Millora dels efectes antiangiogènics de la delfinidina quan s'encapsula dins de petites vesícules extracel·lulars Part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:(1) Antecedents: la delfinidina d'antocianina presenta propietats antiangiogèniques tant en models d'angiogènesi in vitro com in vivo. Tanmateix, la delfinidina in vivo s'absorbeix malament, de manera que la seva modesta biodisponibilitat i estabilitat redueixen els seus efectes antiangiogènics. El present treball aprofita les propietats de les petites vesícules extracel·lulars (EV) per millorar tant l'estabilitat com l'eficàcia de la delfinidina. Quan s'encapsula en sEV, la delfinidina inhibeix les diferents etapes de l'angiogènesi a les cèl·lules endotelials aòrtiques humanes (HAoEC).(2) Mètodes: es van produir sEV de cèl·lules dendrítiques immadures i es van carregar amb delfinidina. Es va implementar un mètode basat en UHPLC-HRMS per avaluar els metabòlits de la delfinidina dins dels sEV. L'assaig de proliferació, la producció d'òxid nítric (NO) i l'assaig de Matrigel es van avaluar en HAoEC. delfinidina i sEVs carregats amb delfinidina. La delfinidina carregada amb sEV va augmentar la potència de la delfinidina lliure 2-plegament per a la proliferació endotelial,10-plegada per a la producció de NO endotelial i 100-plegada per a la formació capil·lar. . Així, la delfinidina carregada amb sEV exerceix efectes sobre els diferents passos de l'angiogènesi. (4) Conclusions: els EVs poden considerar-se com un enfocament prometedor per lliurar delfinidina per orientar malalties relacionades amb l'angiogènesi, inclòs el càncer i les patologies associades a l'excés de vascularització.

Feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau: delfinidina; cèl·lules endotelials; angiogènesi; petites vesícules extracel·lulars; càncer; malalties cardiovasculars

1. Introducció

Els polifenols es troben principalment en aliments i begudes d'origen vegetal i proporcionen el gust i el color dels aliments vegetals. A més, els estudis epidemiològics han informat d'una major reducció del risc cardiovascular i del càncer associat a dietes riques en polifenols [1-3.

La delfinidina (2-(3,4,5-tri-hidroxifenil)cromenili-3,5,7-triol) és una antocianina abundantment identificada en verdures i fruites pigmentades, especialment en baies. i raïm negre. Anteriorment, vam informar que la delfinidina posseeix el mateix perfil farmacològic que un extracte total de compostos polifenòlics del vi negre per promoure l'augment de la concentració intracel·lular de calci i l'activació de tirosina cinases [3], donant lloc a la producció d'òxid nítric (NO) endotelial posterior al receptor d'estrògens alfa. (ERo)estimulació [4]. A més, vam informar que la delfinidina via ERO actua com una molècula immunomoduladora i antiinflamatòria que pot alterar la proliferació i diferenciació dels limfòcits T en pacients amb factors de risc cardiovascular [5].

Finalment, vam demostrar que la delfinidina mostra propietats antiangiogèniques, tant en models d'angiogènesi in vitro com in vivo, i redueix el creixement tumoral in vivo del melanoma [6-10]. De fet, la delfinidina inhibeix la proliferació de cèl·lules endotelials mitjançant la implicació de la ciclina D 1- i les vies dependents de la A [6, 7]. També vam informar d'una possible associació entre la inhibició de la biogènesi mitocondrial induïda per VEGF a través de la via Akt per la delfinidina i el seu efecte anti-angiogènic [8]. A més, la delfinidina redueix el creixement tumoral de cèl·lules tumorals de melanoma in vivo actuant específicament sobre la proliferació de cèl·lules endotelials. El mecanisme implica una associació entre la inhibició de la proliferació induïda per VEGF mitjançant la senyalització VEGFR2, MAPK, PI3K i a nivell de transcripció en factors CREB/ATF1, i la inhibició de la phopsfodiesterasa2[9]. El més interessant és que les altes dosis de delfinidina van disminuir la neovascularització en un model in vivo d'angiogènesi desencadenada per isquèmia mitjançant un model de rata de lligadura de l'artèria femoral [10]. En conjunt, aquestes dades mostren que la delfinidina és un compost prometedor per prevenir patologies associades a trastorns cardiovasculars i tumorigènesi.

Tanmateix, la delfinidina és menys potent per induir aquests efectes beneficiosos en comparació amb els extractes de polifenols totals de vi negre, especialment per induir una vasodilatació mediada pel NO depenent de l'endoteli [11]. De fet, la delfinidina és sensible a la llum i estable només a pH<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Una estratègia per superar aquests problemes és l'ús de vesícules extracel·lulars (EV) com a sistema de lliurament de fàrmacs. Recentment hem trobat que els vehicles elèctrics, inclosos els grans i petits (sEVs), són nanoestructures originàries de diferents propietats de compartiments subcel·lulars, superant les limitacions de les nanoformulacions clàssiques. Els sEV disminueixen la inestabilitat i la immunogenicitat, milloren la biodisponibilitat i la selectivitat de l'objectiu [13]. Alguns informes subratllen els efectes protectors dels vehicles elèctrics alliberats per cèl·lules tractades amb polifenols. De fet, els sEV enriquits amb miR-21 de cèl·lules tractades amb curcumina van reduir el creixement i l'angiogènesi de les cèl·lules tumorals, van corregir la permeabilitat endotelial i van disminuir la viabilitat cel·lular de diferents línies cel·lulars de càncer [14]. A més, els sEV enriquits amb miR-16-de cèl·lules tractades amb galat d'epigalocatequina van suprimir el creixement del tumor [15].

Cistanche pot millorar la immunitat

En el present estudi, hem aprofitat les propietats de sEV per millorar tant l'estabilitat com l'eficàcia de la delphinidin. La inhibició de l'angiogènesi induïda amb delfinidina carregada de sEV mitjançant cèl·lules endotelials aòrtiques humanes (HAoEC). També es va determinar el contingut de delfinidina en termes de metabòlits dins d'aquests EV.

2. Materials i Mètodes

2.1.Cultura cel·lular

Els HAoEC (Promocell, Heidelberg, Alemanya) es van cultivar a 37 graus i un 5% de CO2 en medi de creixement de cèl·lules endotelials MV2 (Promocell) suplementat amb un 1% de penicil·lina/estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, França). Les cèl·lules es van tripsinitzar al 70/80 per cent de confluència i es van utilitzar entre els passatges 3 i 6 per a tots els experiments.

La línia de cèl·lules dendrítiques JAWS II es va comprar a la American Type Culture Collection (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, EUA). Les cèl·lules JAWS II es van cultivar a 37 graus i un 5 per cent de CO, en un medi de cultiu complet compost per mitjà essencial mínim alfa (Lonza; Basilea, Suïssa) que contenia ribonucleòsids i desoxiribonucleòsids i es va complementar amb un 20 per cent de sèrum fetal boví (FBS) (Gibco, Life). Tecnologies; Grand Island, NY, EUA), L-glutamina 4 mM (Lonza), piruvat sòdic 1 mM (Lonza), 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina (penicil·lina/-estreptomicina, Sigma-Aldrich) i GM-CSF murí 5ng/mL (Miltenyi Biotec; San Diego, CA, EUA). Les cèl·lules es van tripsinitzar al 70/80 per cent de confluència i es van utilitzar entre els passatges 8 i 16 per a tots els experiments.

2.2.sEVAïllament

Les cèl·lules JAWS II es van sembrar a una densitat de cèl·lules de 5 × 10 graus en un matràs de cultiu cel·lular T175 en un medi de creixement complet i s'han mort de fam a FBS abans de qualsevol aïllament. El medi cel·lular es va centrifugar a 300 × g i 2 000 × g durant 10 min per eliminar les cèl·lules i les restes cel·lulars, respectivament. El sobrenedant resultant es va centrifugar a 20,000x g durant 30 min per excloure els grans EV. El sobrenedant es va centrifugar a 200,000×g (ultracentrífuga Optima MAX-XP i rotor MLA-50, Beckman Coulter, Villepinte, França) durant 2 hores per granular els sEV. A continuació, es van rentar els EVs en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM, pH =7,4) i es van recentrifugar a 200.000 × g durant 2 h. Finalment, es van tornar a suspendre sEVpellets en 1 ml de PBS i es van emmagatzemar a 4 graus fins al seu ús posterior. La quantitat de sEV es va determinar mitjançant el mètode de Lowry, amb l'albúmina sèrica bovina (Sigma-Aldrich) com a estàndard. Els sEV es van utilitzar a 10 ug/mL.

2.3. Càrrega de delfinidina

La delfinidina es va preparar en aigua a pH{{0}} amb {{10}},1 per cent de DMSO per tal d'assolir la concentració d'1{0 ug/mL. Es van afegir els sEV (2 mg) i la solució es va agitar i després es va vortexar durant 10 min. Després de 2 h d'ultracentrifugació a 200,000xg, el pellet obtingut es va reconstituir en 1 ml de DMSO o PBS al 0,1 per cent. Es va mesurar l'absorbància de la delfinidina a 530 nm i es va realitzar una corba estàndard amb diferents concentracions (de 0,1 a 10 ug/mL) de delfinidina lliure. El percentatge d'eficàcia de la càrrega de sEV va ser del 9 per cent, independentment de la concentració de delfinidina utilitzada (dades no mostrades). Així, la quantitat de delfinidina es va ajustar per obtenir la concentració desitjada (0,1 a 5 ug/ml) dins de 10 ug/ml sEVs. Per eliminar la delfinidina lliure, aquestes vesícules es van rentar dues vegades.

2.4. Anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA)

Les mostres de sEV es van diluir en NaCl 0,9 per cent estèril i es va analitzar la distribució de la mida mitjançant el NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Regne Unit). Es van gravar vídeos. El programari NTA va determinar la distribució de mida mitjançant l'equació de Stokes-Enstein.

2.5. Microscòpia electrònica de transmissió

Els sEV es van fixar per primera vegada durant la nit a 4 graus amb un 2,5 per cent de glutaraldehid (LFG Distribution, Lió, França) en 0,1 M PBS. A continuació, els sEV es van rentar dues vegades en PBS mitjançant una centrifugació de 100,000xg durant 70 min. Els sEV es van dipositar a les reixetes de coure durant 2 minuts i es van tacar negativament amb 20 μL d'acetat d'uranil al 5% (diluït en etanol al 50%). ） durant 30 s. A continuació, es van observar les quadrícules amb un microscopi Jeol JEM 1400 (Jeol, Croissy sur Seine, França) que funcionava a 120 keV.

2.6. Determinació dels metabòlits de la delfinidina dins dels sEV

La preparació de la mostra va ser la següent: es van afegir ∶250 μL de metanol (MeOH) a 10ug sEV reconstituïts en PBS i les mostres es van sotmetre a una ultrasònica de 20 min. Es van afegir dos-cents uL de MeOH i les mostres es van centrifugar (10, 000 × g, 10 min, 4 graus) i es van evaporar en un concentrador duo miVac (Genevac Ltd., Ipswich, Regne Unit). L'extracte sec es va reconstituir amb 200 μL d'aigua de grau LC-MS que contenia un 1% d'àcid fòrmic. La mescla es va sotmetre a una segona centrifugació (10,000×g, 5 min, 4 graus) abans de la cromatografia líquida d'ultra alt rendiment acoblada a l'anàlisi d'espectrometria de masses d'alta resolució (UHPLC-HRMS) per analitzar-la. Metabòlits de delfinidina amb mesures precises de massa.

La separació cromatogràfica es va aconseguir amb una columna Kinetex@ 1,7 μm XB C18,150×2,1 mm juntament amb la columna SecurityGard C18 corresponent (Phenomenex). Les fases mòbils consistien en H O al canal A i acetonitril al canal B, tots dos contenen 0,1 per cent d'àcid fòrmic. El gradient d'elució (A∶B, o/ø) va ser el següent∶ mantenir les condicions inicials 95:5 durant 2 minuts, seguit d'un gradient lineal de 95:5 a 0:100 sobre un període de 6 minuts, mantingueu a les 0:100 durant 3 minuts, torneu a les condicions inicials 95:5 i mantingueu aquestes condicions durant 3,5 minuts. Es va utilitzar un cabal constant de 0,300 ml/min; el volum d'injecció era de 10 μL.

L'escaneig complet i els espectres de masses de la SIM dirigits es van adquirir en mode d'ionització positiva, utilitzant una resolució 70,000 Amplada completa a la meitat màxima (FWHM) amb un objectiu de control automàtic de guany (AGC) d'ions 3 × 10 graus i una injecció d'ions màxima temps (IT) de 200 ms. Els experiments MS/MS depenents de dades es van adquirir en el mode dependent de dades de Top5.

Es van controlar els metabòlits reportats a la literatura [16-18]: delfinidina, aldehid, aldehid de floroglucinol, àcid gàlic, calcona, petunidina-3-galactòsid, petunidina-3-arabinósida, petunidina {{4} }O-rutinòsida, delfinidina-3-arabinósida, delfinidina-3-galactòsid, delfinidina 3-O-({6-cumaroilglucòsid), delfinidina 3-O{- - rutinòsida, cianidina-3-galactòsid, cianidina 3-O{- -rutinòsida, peonidina-3-galactòsid i malvidina-3-galactosid.

La calibració diària de l'instrument es va realitzar mitjançant la infusió de kits de calibratge positius/negatius Pierce LTO Velos ESI tal com recomana el fabricant. Es va utilitzar el programari Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EUA) per a l'adquisició de dades i el programari TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) per al processament de dades.

2.7. Assaig de viabilitat cel·lular

Es van sembrar 1 × 104 HAoEC en una placa de 96-pou i es van cultivar durant 24 hores i es van tractar amb delfinidina (1 a 10 ug/mL). Aleshores, 5 ug/ml de 3-（4,5-dime-tiltiazol-2-il）-5-（3-carboximetoxifenil)-2-({ {15}}sulfofenil)-2H-tetrazoli (reactiu MTS, Promega, WI, EUA) es va afegir a cada pou i es va incubar a 37 graus durant 120 min. L'absorbància es va mesurar en un espectrofotòmetre CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, Alemanya) a 490 nm.

2.8. Assaig de proliferació

Els assajos de proliferació es van realitzar mitjançant el kit d'assaig de proliferació cel·lular CyQUANT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) segons les recomanacions del fabricant. Breument, es van sembrar 1,5 × 10* cèl·lules en una placa de 96-pous. Les cèl·lules es van deixar de sèrum durant 2 h i després es van tractar amb delfinidina, sEV nadius o sEV carregats amb delfinidina a diferents concentracions. Després de 24 h d'incubació, es van rentar les cèl·lules amb PBS i es va afegir una solució d'unió de colorant. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus durant 30 min. Per mesurar la fluorescència es va utilitzar un lector de microplaques fluorescents (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemanya) amb filtres per a l'excitació de 485 nm i l'emissió de 530 nm.

2.9.NO Producció Assaty

Els HAoEC es van sembrar en un 8-diapositiva de pous (Ibidi, Gräfelfing, Alemanya) a una velocitat de 3 × 104 cèl·lules per pou (és a dir, 3 × 104 cèl·lules/cm²) en 300 μL del medi. Al 70-80 per cent de confluència, les cèl·lules es van estimular durant 24 h amb delfinidina, sEV natives o delfinidina carregada amb sEV. El trifosfat d'adenosina (ATP) es va utilitzar com a control positiu (10 μM, Sigma-Aldrich) per estimular la producció de NO. Després de 24 h, es va eliminar el medi de cada pou i es va afegir la sonda de diacetat de diaminofluoresceïna (DAF -2 DA) (5 μM durant 30 min, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). A continuació, es van rentar els pous amb PBS. Les cèl·lules es van fixar amb paraformaldehid (4 per cent, 20 min). La fluorescència es va llegir per microscòpia confocal (Zeiss, Jena, Alemanya, LSM700). Es van adquirir quatre imatges i es va utilitzar el programari ImageJ per a la quantificació.

2.10.Assaig Matrigel

Els HAoEC es van sembrar en pous recoberts amb Matrigel (gel de matriu extracel·lular de sarcoma muri d'Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich). Breument, es van col·locar 10 μL de Matrigel líquid a cada pou d'un 15-pou Ibidi μ- Feu lliscar la placa d'angiogènesi (lbidi) i després es va incubar durant 45 min a 37 graus per formar un gel. A continuació, els HAoEC es van sembrar i es van incubar a 37 graus i 5 per cent de CO, durant 45 minuts abans dels tractaments amb delfinidina, sEV nativa o delfinidina carregada amb sEV. , seguida d'una incubació de 12 a 14 h a 37 graus i 5 per cent de CO. La formació d'"estructures semblants a capil·lars" es va observar amb un microscopi òptic (Olympus CK40). La quantificació es va realitzar mesurant el nombre d'estructures semblants a capil·lars utilitzant Programari d'imatge.

2.11.Anàlisi estadística

Els resultats s'expressen com a mitjana ± SEM. La importància de les diferències entre grups es va determinar mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA), seguida de la prova de comparacions múltiples de Tukey. valors p de<0.05 were="" considered="">

3. Resultats

3.1.sEV Caracterització i càrrega de delfinidina

D'acord amb la literatura, la delfinidina carregada dins dels sEV no va induir canvis en la mida de les vesícules, sent 118, 7 ± 2, 9 i 111, 7 ± 1, 8 nm per als sEV buits i els sEV carregats amb delfinidina, respectivament, tal com es determina mitjançant l'anàlisi de seguiment de nanopartícules (figura). 1A) i confirmat per anàlisi de microscòpia electrònica (figura 1B). A més, ambdós tipus de sEV, nadius i carregats de delfinidina, van expressar marcadors exosomals com ALIX, CD63 i TSG101 a nivells similars (figura 1C), mentre que no expressaven ß-actina, un marcador de grans EV.

Figura 1. Caracterització dels sEVs.(A) Distribucions de mida dels sEVs natius i sEVs carregats amb delfinidina basades en mesures de NTA. (B) Imatge de microscòpia electrònica de transmissió representativa de sEVs i sEVs nadius carregats amb delfinidina. Barra d'escala=100 nm. (C) Anàlisi Western Blot que mostra l'expressió d'Alix, CD63, TSG101 i ß-Actina en sEV i sEV carregats amb delfinidina.

Aquest article està extret de Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378