabsorció òssia augmentant l'activació dels osteoclasts.

En aquest estudi, tots els tractaments amb preparats herbàcies de Cistanche van augmentar l'expressió del gen d'OPG i RANKL a les 72 hores, especialment a les concentracions de 5×10-2 mg/mL i 5×10-3 mg/mL, que van ser significativament diferents en comparació amb els cultius control.

En canvi, l'expressió d'OPG es va reduir significativament després de 24 i 48 hores de cultiu amb extractes de Cistanche. L'expressió de la relació OPG/RANKL es va reduir significativament quan els OB es van tractar amb Cistanche durant 24 hores i 48 hores. A més, l'extracte de Cistanche no va tenir cap efecte significatiu sobre els cultius OB després de 72 hores de tractament. Presentem la hipòtesi que els extractes líquids de Cistanche poden millorar l'activació dels osteoclasts després de 24 hores i 48 hores mitjançant l'expressió OPG/RANKL regulada, però poden no tenir cap efecte sobre l'activació dels osteoclasts després de 72 hores. L'OPN té diverses diversitats funcionals en la formació i remodelació òssia relacionades amb els papers fonamentals de l'OPN en la defensa de l'hoste i la reparació dels teixits. El paper principal de l'OPN sembla ser la regulació de la retroalimentació negativa a nivell sistèmic, la promoció de l'adhesió de cèl·lules OB, la inducció d'esdeveniments de calcificació primerencs i també el control de la mida i la forma dels cristalls minerals (SODEK et al., 2000). A més, s'ha confirmat que l'OPN pot representar una proteïna pont, augmentar la rigidesa arterial durant la inflamació i, en conseqüència, provocar danys articulars i augmentar el risc cardiovascular en pacients amb artritis reumatoide (BAZZICHI et al., 2009).

En el nostre estudi, hem demostrat que un extracte líquid de Cistanche va regular a la baixa l'expressió d'OPN. La tendència de disminució de les concentracions d'OPN en els cultius OB en comparació amb els cultius control observats a les 24 hores i les 48 hores de cultiu, i els nivells significativament més baixos registrats a les 72 hores, suggereix que Cistanche pot millorar la formació òssia, tal com va demostrar l'experiment in vitro.

L'exposició in vitro de cultius OB a Cistanche va promoure significativament les expressions gèniques d'OPG i RANKL després de 72 hores, va reduir l'expressió gènica d'OPG/RANKL després de 24 hores i 48 hores i va disminuir l'expressió d'OPN després de 72 hores de cultiu.

ElHerba de Cistanches'utilitza sempre com a recepta que consisteix en múltiples herbes xineses, per tant, l'eficàcia clínica de Cistanche utilitzada en aquest estudi i els components de l'extracte líquid són complexos i encara no estan clars. Els resultats del nostre estudi demostren que l'extracte de Cistanche afecta l'expressió OPG i RANKL quan s'aplica a OB de rata en cultiu cel·lular, però el nivell d'expressió varia, depenent de la concentració d'extractes de Cistanche i de la durada del cultiu. La concentració adequada dels extractes líquids de Cistanche deserticola, en combinació amb la durada adequada d'exposició als OB de rata, pot mantenir l'equilibri de la formació i la reabsorció òssia durant el metabolisme ossi.

Es necessiten més investigacions per tal de millorar el nostre coneixement sobre els ingredients bioactius de Cistanche i les seves concentracions en preparats, perquè siguin validats com a moduladors de citocines per a la restauració i reparació òssia.

Suplement de cistanche: prevenir les pèrdues òssies

Referències

BAZZICHI, L., L. GHIADONI, A. ROSSI, M. BERNARDINI, M. LANZA, F. DE FEO, C. GIACOMELLI, I. MENCARONI, K. RAIMO, M. ROSSI, AM MAZZONE, S. TADDEI, S. BOMBARDIERI (2009): L'osteopontina s'associa amb un augment de la rigidesa arterial en l'artritis reumatoide. Mol. Med. 15, 402-406.

GIUSTINA, A., G. MAZZIOTTI, E. CANALIS (2008): Growth hormone, insulin-like growth factors, and the skeleton. Endocr. Rev. 29, 535-559.

HUMPHREY, EL, JH WILLIAMS, MW DAVIE, MJ MARSHALL (2006): Efectes dels glucocorticoides dissociats sobre OPG i RANKL en cèl·lules osteoblàstiques. Os 38, 652-661.

HUNG, TY, TL CHEN, MH Liao, WP HO, DZ LIU, WC CHUANG, RM CHEN(2010): Drynaria fortunei J. Sm. promou la maduració dels osteoblasts induint l'expressió gènica relacionada amb la diferenciació i protegint contra els insults apoptòtics induïts per l'estrès oxidatiu. J. Etnofarmacol. 131, 70-77.

JIANG, Y., PF TU (2009): Anàlisi de constituents químics en espècies de Cistanche. J. Cromatogr. A. 1216, 1970-1979.

LI, Y., Y. SONG, H. ZHANG (2010): Avenços en la investigació de components químics i activitat medicinal de cistanche. Recursos de plantes silvestres xineses 29, 7-11.

LIANG, H., F. YU, Z. TONG, Z. HUANG (2011): Efecte de l'extracte aquós de Cistanches Herba sobre la pèrdua òssia en rata ovariectomitzada. Int. J. Mol. Ciència. 12, 5060-5069.

LINKHART, TA, S. MOHAN, DJ BAYLINK (1996): Factors de creixement per al creixement i reparació òssia: IGF, TGF beta i BMP. Os 19, S1-S12.

MACKIE, EJ (2003): Osteoblasts: rols nous en l'orquestració de l'arquitectura esquelètica. Int. J. Biochem. Biol cel·lular. 35, 1301-1305.

MAZZIOTTI, G., J. BILEZIKIAN, E. CANALIS, D. COCCHI, A. GIUSTINA (2012): New understanding and treatments for osteoporosis. Endocrí 41, 58-69.

NAYAK, S., MS ROBERTS, SL GREENSPAN (2012): Impacte del cost de l'alendronat genèric en el cost-efectivitat del cribratge i tractament de l'osteoporosi. PLoS ONE 7(3): e32879. doi:10.1371/journal.pone.0032879.

PAN, W., LD QUARLES, LH SONG, YH YU, C. JIAO, HB TANG, CH JIANG, H.

W. Deng, YJ LI, HH ZHOU, ZS XIAO (2005): La genisteïna estimula la diferenciació osteoblàstica mitjançant NO/cGMP en el cultiu de medul·la òssia. J. Cell Biochem. 94, 307-316.

PARFITT, AM (2000): El mecanisme d'acoblament: un paper per a la vasculatura. Os 26, 319-323. REINHOLZ, MM, SJ ITURRIA, JN INGLE, PC ROCHE (2002): Gen diferencial

expressió de membres de la família TGF- i osteopontina en l'anàlisi del teixit tumoral de mama mitjançant PCR quantitativa en temps real. Càncer de mama Res. Tracta. 74, 255-269.

SEEMAN, E. (2008): Qualitat òssia: la base material i estructural de la resistència òssia. J. Bone Miner. Metab. 26, 1-8.

SEEMAN, E., PD DELMAS (2006): Qualitat òssia: la base material i estructural de la resistència i fragilitat dels ossos. N. Anglès. J. Med. 354, 2250-2261.SILVERMAN, SL (2010): Teràpies d'osteoporosi: evidència de bases de dades d'assistència sanitària i estudis observacionals de població. Calcif. Teixit Int. 87, 375-384.

SODEK, J., B. GANSS, MD MCKEE (2000): Osteopontin. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11, 279- 303.