Efectes dels gliòsids de Cistanche sobre l'aprenentatge de la cognició i la plasticitat sinàptica en rates model de privació del son

RESUM

Objectiu:Explorar si els glucòsids de cistanche poden millorar l'aprenentatge i la funció cognitiva de les rates model de privació del son mitjançant la regulació de la plasticitat sinàptica.

Mètodes: Cinquanta rates masculines Wistar es van dividir aleatòriament en un grup de control en blanc (Control), grup de control de plataforma (PC), grup model (Model),glucòsids del grup cistanche (GC), i grup estazolam ( Est ). El model de privació del son de rates es va preparar mitjançant un mètode d'entorn aquàtic multiplataforma modificat. El laberint d'aigua de Morris i la prova de camp obert es van utilitzar per detectar la funció cognitiva espacial i els canvis emocionals de les rates. La tinció de Nissl es va utilitzar per observar els canvis en la morfologia i la quantitat de cèl·lules nervioses a lazona CAl de l'hipocamp de rates. Western blot i R'T - PCR es van utilitzar per detectar els nivells d'expressió de sinaptofisina (SY'N), substància densa de membrana postsinàptica 95 (PSD -95) ifactor neurotròfic derivat del cervell (BDNF). 

resultats;Els resultats del laberint d'aigua de Morris van mostrar que, en comparació amb el grup de control, elaprenentatge i capacitat cognitiva de les ratesen el grup Model es va reduir significativament (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasmillora del tractament amb GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the Proteïnes i nivells d'expressió gènica de BDNF, SYN i PSD -95al grup Mlodel es van reduir significativament (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

SUPLEMENTS DE FORMULACIÓ DE CISTANCHE A HERBES PERMILLORA DE L'APRENENTATGE I DE LA FUNCIÓ COGNITIVA

PARAULES CLAUGlucòsids de cistanche; hipocamp; privació del son; Aprenentatge i memòria; Ansietat; Plasticitat sinàptica

Trastorn del son (SD)és atrastorn funcional del son anormalcausada per una sèrie de factors complexos com arainsomni, somni, ifàcil despertar. En els darrers anys,la incidència de SDha anat augmentant progressivament. Estudis relacionats han informat que la SD pot causarmalalties cardiovasculars,disfunció metabòlica,malalties immunitàries, isistema nerviós centralmalalties degeneratives com la malaltia d'Alzheimer [1]. La SD pot causar danys oxidatius a les neurones de l'hipocamp, causar disfunció cognitiva i produir canvis d'humor com ara ansietat i depressió [2]. Cistanche deserticola és un material medicinal preciós que es pot utilitzar tant com a medicina com com a aliment a la Xina. Té els efectes de tonificar el ronyó i reposar el qi, humitejar els intestins afavorir els moviments intestinals i enfortir el yang. L'extracte principal de Cistanche deserticola, glicòsids de Cistanche (GC), té efectes antioxidants, antiapoptòtics, protectors del fetge i neuroprotectors [3]. La nostra investigació anterior va trobar que els GC poden millorar l'aprenentatge i la funció cognitiva dels ratolins SAMP8 jugant un paper antioxidant i antiapoptòtic [4].

Estudis relacionats han demostrat que la disfunció cognitiva causada per SD està estretament relacionada amb la plasticitat sinàptica [5]. Tanmateix, hi ha pocs informes sobre el mecanisme pel qual els GC regulen la plasticitat sinàptica i milloren el deteriorament de l'aprenentatge i la memòria i el declivi cognitiu de les rates induït per la privació del son. Per tant, aquest estudi pretén explorar si els GC afecten la plasticitat sinàptica mitjançant la regulació de l'expressió de marcadors relacionats amb la sinàptica, millorant així l'aprenentatge i la funció cognitiva de les rates amb models de privació del son, i proporcionar noves idees de tractament i plans per als GC per tractar l'aprenentatge i la funció cognitiva. deteriorament causat per trastorns del son.

1 Materials i mètodes

1.1 Animals d'experimentació

Es van comprar rates Wistar mascles d'entre 6 i 8 setmanes, amb un pes de 280 a 300 g, a Beijing Sibeifu, amb una llicència de producció animal [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Tots els animals es van mantenir al Centre d'Experimentació Animal de la Facultat de Medicina de Baotou en les condicions següents: temperatura (24 ± 1) grau, humitat del 50% al 55%, 12 h de llum i 12 h de foscor, i sense restriccions de menjar i aigua. Aquest experiment va ser aprovat pel comitè d'ètica de l'escola [Baoyi Lunshen 2022 núm. (63)].

1. 2 Principals reactius i instruments

Els glucòsids totals de Cistanche deserticola es van comprar a Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (número de lot: KSM20220609011); Les pastilles d'estazolam es van comprar a CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (número de lot: 044220343); El tampó de càrrega de proteïnes (P1015), el tampó de lisi RIPA (R0010), la solució quimioluminiscent (PE0010), etc. es van comprar a Beijing Solebao; La substància de densitat postsinàptica en anticossos 95 (PSD-95) (AB192757) i anticossos de sinaptofisina (SYN) (ab32127) es van comprar a Abcam, USA Company; El factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) (48503-2) i l'actina (52901) es van comprar a SAB Company, EUA; L'anticòs secundari IgG anti-conill de cabra (SA00001-20) es va comprar a Proteintech Company, EUA; La melatonina de rata (MT) i el kit d'investigació científica ELISA (MM-0657R1) es van comprar a Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Talladora de parafina (Leica, Alemanya); microscopi òptic (Leica, Alemanya);

Laberint d'aigua de Morris, caixa de proves de camp obert (Xangai Xinruan); aparell d'electroforesi vertical (Beijing Liuyi Company); agitador de decoloració (Beijing Liuyi Company); sistema d'anàlisi d'imatges de proteïnes (Shanghai Tanon Technology); instrument de PCR quantitatiu de fluorescència (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Mètodes experimentals

1.3.1 Agrupació d'animals i administració de fàrmacs

5 0 rates masculines Wistar es van dividir aleatòriament en grup de control en blanc (grup control), grup de control de plataforma (control de plataforma, grup PC), grup model (grup model), glucòsids totals del grup Cistanche deserticola (grup GC). , 50 mg/kg) i el grup estazolina (grup Est, 0,54 mg/kg), amb 10 rates a cada grup. El grup Control i el grup PC van rebre un 0,9% de solució salina per sonda. Tots els grups van ser sondats a les 7 del matí cada dia després de començar el modelatge, i el sondatge va durar 21 dies.

1.3. 2. Elaboració del model animal de privació del son

El model de privació del son es va establir mitjançant el mètode modificat de l'entorn aquàtic multiplataforma [6]. L'equip experimental era un dipòsit d'aigua de resina de polietilè rectangular de 130 cm × 50 cm × 45 cm. Al dipòsit d'aigua es va col·locar una petita plataforma amb un diàmetre de 5 cm i una alçada de 20 cm. La plataforma del grup PC tenia un diàmetre de 10 cm i una alçada de 20 cm. El dipòsit d'aigua es va omplir d'aigua a una profunditat d'uns 18 cm i la temperatura de l'aigua es va mantenir a (20 ± 1) graus. Una setmana abans de l'inici de l'experiment, les rates es van col·locar a la caixa de privació del son cada dia durant 60 minuts per familiaritzar-se amb l'entorn. Un cop establert el model, excepte el grup Control, les rates de cada grup es van col·locar a la petita plataforma puntualment de 8 a.m. a 8 p.m. cada dia per a la privació del son durant 21 dies consecutius.

Totes les rates tenien accés lliure al menjar i l'aigua i es movien lliurement per la plataforma. El cicle de llum i foscor era de 12 hores cada dia.

1. 3. 3 Experiment del laberint d'aigua de Morris

El laberint d'aigua de Morris es va dividir en 4 zones, plenes d'aigua, i la plataforma es va col·locar al quart quadrant. La superfície de l'aigua estava a uns 2 cm per sobre de la plataforma. Es va afegir melanina comestible de qualitat alimentària a l'aigua i es va mantenir la temperatura de l'aigua a (25 ± 1) graus. (1) Experiment de navegació de posicionament: es va seleccionar el centre de cada zona i les rates es van col·locar suaument a l'aigua. Se'ls permetia explorar lliurement. Es va registrar el temps que van trigar les rates a trobar la plataforma objectiu en 60 segons. Les rates que no van trobar la plataforma van ser guiades a la plataforma i es van quedar durant 20 segons. La formació es va continuar durant 5 dies. (2) Prova d'exploració espacial: el 6è dia, es va retirar la plataforma i es van col·locar les rates a l'aigua des del centre del 2n quadrant contra la paret. Es va registrar el nombre de vegades que les rates van passar per la plataforma en 120 s i el temps que van romandre al quart quadrant.

1. 3. 4 Experiment de camp obert

Es va utilitzar una caixa experimental de 100 cm × 100 cm × 50 cm i la part inferior de la caixa es va dividir en 9 quadrícules. Cada grup de rates es va col·locar a la sala experimental de camp obert amb antelació per adaptar-se a l'entorn interior durant 60 min. Al començament de l'experiment, les rates de prova es van col·locar a cantons fixos de la caixa experimental de camp obert al seu torn, i es van registrar el nombre de temps de parada, la distància de moviment i el temps estàtic de les rates en 5 minuts mitjançant un programari d'anàlisi del comportament. Es va requerir que l'entorn estigués tranquil durant l'experiment i el dispositiu experimental es va netejar amb aigua i alcohol respectivament entre dos experiments per evitar que l'olor de la primera rata afectés el judici de comportament de la següent rata.

1. 3. 5 Assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA)

Detecció de nivells sèrics de MT en rates Les rates van ser anestesiades mitjançant injecció intraperitoneal i es van recollir 5 ml de sang de l'aorta abdominal. Després d'esperar 30 minuts a temperatura ambient, es va centrifugar la sang per obtenir sèrum. Es van afegir 40 μL de diluent de mostra a cada pou, i després es van afegir 10 μL de la mostra a provar. Després de segellar amb una pel·lícula de segellat, la placa es va incubar a 37 graus durant 30 min. Es va rentar 5 vegades, es van afegir 50 μL de solució d'etiquetatge enzimàtic i la placa es va segellar amb una pel·lícula de segellat i es va incubar a 37 graus durant 30 min. Es va rentar 5 vegades, i després es van afegir al seu torn la solució de desenvolupament de color i la solució de finalització de la reacció. El valor OD de cada pou es va mesurar mitjançant un etiquetador enzimàtic a una longitud d'ona de 450 nm.

1. 3. 6 Tinció de Nissl

Es van seleccionar tres rates de cada grup i es va eliminar el teixit cerebral per decapitació i es va fixar amb una solució de polioxietilè al 4%. El teixit es va deshidratar, es va submergir en una solució de cera, es va incrustar i es va tallar mitjançant mètodes convencionals. Les rodanxes es van mantenir amb un gruix de 5 μm, es van esbandir amb PBS, es van tenyir amb 0,1% blau de toluidina durant 0,5 h, diferenciades amb alcohol al 95%, deshidratades amb alcohol 100%, transparentades. amb xilè, i segellat amb goma neutra. Els canvis en la morfologia i el nombre de neurones a la regió CA1 de l'hipocamp de rata es van observar al microscopi i es van recollir imatges.

1. 3. 7 Experiment de Western blot

Es van seleccionar quatre rates de cada grup i l'hipocamp es va aïllar per decapitació. El teixit de l'hipocamp es va barrejar amb un tampó de lisi RIP A en un entorn de bany de gel i el teixit es va centrifugar per obtenir el sobrenedant. La concentració de proteïnes es va detectar pel mètode BCA. Es van afegir 20 ug de proteïna amb tampó de càrrega de proteïnes per a l'electroforesi. Un cop completada l'electroforesi de proteïnes, la membrana es va transferir a un flux constant de 300 mA, es va bloquejar amb llet desnatada en pols al 5%, l'anticossos primari es va incubar a 4 graus durant la nit i l'anticossos secundari es va incubar a temperatura ambient durant 2 h. Després d'utilitzar la solució de desenvolupament de color, les bandes de proteïnes es van analitzar estadísticament mitjançant un sistema d'anàlisi d'imatges de quimioluminescència.

1. 3. 8 Experiment RT-PCR

Es van seleccionar tres rates de cada grup per preparar l'homogeneïtat de teixit de l'hipocamp. L'ARN total del líquid del teixit es va extreure pel mètode Trizol i es va mesurar la concentració. Es va utilitzar un kit de síntesi d'ADNc fastking per a la transcripció inversa i es va realitzar una reacció d'amplificació quantitativa de fluorescència mitjançant un kit quantitatiu de fluorescència per detectar el nivell d'expressió relativa de l'ARNm de proteïnes relacionades amb la sinàptica. Els resultats es van analitzar mitjançant 2-ΔΔCt. Les seqüències de cebador es mostren a la taula 1.

Taula 1 Seqüències d'encebadors RT-PCR

1.4 Mètodes estadístics

Els resultats de les dades que s'ajustaven a la distribució normal es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (x ± s) i es va realitzar una anàlisi estadística mitjançant el programari GraphPad Prism 9.5. Es va utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància per a la comparació entre diverses mostres, i P <{3}},05 va indicar que la diferència era estadísticament significativa.