Els glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa indueixen l'apoptosi a les cèl·lules Eca-109 mitjançant la via dependent dels mitocondris

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG i JINYAO LI

Resum

Cistanche tubulosaté diverses funcions biològiques. En el present estudi, es va investigar l'efecte antitumoral dels glucòsids feniletanoides solubles en aigua de C. tubulosa (CTPG-W) sobre el càncer d'esòfag. Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb CTPG-W i es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant un assaig MTT. L'apoptosi, el cicle cel·lular, el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) i les espècies reactives d'oxigen es van analitzar mitjançant citometria de flux. Els nivells de proteïnes a les vies apoptòtiques es van detectar mitjançant l'anàlisi de western blot. Es va determinar que CTPG-W va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular. Després del tractament amb CTPG-W, el Δψm d'Eca-109 es va reduir notablement, cosa que s'associa amb els nivells augmentats de limfoma de cèl·lules B-2 (Bcl-2) associats a X i nivells regulats a la baixa de Bcl-2. En conseqüència, es van augmentar els nivells de citocrom c i c-Jun NH2-quinasa terminal, la qual cosa va augmentar els nivells de polimerasa escindida (ADP-ribosa) i de caspasa escindida-3, {{18} } i -9, però no caspasa-8. En conseqüència, els nivells d'espècies reactives d'oxigen a les cèl·lules Eca-109 van demostrar canvis notables. Aquests resultats van indicar que CTPG-W va induir l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 a través d'una via dependent dels mitocondris.

Introducció

El càncer d'esòfag és un dels tipus de càncer més freqüents amb l'onzena taxa de morbiditat més alta i la sisena taxa de mortalitat més alta a nivell mundial i va causar ~439,000 mortalitats el 2015 (1). La incidència del càncer d'esòfag varia notablement entre les diferents regions, amb l'Àsia oriental i l'Àfrica oriental i meridional amb les taxes d'incidència més altes i l'Àfrica occidental amb les taxes més baixes el 2012 (1,2). A la Xina, els casos i mortalitats estimades per càncer d'esòfag van ser de 477,000 i 375,000, respectivament, el 2015 (3). Tot i que la taxa de morbiditat del càncer d'esòfag ha disminuït als països d'índex sociodemogràfic mitjà i mitjà-alt entre 2005 i 2015, la taxa de mortalitat continua sent alta a causa del mal pronòstic (1,4). La combinació de la resecció quirúrgica amb quimioteràpia o radioteràpia s'ha utilitzat per tractar el càncer d'esòfag, però, s'ha informat que entre 2003 i 2014 la taxa de supervivència 5-any es va mantenir.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">

La medicina tradicional xinesa a base d'herbes (CHM) s'ha utilitzat per tractar diversos tipus de càncer, inclòs el càncer de pulmó de cèl·lules no petites (6), el càncer colorectal (7), el carcinoma hepatocel·lular (8). Recentment, els assaigs clínics van informar que la combinació de CHM amb quimioteràpia o radioteràpia no només va demostrar una sèrie de beneficis sobre la qualitat de vida i alleujar els efectes secundaris induïts per la quimioteràpia o la radioteràpia (9,10), sinó que també va millorar la taxa de supervivència dels pacients. amb càncer de pulmó, fetge, gàstric, colorrectal, nasofarínge o cervical no microcícola (9). Tanmateix, hi ha proves contradictòries sobre l'eficàcia del tractament amb CHM en el càncer d'esòfag (10,11). Nombrosos estudis van determinar que una sèrie de medicaments o components a base d'herbes podrien inhibir el creixement de cèl·lules canceroses d'esòfag in vitro i in vivo, com Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt i Fagopyrum. Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (un nou diterpenoide ent-kaurene) (19), Qigesan (20) i decocció Tonglian (21). Cistanche és un tipus de CHM i exerceix diverses funcions biològiques, com ara antioxidació, antiinflamació i neuroprotecció (22,23). El nostre estudi anterior ho va demostrarGlucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG) podria suprimir el creixement de cèl·lules de melanoma B16-F10 in vitro i in vivo (24). Tanmateix, la poca solubilitat en aigua del CTPG utilitzat anteriorment limita el desenvolupament del fàrmac (24). Per tant, es va utilitzar CTPG soluble en aigua (CTPG-W) i es va investigar l'efecte antitumoral sobre les cèl·lules canceroses d'esòfag (Eca-109). Es va determinar que CTPG-W podria inhibir de manera dependent de la dosi la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris.

Materials i mètodes Animals.

Les femelles de ratolins C57BL/6 (6-8 setmanes, ~ 25 g) es van comprar al Centre d'Investigació d'Animals de Laboratori de Pequín (Beijing, Xina) i es van allotjar a la temperatura controlada (25˚C), amb cicle de llum (12/ 12) Instal·lació d'animals de la Universitat de Xinjiang (Urumqi, Xina). Tots els animals van rebre aigua i menjar lliures de patògens.

Línia cel·lular i cultiu. La línia cel·lular de carcinoma d'esòfag humà (Eca-109) va ser conservada pel Laboratori clau de recursos biològics i enginyeria genètica de Xinjiang (Col·legi de Ciències de la Vida i Tecnologia, Universitat de Xinjiang, Urumqi, Xina) i es va cultivar a RPMI{{1} } mitjà (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví inactivat per calor (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Xina), 1% L -glutamina (100 mM), 100 U/ml de penicil·lina i 100 µg/ml d'estreptomicina a 37˚C en una atmosfera humidificada que conté un 5% de CO2.

Cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC). CTPG-W (núm. cat. SGJG20170410) es va comprar a Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Xangai, Xina). Els principals compostos de CTPG es van qualificar i quantificar per HPLC segons el nostre estudi anterior (24). Breument, es va realitzar HPLC en una columna ZORBAX SB-C18 (250x4,6 mm; 5 µm) a 30˚C i es va eluir amb una solució d'àcid fòrmic al 0,2 per cent i un gradient de metanol a partir del 23 per cent, ja que s'hi va afegir 1 ml cada min. durant 45 min fins arribar al 31 per cent. Es va injectar un total de 10 µl de mostra i es va detectar a 330 nm. L'estàndard d'equinacòsid es va comprar a Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Xangai, Xina) i l'estàndard d'acteòsid es va comprar a Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya). Els estàndards es van utilitzar per analitzar els components de CTPG-W.

assaig MTT. La proliferació cel·lular es va mesurar amb un assaig MTT. Les cèl·lules Eca{{{0}} es van inocular en 96-plaques de pous a una densitat de 5x1{03 cèl·lules en 1{00 µl de RPMI{{5 }} mitjà/pou i cultivat a 37˚C durant 24 h, després tractat amb diferents concentracions (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W o 0,4 per cent de sulfòxid de dimetil (DMSO) durant 24, 48 i 72 h. Es va utilitzar DMSO com a control de dissolvent (800 µg/ml CTPG-W que contenia un 0,4 per cent de DMSO). Es va utilitzar cisplatina (20 µg/ml) com a control positiu. Posteriorment, el sobrenedant es va descartar després de la centrifugació a 225 xg durant 5 min a temperatura ambient i es va afegir 100 µl de solució MTT (0, 5 mg/ml en medi RPMI-1640 sense FBS) a cada pou i es va incubar a 37 °C. durant 3 h. Els cristalls de formazà formats es van dissoldre en 200 µl de DMSO. Els valors de densitat òptica (DO) es van mesurar a una longitud d'ona de 490 nm mitjançant un lector de microplaques 96-pous (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). La viabilitat cel·lular relativa es va calcular d'acord amb la fórmula: viabilitat cel·lular (percentatge)=(tractat amb OD/no tractat)x100 per cent . La morfologia de les cèl·lules Eca-109 es va observar amb un microscopi de fluorescència invertida (ampliació, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tòquio, Japó).

Per a la proliferació d'esplenòcits, es van sacrificar ratolins C57BL/6 per luxació cervical i es van aïllar la melsa. Es va fer la suspensió unicel·lular i es van sembrar esplenòcits en plaques de 96-pous a una densitat de 1x105 cèl·lules/pou en 100 µl de medi RPMI-1640 i després es van tractar amb diferents concentracions (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W durant 24, 48 i 72 h a 37˚C amb un 5% de CO2. La proliferació d'esplenòcits es va mesurar mitjançant un assaig MTT, segons el protocol esmentat. Índex estimulant=ODtractat/ODnotractat.

Mesura de l'apoptosi i del cicle cel·lular. Les cèl·lules Eca{{{0}} es van cultivar en plats de 6{0 mm a una densitat de 2,5x1{05 cèl·lules/plat durant 24 h i es van tractar amb diferents concentracions ({{31} }, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W o 0,4 per cent de DMSO durant 24 h a 37 °C amb un 5 per cent de CO2. Les cèl·lules es van recollir i es van tacar amb un kit de detecció d'apoptosi d'isotiocianat de fluoresceïna Annexin V (FITC)/iodur de propidi (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Xangai, Xina), segons els protocols del fabricant. Les mostres es van recollir mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) i es van analitzar per FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EUA). Per analitzar l'efecte de CTPG-W en el cicle cel·lular, es van sembrar cèl·lules Eca-109 2,5x105 en plats de cultiu de 60 mm i es van tractar amb CTPG-W (0, 100, 200 i 400 µg/ml) o 0,4. per cent de DMSO durant 24 h a 37 °C amb un 5 per cent de CO2. Totes les cèl·lules es van collir i es van rentar dues vegades amb PBS gelat (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), després es van fixar en etanol fred al 70 per cent a 4 °C durant 30 min. Després de rentar dues vegades amb PBS gelat, les cèl·lules es van tornar a suspendre en 300 µl de tampó de tinció PI/RNasa (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) durant 10 min a temperatura ambient. La distribució del cicle cel·lular es va analitzar amb el programari ModFit LT 3.0 mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur).

Anàlisi del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) i les espècies reactives d'oxigen (ROS). Per analitzar el Δψm, les cèl·lules Eca{{0}} es van tractar amb CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) o 0,4 per cent de DMSO durant 24 h a 37˚C amb un 5% de CO2, i tenyit amb el kit d'assaig de potencial de membrana mitocondrial amb JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Xangai, Xina), segons el protocol del fabricant, durant 20 min a 37˚C . Després de rentar dues vegades amb tampó de rentat JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), les mostres es van tornar a suspendre amb 300 µl de tampó de rentat JC-1 i es van analitzar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur). La fluorescència del colorant JC-1 a les cèl·lules Eca-109 també es va observar amb un microscopi de fluorescència invertida (ampliació, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Per a l'anàlisi de ROS, les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) durant 2, 4, 6, 12 i 24 h i es van tacar amb espècies reactives d'oxigen Kit d'assaig (Beyotime Institute of Biotechnology), segons el protocol del fabricant, durant 20 min a 37˚C. Després del rentat tres vegades amb PBS gelat, es van recollir mostres mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur) i es van analitzar amb el programari FlowJo 7.6.

Activitat d'eliminació de radicals 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). L'activitat d'eliminació de radicals lliures de CTPG-W es va determinar amb un assaig de radicals lliures DPPH segons el protocol publicat amb una modificació menor, ja que el metanol es va substituir per etanol per dissoldre el DPPH (25, 26). Per a mesures en estat estacionari, es van barrejar 150 µl de DPPH (100 mmol/l) en etanol amb diferents concentracions de CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 i 600 µg/ml) en 50 µl de PBS i es va incubar a la foscor durant 30 min a temperatura ambient. L'absorbància a 517 nm es va detectar en presència i absència de CTPG-W. Es van utilitzar un total de 50 µl de vitamina C com a control positiu. L'activitat d'eliminació de radicals DPPH es va calcular mitjançant la fórmula: Scavenging (per cent)=[{1-(A sample-Ablank)/A0] x100, on Ablank és l'absorbància del control (sense DPPH), Una mostra és l'absorbància de la mostra i A0 és l'absorbància de PBS amb DPPH.

Anàlisi Western blot. Les cèl·lules Eca{{0}} es van tractar amb CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) o 0,4 per cent de DMSO durant 24 h a 37 °C amb un 5 per cent de CO2. El següent rentat dues vegades amb PBS, les cèl·lules es van lisar en tampó de lisi d'assaig de radioimmunoprecipitació (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Xina) durant 20 minuts sobre gel. Després de la centrifugació a 10,000 xg durant 10 min a 4˚C, es van recollir els sobrenedants i es van detectar les concentracions de proteïnes amb un kit d'àcid bicinconínic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) segons els protocols del fabricant. L'anàlisi de Western blot es va realitzar segons la nostra descripció anterior (24). Els anticossos contra caspasa-7 (núm. cat. D120077), caspasa-8 (núm. cat. D155240), caspasa-9 (núm. cat. D220078), limfoma de cèl·lules B{{ {24}} (Bcl-2) associat a X (Bax) (núm. cat. D220073) i Bcl-2 (núm. cat. D260117) i peroxidasa de rave picant anti-IgG (HRP) ) (núm. cat. D111050) i IgG-HRP anti-conill (núm. cat. D110058) es van comprar a BBI Life Sciences (Xangai, Xina). Els anticossos contra la caspasa-3 (núm. cat. E-AB-10050) i la caspasa activa-3 (núm. cat. E-AB{-22115) es van comprar a Elabscience ( Wuhan, Xina). Altres anticossos contra la caspasa-7 (cat. núm. 9492), poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (cat. núm. 9542), citocrom c (cat. núm. AC909), c-Jun NH{ {48}}La quinasa terminal (JNK) (núm. cat. 9252S) i l'actina (núm. cat. 58169) es van obtenir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA). Tots els anticossos primaris i secundaris es van diluir a 1:1,000. Els anticossos primaris es van incubar a 4 °C durant la nit i els anticossos secundaris es van incubar a 37 °C durant 1 h.

Les proteïnes diana es van detectar mitjançant un kit d'assaig de quimioluminescència millorat (Beyotime Institute of Biotechnology), segons el protocol del fabricant.

Anàlisi estadística. La significació estadística es va calcular mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància amb la prova post hoc de Tukey i els resultats es van analitzar mitjançant el programari GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA) entre els grups de tractament i control. Totes les dades es van presentar com a mitjana ± desviació estàndard. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Glucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG)

Resultats

CTPG-W suprimeix el creixement de cèl·lules Eca-109. Els components de CTPG-W es van qualificar i quantificar per HPLC (Fig. 1), que es van comparar amb els estàndards d'echinacòsid i acteòside. Segons els temps de retenció màxims i les zones màximes, CTPG-W contenia un 39,16 per cent d'echinacòsid i un 2,44 per cent d'acteòsid. En primer lloc, es va determinar l'efecte de CTPG-W sobre la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 amb un assaig MTT. CTPG-W es va dissoldre en DMSO a 200 mg/ml i es va diluir amb un medi RPMI-1640 que contenia un 10% de FBS inactivat per calor fins a les concentracions indicades. Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb CTPG-W i es va analitzar la viabilitat cel·lular amb un assaig MTT en els punts de temps indicats. El tractament amb CTPG-W va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 de manera dependent de la dosi i del temps (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">

CTPG-W indueix apoptosi a les cèl·lules Eca-109. Per investigar si CTPG-W va suprimir el creixement de cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció d'apoptosi o necrosi, les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W. Després de 24 h, es van detectar l'apoptosi i la necrosi de les cèl·lules Eca-109 amb la tinció d'Annexina V/PI. Tal com es mostra a la figura 3A, les cèl·lules de l'annexina V-/PI més es van tancar com a cèl·lules necròtiques, i les cèl·lules de l'annexina V més / PI més i l'annexina V més / PI- es van tancar com a cèl·lules apoptòtiques. CTPG-W va induir principalment l'apoptosi de les cèl·lules Eca{10}} de manera dependent de la dosi, tot i que les cèl·lules Eca-109 necròtiques també van augmentar significativament amb el tractament de 600 i 800 µg/ml de CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">

CTPG-W indueix l'aturada del cicle cel·lular a la fase S a les cèl·lules Eca-109. La alteració del cicle cel·lular del càncer suprimirà el creixement cel·lular i promourà l'apoptosi (27). La distribució del cicle cel·lular a les cèl·lules Eca-109 es va detectar amb una tinció de PI després del tractament CTPG-W durant 24 h. Es va observar que les cèl·lules de la fase S van augmentar i les cèl·lules de les fases G0/G1 van indicar una disminució significativa general amb el tractament CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">

CTPG-W disminueix Δψm i indueix l'alliberament del citocrom c. L'apoptosi es pot induir per una via dependent dels mitocondris (28,29). Els membres pro i anti-apoptòtics de la família de proteïnes BCL-2 tenen un paper important en la regulació de la integritat de la membrana mitocondrial (30,31). Després del tractament CTPG-W durant 24 h, es va avaluar el Δψm mitjançant la tinció JC-1. L'agregat JC-1 (fluorescència vermella detectada a FL-2) es desintegrarà en monòmer (fluorescència verda detectada a FL-1) quan Δψm es redueix (32). Tal com es mostra a la figura 5A, les freqüències de les cèl·lules FL-1 més FL{-2-/plus van augmentar significativament de manera dependent de la dosi, cosa que indica que el Δψm de les cèl·lules Eca-109 va disminuir. Els canvis de fluorescència a les cèl·lules Eca-109 també es van observar amb un microscopi de fluorescència invertida (Fig. 5B). Amb l'augment de les concentracions de CTPG-W, la fluorescència vermella va disminuir i la fluorescència verda va augmentar, cosa que és coherent amb les dades de la citometria de flux. També es va observar que el nivell de citocrom c al citosol va augmentar notablement (Fig. 5C), que és el resultat d'una reducció de Δψm. Això reforça la conclusió extreta de l'augment del recompte de cèl·lules FL-1 més FL{-2-/més que Δψm va disminuir com a resultat del tractament CTPG-W. S'ha informat que la JNK pot regular l'activació de la família de proteïnes BCL-2 provocant l'alliberament del citocrom c (33-35). També es va determinar que el nivell de JNK es va augmentar notablement després del tractament amb CTPG-W (Fig. 5C). Els resultats van indicar que CTPG-W pot induir l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 mitjançant una via dependent dels mitocondris.

L'efecte de CTPG-W sobre la generació intracel·lular de ROS. ROS podria reduir Δψm per induir l'apoptosi (36). Per investigar si CTPG-W pot augmentar la producció de ROS, les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W. Les cèl·lules es van recollir als punts de temps indicats i es van tacar amb DCFH-DA. La producció de ROS intracel·lular a les cèl·lules Eca-109 es va determinar mitjançant citometria de flux. Tal com es mostra a la figura 6A, 800 µg/ml de CTPG-W van augmentar significativament la producció de ROS a partir de 2-6 h i va disminuir a partir de 12-24 h. A més, 400 µg/ml de CTPG-W van augmentar significativament la producció de ROS a partir de 12-24 h. A més, 200 µg/ml de CTPG-W no van alterar notablement la producció de ROS. Els canvis dinàmics de la producció de ROS poden estar associats amb l'apoptosi de cèl·lules Eca-109. També es va determinar que CTPG-W tenia activitat d'eliminació de radicals lliures (Fig. 6B), que es pot associar amb la disminució de la producció de ROS a les cèl·lules Eca-109 tractades amb 800 µg/ml de CTPG-W després de 12 h.

CTPG-W regula l'activitat de la caspasa-3, la caspasa-7, la caspasa-9 i el PARP. L'alliberament del citocrom c a causa de la reducció de Δψm podria activar les proteases caspases per induir l'apoptosi (29,30,37). Després del tractament amb CTPG-W durant 24 h, es va detectar l'activació de la caspasa -3, 7, 8, 9 i PARP mitjançant l'anàlisi de western blot. En comparació amb el control, els nivells de caspasa clivada-9, caspasa clivada-7, caspasa clivada-3 i PARP clivada, però no els nivells de caspasa clivada{{ 20}}, van ser regulats pel tractament amb CTPG de manera dependent de la dosi (Fig. 7). Aquests resultats van indicar que CTPG-W va reduir Δψm i va promoure l'alliberament del citocrom c per activar les caspases que indueixen l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109.

Extracte de Cistanche tubulosa

Discussió

La CHM tradicional podria induir l'apoptosi de les cèl·lules canceroses d'esòfag a través de diferents vies, com ara el receptor de mort extrínsec, les vies d'estrès del reticle endoplasmàtic i mitocondrial intrínsec (29). El nostre estudi anterior va demostrar que el CTPG, com a component principal de C. tubulosa, va inhibir el creixement de cèl·lules B16-F1{0 del melanoma mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris (24). En el present estudi, es va investigar l'efecte antitumoral de CTPG-W sobre les cèl·lules Eca-109 i es va determinar que CTPG-W va suprimir el creixement de les cèl·lules Eca{-109, va induir l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular, va reduir Δψm, va augmentar l'alliberament del citocrom c i va activar les caspases. CTPG i CTPG-W podrien induir l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular a les cèl·lules canceroses. No obstant això, els mecanismes precisos són diferents a causa dels diferents components de CTPG (26,64 per cent d'echinacòsid, 10,19 per cent d'acteòsid i 1,71 per cent d'isoacteòsid) i CTPG-W (39,16 per cent d'echinacòsid i 2,44 per cent d'acteòsid). CTPG va detenir cèl·lules B16-F10 a les fases G0/G1, però CTPG-W va detenir cèl·lules Eca-109 a la fase S (24). La producció de ROS va augmentar en funció de la dosi per CTPG, però va indicar un canvi de manera dependent del temps per una alta dosi de CTPG-W, que va augmentar significativament al començament del tractament amb CTPG-W (2-6 h) i va disminuir significativament després de 12 h, en comparació amb el control. Una possible raó és que el component principal de CTPG-W és l'echinacòsid. Diversos estudis van informar que l'equinacòsid podria inhibir la producció de ROS i l'apoptosi induïda per ROS per exercir els seus efectes neuroprotectors i anti-envelliment (38-40). De la mateixa manera, en el present estudi es va observar l'activitat d'eliminació de radicals lliures. Per tant, es va especular que alguns components, inclosos el verbascòsid, iso-verbascòsid i salidroside en una dosi elevada de CTPG-W podrien induir immediatament la generació de ROS per provocar l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 (41, 42), i després ROS va ser eliminada per echinacòsid. Un altre motiu possible de les diferències en la producció de ROS per CTPG i CTPG-W és que es van utilitzar diferents línies cel·lulars en aquest estudi i en un estudi anterior (24). Dong et al (43) van informar que l'echinacòsid podria induir l'apoptosi de les cèl·lules de càncer colorectal humans SW480 mitjançant la generació de danys oxidatius a l'ADN sense augmentar els nivells de ROS.

El tractament amb CTPG-W va reduir Δψm i va provocar l'alliberament del citocrom c, que afavoreix la divisió de la caspasa -9 (28). De manera consistent, els nivells de caspasa escindida-9 es van regular amb el tractament CTPG-W. Posteriorment, la caspasa activa-9 pot activar la caspasa-3 per induir l'apoptosi (44). Els nivells de caspasa escindida-3 també es van regular amb el tractament CTPG-W. Tanmateix, la caspasa -8 no va ser activada per CTPG-W, cosa que indica que la via extrínseca del receptor de la mort no estava implicada en l'apoptosi induïda per CTPG-W. Aquestes observacions indiquen que CTPG-W indueix l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 mitjançant l'activació d'una via dependent dels mitocondris.

PARP té un paper important en l'estabilitat genòmica i es pot escindir per les caspases actives, especialment la caspasa-3 i -7 (45). Es va determinar que el tractament amb CTPG-W activava la caspasa-3 i -7, que poden escindir PARP per inhibir la reparació de l'ADN i provocar l'apoptosi.

CTPG-W també suprimeix depenent de la dosi i del temps el creixement de cèl·lules BEL-7404 de carcinoma hepatocel·lular humà (dades no publicades). Tot i que CTPG-W inhibeix el creixement de cèl·lules Eca-109 i BEL{-7404, afavoreix la proliferació d'esplenòcits, que pot ser degut al contingut de polisacàrids (~ 50 per cent) a CTPG-W (46). ). De la mateixa manera, diversos estudis han informat que els polisacàrids poden promoure la proliferació d'esplenòcits (46-49). En el model de ratolí, es va determinar que CTPG-W va augmentar significativament l'índex de melsa, en comparació amb el grup control, però no va afectar el pes corporal i els altres índexs d'òrgans, inclosos el cor, el fetge, el ronyó i el pulmó (dades no publicades), indicant que CTPG-W no té cap efecte citotòxic sobre les cèl·lules normals.

Col·lectivament, les dades van indicar que CTPG-W inhibeix el creixement de cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris.

Beneficis del cistanche: anti-apoptosi

Agraïments

Els autors volen donar les gràcies al Dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) per polir el manuscrit.

Finançament

Aquest estudi va comptar amb el suport del 13è Pla quinquennal per al projecte de licitació de biologia de la disciplina clau (subvenció núm. 17SDKD0202), la Universitat Normal de Xinjiang i el laboratori clau d'aplicació i regulació de la biodiversitat del medi ambient especial a Xinjiang (subvenció núm. XJTSWZ-2017-04) a JL i la subvenció de la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (subvenció núm. 31760260) a XW.

Disponibilitat de dades i materials

Les dades i els materials utilitzats i analitzats durant el present estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.

Aportacions dels autors

CF, AA, YY i QC van realitzar els experiments. LX, JLv i XW van analitzar les dades i les figures preparades. JinyuL i JinyaoL van dissenyar el projecte i van escriure el manuscrit.

Aprovació ètica i consentiment per participar

Tots els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica dels Experiments amb Animals del Laboratori Clau de Recursos Biològics i Enginyeria Genètica de Xinjiang (aprovació, núm. BRGE-AE001; Universitat de Xinjiang).

Consentiment del pacient per a la publicació

No aplicable.

Interessos competitius

Els autors declaren que no tenen interessos en competència.

Referències

1. Wu CR, Lin HC i Su MH: reversió per aquosaextractes de Cistanche tubulosade dèficits de comportament en el model de rata semblant a la malaltia d'Alzheimer: rellevància per a la deposició d'amiloide i la funció del neurotransmissor central. BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.

2. Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J i Zhang F:Glicòsids feniletanoides de Cistanche tubulosainhibeix el creixement de cèl·lules B16-F10 tant in vitro com in vivo mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant la via dependent dels mitocondris. J Cancer 7: 1877-1887, 2016.

3. Brand-Williams W, Culver ME i Berset C: Ús d'un mètode de radicals lliures per avaluar l'activitat antioxidant. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.

   ---