L'orientació a la lactat deshidrogenasa A amb catequina resensibilitza les cèl·lules canceroses gàstriques SNU620/5FU a 5-Fluorouracil Part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:La resistència a les terapèutiques anticancerígenes es produeix en pràcticament tots els tipus de càncer i es converteix en una dificultat important en el tractament del càncer. Tot i que el 5-fluorouracil (5FU) és la primera opció de tractament anticancerígen per al càncer gàstric, la seva eficàcia és limitada a causa de la resistència als medicaments. Recentment, el metabolisme alterat del càncer, inclòs l'efecte Warburg, una preferència per la glucòlisi en lloc de la fosforilació oxidativa per a la producció d'energia, s'ha acceptat com un mecanisme fonamental que regula la resistència a la quimioteràpia. Així, vam investigar el mecanisme detallat i la possible utilitat dels agents antiglicolítics per millorar la resistència al 5FU mitjançant línies cel·lulars de càncer gàstric establertes, SNU620 i SNU620/5FU. deenzims relacionats amb la glucòlisi, com la lactat deshidrogenasa A (LDHA), que les de les cèl·lules progenitores SNU620. Per limitar la glucòlisi, vam examinar la catequina i els seus derivats, que són conegutsantiinflamatorii productes naturals anticancerígens perquè el galat d'epigalocatequina s'ha informat anteriorment com a supressor de l'expressió de LDHA. La catequina, el compost més simple entre ells, va tenir l'efecte inhibidor més alt sobre la producció de lactat i l'activitat de LDHA. A més, la combinació de 5FU i catequina va mostrar citotoxicitat addicional i va induir l'apoptosi mediada per espècies reactives d'oxigen (ROS) a les cèl·lules SNU620/5FU. Així, a partir d'aquests resultats, suggerim la catequina com a candidata per al desenvolupament d'un nou fàrmac adjuvant que redueixi la quimioresistència al 5FU restringint la LDHA.

Paraules clau:5-fluorouracil;quimioresistent; glucòlisi; lactat deshidrogenasa; catequina

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

S'han aconseguit avenços notables en el tractament del càncer gàstric amb resecció quirúrgica del tumor primari i quimioteràpia combinada basada en 5-fluorouracil (5FU), com epirubicina, cisplatina i fluorouracil i docetaxel, oxaliplatina i 5FU[1[1]. ,21 Fins ara, el 5FU, un anàleg de l'uracil que bloqueja la síntesi d'ADN mitjançant la inhibició de la timidilat sintasa [3], segueix sent un fàrmac de quimioteràpia d'ús habitual per al tractament del càncer gàstric [1, A4]. Tanmateix, l'eficàcia clínica de la quimioteràpia ha estat insatisfactòria a causa de la recaiguda del càncer primari o metastàtic relacionat amb la resistència als medicaments [1,5].

Cistanche pot millorar la immunitat

Diversos processos cel·lulars es consideren mecanismes clau subjacents a la quimioresistència, com ara l'activació o inactivació de fàrmacs, la maquinària de reparació del dany a l'ADN, les modificacions en les dianes dels fàrmacs, la inactivació de les vies apoptòtiques i l'augment de l'autofàgia [6,7]. El càncer és heterogeni i diversos càncers utilitzen tant la glucòlisi com la fosforilació oxidativa per al metabolisme energètic [8]. No obstant això, la reprogramació metabòlica, especialment la glucòlisi aeròbica anormal, s'ha informat com un actor clau en el desenvolupament de la resistència als fàrmacs quimioterapèutics, inclòs el 5FU, en el càncer gàstric [9]. La lactat deshidrogenasa A (LDHA) i les piruvat deshidrogenasa cinases (PDK) es coneixen com a reguladors clau de la glucòlisi aeròbica que produeix lactat a partir del piruvat [10,11]. La combinació de dicloroacetat, un inhibidor establert de PDK, restaura la sensibilitat cap al 5FU [12]. A més, s'ha informat que el LDHA, un enzim clau que catalitza la conversió de piruvat en lactat, és un objectiu potencial per al tractament del càncer gàstric [13,14]. La derrota de l'expressió de LDHA a les cèl·lules canceroses inhibeix la tumorigenicitat augmentant la respiració mitocondrial i reduint la viabilitat cel·lular [15]. Diversos inhibidors de LDHA, com ara FX11, PSTMB i GSK 2837808A, disminueixen els nivells d'ATP i generen estrès oxidatiu i, finalment, provoquen la mort cel·lular apoptòtica [16-18]. Tot i que un estudi va demostrar que la inhibició de LDHA per microRNA-34a va recuperar la resistència al 5FU en el càncer de còlon [19], cap estudi anterior ha informat dels efectes dels inhibidors genètics o farmacològics de LDHA sobre la quimioresistència.

Els polifenols del te verd, incloses la catequina (CA), l'epicatequina (EC), la galocatequina (GC), l'epigalocatequina (EGC), l'epicatequina-3-gallat (ECG) i l'epigalocatequina-3-gallat (EGCG), promouen els humans salut mitjançant la prevenció i el tractament de diverses malalties, com ara la inflamació, la diabetis, les malalties cardiovasculars i el càncer maligne [20,21]. Entre els polifenols, l'EGCG millora la quimiosensibilitat al 5FU en les cèl·lules del càncer colorectal i del carcinoma hepatocel·lular activant les vies AMPK i restringint la tija del càncer [22,23]. A més, s'ha informat que l'EGCG inhibeix el LDHA reprimint les seves expressions a les cèl·lules canceroses de mama i de pàncrees [24,25].

En aquest estudi, vam plantejar la hipòtesi que CA podria ser un candidat per a un fàrmac adjuvant per reduir la resistència al 5FU a les cèl·lules canceroses gàstriques. Es va examinar que l'efecte inhibidor de CA, i/o la seva combinació amb 5FU, sobre l'activitat de LDHA induïa així espècies reactives d'oxigen mitocondrial (ROS) i mort de cèl·lules apoptòtiques en cèl·lules resistents a 5FU.

2. Resultats

2.1. Característiques glicolítices de les cèl·lules resistents a 5FU

La proliferació millorada és una característica de la quimioresistència, incloses les cèl·lules canceroses resistents a 5FU [26,27]. Primer, vam confirmar la resistència a 5FU i les taxes de creixement a llarg termini de les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU. Quan aquestes cèl·lules es van cultivar amb les concentracions indicades de 5FU durant 48 h, la dosi estimada que provocava una inhibició del creixement del 50 per cent (Gl50) a les cèl·lules SNU620/5FU (100,63 uM) va ser molt superior a la que causava GIso a les seves cèl·lules parentals SNU620 （28. ）（Figura 1A i figura suplementària S1）. A més, les taxes de creixement de les cèl·lules SNU620/5FU van ser més ràpides que les de les cèl·lules SNU620 (figura 1B i figura suplementària S2). Com que la quimioresistència i les característiques de creixement ràpid podrien estar relacionades amb propietats glicolítices elevades a les cèl·lules canceroses gàstrics [28], es van mesurar les taxes d'acidificació extracel·lular (ECAR) i les taxes de consum d'oxigen (OCR) en ambdues cèl·lules en presència d'oxamat, un conegut inhibidor de la glucòlisi, o no. Els resultats van demostrar que les cèl·lules SNU620/5FU van secretar significativament més lactat que el secretat per les cèl·lules SNU620 i, posteriorment, van acidificar el medi de cultiu (figura 1C i figura suplementària S3). Tanmateix, no es va observar cap canvi significatiu en l'OCR entre aquestes cèl·lules (figura 1D). Es van mesurar els nivells d'expressió d'ARNm i proteïnes de LDHA. L'expressió de LDHA era més alta a les cèl·lules SNU620/5FU que a les cèl·lules SNU620 (figura 1E, F). A més, vam examinar els nivells d'expressió d'ARNm i proteïnes dels isotips PDK i vam trobar que els de PDK2 i PDK3 eren més alts a les cèl·lules SNU620/5FU que a les cèl·lules SNU620 (figura suplementària S4A, B). També es va avaluar la fosforilació de la subunitat E1 de la piruvat deshidrogenasa (PDHA1), que va augmentar amb PDK, i es va trobar que era més alta a les cèl·lules SNU620/5FU que a les cèl·lules SNU620 (figura suplementària S4C). oxamat com a inhibidor de LDHA per superar la resistència a 5FU a les cèl·lules SNU620/5FU. Aquest compost va inhibir el creixement cel·lular tant a les cèl·lules SNU620 com a les SNU620/5FU (figura suplementària S5). A més, el cotractament amb oxamat i 5FU va suprimir el creixement cel·lular, en comparació amb el tractament individual amb oxamat o cèl·lules 5FUin SNU620/5FU (figura 1G). Aquestes dades suggereixen que les cèl·lules SNU620/5FU expressen altament LDHA i la inhibició de l'activitat de LDHA pot superar la resistència de les cèl·lules SNU/5FU a 5FU.

Figura 1. Segons els resultats, les cèl·lules 5-resistents al fluorouracil (5FU) tenen una característica glicolítica elevada: les cèl·lules (A)SNU620 i SNU620/5FU es van tractar amb les concentracions indicades de 5FU durant 48 h. La viabilitat d'aquestes cèl·lules es va avaluar mitjançant l'assaig MTT; (B) es van mesurar els nivells de creixement de les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU cada dia durant 4 dies amb l'assaig MTT; les cèl·lules (C, D) SNU620 i SNU620/5FU es van tractar amb oxamat ( 5mM) o no durant 24 hores, i els valors ECAR i OCR es van avaluar mitjançant l'analitzador Seahorse XF; (E, F) es van detectar les expressions de LDHA a les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU mitjançant qRT-PCR i anàlisi Western blot; (G) Les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU es van tractar amb oxamat (25 mM) i/o 5FU (10 μM) durant 48 h. Els resultats es mostren com a mitjana ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA suprimeix l'activitat LDHA

La producció de lactat es va analitzar amb CA i els seus derivats, inclosos EC, GC, EGC i EGCG, a les cèl·lules SNU620/5FU. En comparació amb aquests derivats, CA va reduir la producció de lactat de manera més eficaç (figura 2A). A més, in vitro, es va confirmar l'activitat de LDHA com diu, i CA va mostrar un efecte inhibidor més fort sobre l'activitat de LDHA que els dels seus derivats (figura 2B). Els efectes inhibidors de la CA sobre les activitats de LDHA i LDHB in vitro es van mesurar de manera dependent de la dosi. CA va inhibir l'activitat de LDHA sense afectar l'activitat de LDHB (figura 2C, D). A més, es van mesurar les activitats de LDHA i LDHB amb EGCG, que se sap que inhibeix l'activitat de LDHA, i es va trobar que havia disminuït en funció de la dosi (figura suplementària S6A, B). A més, es van avaluar les activitats intracel·lulars de LDHA i LDHB amb les concentracions indicades de CA a les cèl·lules SNU620/5FU. CA va inhibir l'activitat de LDHA de manera dosi-dependent dels resultats in vitro, però no l'activitat de LDHB (figura 2E, F). Els nivells d'expressió de proteïnes de p-PDHA1, PDK2, PDK3 i LDHA també es van mesurar a les cèl·lules SNU620/5FU després del tractament amb CA (figura suplementària S7) i vam observar que no es van veure afectats per aquest tractament. Aquests resultats suggereixen que la CA regula l'activitat de LDHA sense afectar la seva expressió.

2.3. Mode d'acció de la inhibició de LDHA per CA

Per analitzar el mecanisme d'inhibició de l'activitat de LDHA sobre CA i els seus derivats, vam realitzar el modelatge molecular de la interacció d'unió entre LDHA recombinant humà i CA (Figura 3A, B). Els resultats van mostrar que CA pot interactuar amb els residus de T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 i T247 de LDHA. Entre ells, R105, S136 i R168 són crítics per a la unió del substrat (piruvat). Per tant, vam suposar que CA podria interferir amb els llocs d'unió al substrat. Per contra, EGCG està unit a LDHA a través d'un lloc diferent. Per verificar encara més el mode d'acció de la inhibició de LDHA per CA, es van confirmar les parcel·les Michaelis-Menten i Lineweaver-Burk amb diverses concentracions de piruvat i CA. L'activitat de LDHA es va augmentar de manera dependent de la dosi del piruvat. Tanmateix, es va revertir amb l'augment de CA. Així, els resultats dels diagrames de Michaelis-Menten i Lineweaver-Burk van demostrar que el CA és un inhibidor no competitiu del LDHA (Figura 3C, D). valor de 197 uM (figura suplementària S8). Aquests resultats proporcionen informació sobre que CA suprimeix l'activitat de LDHA mitjançant la unió al lloc d'unió al substrat de LDHA.

2.4. CA resensibilitza la resistència al 5FU mitjançant la reducció de l'activitat LDHA

Vam avaluar els efectes citotòxics de la CA a les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU i vam trobar que la CA va suprimir el creixement en ambdós grups de cèl·lules (figura 4A). Per verificar que la inhibició del creixement estava relacionada amb la supressió de l'activitat de LDHA, l'expressió de LDHA es va abolir per l'àcid ribonucleic de forquilla curta (shRNA) per a LDHA (shLDHA) i la seva expressió es va recuperar mitjançant la transfecció del plasmidi que expressava LDHA (figura suplementària S9A, B). ).A les cèl·lules SNU620/5FU transfectades amb shLDHA, la producció de lactat i la viabilitat cel·lular no es van canviar notablement pel tractament amb CA, en comparació amb aquestes de cèl·lules transfectades amb simulacre (Figura 4B, C). A més, l'efecte inhibidor del creixement de CA va ser augmentat per la recuperació de l'expressió de LDHA a les cèl·lules SNU620/5FU de derrocament de LDHA (figura 4D). A més, es van examinar les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU després del tractament de CA i 5FU individualment o la combinació d'ambdós. El cotractament amb CA i 5FU va inhibir significativament el creixement de les cèl·lules SNU620/5FU (figura 4E). A més, es van examinar els efectes combinats de CA i 5FU en diverses altres línies cel·lulars, com ara càncer gàstric humà AGS, càncer de pàncrees Panic-1, MIA PaCa-2 i càncer de còlon LS174T i cèl·lules RKO, en comparació amb SNU620 i SNU620/5FUcells. La producció de lactat i l'expressió de LDHA van mostrar una bona correlació entre elles, i aquestes propietats glicolítices són relativament altes a SNU620/5FU, AGS i RKO (figura suplementària S10A, B). A més, el tractament combinat de CA i 5FU va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules, en comparació amb un tractament únic de 5FU en cèl·lules glicolítices, incloent AGS i RKO (figura suplementària S10C). Tanmateix, el cotractament amb CA i 5FU no va inhibir significativament el creixement de les cèl·lules SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 i LS174T, que mostraven expressions baixes de LDHA. Aquests resultats van suggerir que l'efecte sensibilitzant del CA a les cèl·lules resistents a 5FU podria estar relacionat amb el seu efecte inhibidor sobre l'activitat de LDHA.

Figura 2. La catequina (CA) inhibeix l'activitat de LDHA però no la seva expressió: (A) la producció de lactat de SNU620/5FU es va mesurar després del tractament amb derivats de CA (10 μM) durant 24 h; (B) es va avaluar l'activitat de LDHA in vitro després del tractament amb derivats de CA (10 uM) i oxamat (20 mM); (C, D) es van estimar les activitats in vitro, LDHA i LDHB amb les concentracions de CA indicades; (E, F) les cèl·lules es van tractar amb les concentracions indicades de CA durant 24 h. Les activitats intracel·lulars de LDHA i LDHB es van mesurar utilitzant els lisats cel·lulars com a font enzimàtica. Els resultats es mostren com a mitjana ± SEM. **pàg<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figura 4. La viabilitat cel·lular es va inhibir pel cotractament amb catequina (CA) i 5-fluorouracil (5FU) en cèl·lules resistents a 5FU: es van avaluar la viabilitat (A) de les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU després del tractament amb les concentracions indicades de CA durant 48 h; (B) Les cèl·lules SNU620/5FU-pLKO.1 i SNU620/5FU-shLDHA es van tractar amb CA (10 μM) durant 24 h. La producció de lactat es va mesurar en els medis de cultiu de cèl·lules SNU620/5FU-pLKO.1 i SNU620/5FU-shLDHA; (C, D) SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA més EV , i les cèl·lules SNU620/5FU-shLDHA més LDHA # 2 es van tractar amb les concentracions indicades de CA durant 48 h. La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant un assaig MTT; (E) Les cèl·lules SNU620 i SNU620/5FU es van tractar amb CA (10 μM) i/o 5FU (10μM) durant 48 h. Les viabilitats d'aquestes cèl·lules es van mesurar mitjançant un assaig MTT. Els resultats es mostren com a mitjana ± SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Aquest article està extret de Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms