Millora de la proteòmica de dalt a baix del teixit cerebral amb FAIMS Part 1
Aug 27, 2024
Resum
Les investigacions proteòmiques de l'Alzheimer i la malaltia de Parkinson han proporcionat informació valuosa sobre els trastorns neurodegeneratius. Fins ara, aquestes investigacions s'han restringit en gran mesura a enfocaments de baix a dalt, cosa que dificulta el grau en què es pot caracteritzar l'estat "intact" d'una proteïna.
La malaltia d'Alzheimer és una malaltia neurodegenerativa que té efectes irreversibles en la memòria i les capacitats cognitives d'una persona. Tot i que les persones no poden curar completament la malaltia, mitjançant un tractament i una prevenció acurats es pot frenar al màxim la progressió de la malaltia i es pot mantenir la salut física i mental del pacient.
La memòria és un dels aspectes més evidents que afecten els malalts d'Alzheimer. Sovint poden oblidar informació important, com ara el seu nom, els noms dels seus éssers estimats, dates importants, etc. A més, també es pot oblidar algun vocabulari avançat d'autoaprenentatge, com ara conceptes abstractes i sinònims. Tanmateix, amb una mica d'entrenament i tractament cognitius, els pacients amb Alzheimer encara poden mantenir la seva memòria en alguns aspectes.
Tot i que la malaltia d'Alzheimer pot comportar efectes negatius, hem de mirar-ho positivament. En primer lloc, augmentant la consciència i la comprensió de la malaltia, podem prevenir-la i tractar-la millor. En segon lloc, els cuidadors i familiars dels malalts d'Alzheimer també poden aprendre a comunicar-se i interactuar amb ells de manera eficaç per ajudar els pacients a mantenir la seva autodignitat i viure feliços tant com sigui possible.
En general, tot i que la malaltia d'Alzheimer pot provocar efectes irreversibles en la memòria i les capacitats cognitives, cal mantenir una actitud optimista i intentar frenar la progressió de la malaltia mitjançant tractaments i mesures preventives. Paral·lelament, també hauríem de donar més ajuda i suport a aquells que cuiden els pacients amb malaltia d'Alzheimer, i crear conjuntament una comunitat més càlida i interactiva. Es pot veure que hem de millorar la memòria. Cistanche pot millorar significativament la memòria perquè és un material medicinal tradicional xinès amb molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'efecte de Cistanche prové dels diferents ingredients actius que conté, com l'àcid tànic, polisacàrids, glicòsids flavonoides, etc. Aquests ingredients poden promoure la salut del cervell de moltes maneres.
Feu clic a Coneix 10 maneres de millorar la memòria
La proteòmica de dalt a baix (TDP) supera aquesta limitació; tanmateix, normalment es limita a observar només les proteoformes més abundants de mida relativament petita.
Per tant, les tècniques de fraccionament s'utilitzen habitualment per reduir la complexitat de la mostra. Aquí, investiguem el fraccionament de la fase gasosa mitjançant espectrometria de mobilitat iònica de forma d'ona asimètrica de camp alt (FAIMS) dins de TDP.
Utilitzant una mostra d'alta complexitat derivada del teixit cerebral de la malaltia d'Alzheimer (AD), descrivim com l'addició de FAIMS a TDP pot millorar de manera robusta la profunditat de la cobertura del proteoma.
Per exemple, la implementació de FAIMS amb tensió de compensació externa (CV) que passa a -50, -40 i -30 CV podria més que duplicar el nombre mitjà de proteoformes, gens i cobertura de seqüències de proteoma no redundants en comparació amb sense FAIMS.
També vam trobar que FAIMS pot influir en la transmissió de proteoformes i els seus embolcalls de càrrega en funció de la seva mida. És important destacar que FAIMS va permetre la identificació de proteoformes amiloidbeta (A) intactes, inclosa la variant A 1–42 propensa a l'agregació que està fortament relacionada amb l'AD.
Les dades en brut i els fitxers associats s'han dipositat al ProteomeXchange Consortium mitjançant el dipòsit de dades MassIVE amb l'identificador de conjunt de dades PXD023607.
INTRODUCCIÓ
Durant les dues últimes dècades, la incidència de malalties neurodegeneratives s'ha més que duplicat a tot el món, amb la malaltia d'Alzheimer (MA) com la forma més prevalent.1 Dues espècies de proteïnes, pèptids beta amiloide (A ) i proteïna fosforilada associada a microtúbuls tau(tau), 2-5 estan fortament associats amb AD.
Per tant, la proteomecaracterització detallada de la MA ha tingut una importància especial6,7. L'espectrometria de masses ha tingut un paper central en aquestes investigacions,8 predominantment per enfocaments de baix a dalt.9–16.
Tanmateix, la digestió de la proteasa necessària per a les anàlisis de baix a dalt impedeix la captura de l'estat complet d'una proteïna, que pot variar a causa d'al·lels genètics, splicing alternatiu, processament proteolític i modificacions post-traduccionals (anomenades "proteoformes").17– 20
Com que els enfocaments proteòmics de dalt a baix (TDP) analitzen proteïnes en estat intacte, la probabilitat de capturar proteoformes associades a determinades patologies és més gran i permet una connexió més forta i directa entre el genotip i el fenotip.20–22.
Per exemple, el TDP és especialment adequat per capturar fragments proteolítics endògens derivats de proteïnes com la tau, que s'han relacionat amb la patologia d'Alzheimer.23–26 Diverses aplicacions anteriors de TDP han mostrat una gran promesa per revelar l'heterogeneïtat del proteoma cerebral regional i els canvis neuronals en resposta a diversos estímuls. .27–30
Tanmateix, el TDP de mostres complexes requereix normalment tècniques de fraccionament fora de línia per reduir la complexitat de la mostra, ja que el proteoma humà abasta diversos ordres de magnitud en mida i abundància, i les proteïnes generalment no es resolen bé amb la cromatografia líquida d'alt rendiment (LC) en fase inversa.31
Aquest fraccionament fora de línia es pot aconseguir amb electroforesi d'atrapament de fraccions líquides eluïdes en gel, cromatografia d'exclusió de mida, cromatografia d'intercanvi iònic o purificació d'afinitat, per citar-ne alguns.22,32–35.
Malauradament, el fraccionament fora de línia normalment redueix el rendiment i el rendiment en requerir un maneig de mostres estès.36 La separació de mobilitat iònica en fase gasosa és una alternativa de fraccionament atractiva que es pot introduir entre les dimensions LC i MS sense requerir passos addicionals de manipulació de mostres.
L'espectrometria de mobilitat iònica de forma d'ona asimètrica d'alt camp (FAIMS) és especialment adequada per a aquesta tasca amb la recent introducció del dispositiu FAIMS Pro, el disseny modular del qual permet la incorporació fàcil de la mobilitat iònica a diversos instruments Orbitrap actuals.37
FAIMS, també anomenada espectrometria de mobilitat diferencial, separa els ions en un gas portador basant-se en combinacions de factors com la mida, la càrrega o la forma mitjançant la introducció d'una forma d'ona asimètrica amb camps elèctrics alts i baixos.38 Per evitar la col·lisió dels ions amb el Elèctrode, s'introdueix una desviació en el camí de l'ió mitjançant l'aplicació d'una tensió de compensació de CC (CV),39 que permet la transmissió selectiva d'aquest ió.38
L'aplicació de FAIMS a l'anàlisi de proteïnes intactes s'ha restringit en gran mesura a la separació de conformers de proteïnes individuals o petites combinacions de proteïnes;40–45;
tanmateix, recentment s'ha aplicat FAIMS a les anàlisis de proteïnes intactes i natives mitjançant l'anàlisi de superfícies d'extracció líquida.46–50Aquí, apliquem l'anàlisi FAIMS-TDP a una mostra de teixit sencer del còrtex frontal medial (MFC) d'un pacient amb Alzheimer.
L'escaneig a través d'un interval de CV de -50 a -20 CV amb un pas extern ens va permetre determinar com la modulació de FAIMS CV influeix en les característiques dels ions transmesos a través de la unitat cilíndrica FAIMS i com es pot explotar aquesta relació per orientar les proteoformes en funció de la mida.
FAIMS-TDP va duplicar més les identificacions de proteoformes en un sol CV en comparació amb sense FAIMS i va permetre un interrogatori més profund de proteoformes rellevants per a malalties neurodegeneratives, incloses -, - i -sinucleïnes, PARK7, isoformes d'empalmament tau i diverses proteoformes A intactes.
En conjunt, aquest treball descriu com es poden aconseguir majors identificacions de proteoformes i cobertura de proteoma de manera reproducible mitjançant el fraccionament en fase gasosa amb FAIMS en TDP.
MÈTODES
Preparació de la mostra
La mostra de MFC es va rebre del Centre de Malalties d'Alzheimer de la Universitat de Rush. Els participants eren persones grans de la clínica que es van inscriure amb queixes de memòria i/o demència entre 1992 i 2005.
Van ser avaluats a la Rush Memory Clinic per a una possible demència i van acceptar la donació de cervell com a part del nucli clínic del Rush Alzheimer's Disease Core Center. L'estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional del Centre Mèdic de la Universitat de Rush.
Després de la mort, els familiars van donar el consentiment per a una autòpsia. La categoria de diagnòstic cognitiu global del pacient era la demència d'Alzheimer sense altres causes de deteriorament cognitiu51, mentre que l'interval post mortem era de 230 min.
Tots els passos de manipulació de mostres es van realitzar amb les precaucions BSL{{0}}. Es van transferir 33 mg de teixit MFC emmagatzemat a -80 graus a tubs LoBind Eppendorf d'1,5 ml (Eppendorf, Cat # 022431081) amb l'addició de 0,5 ml de tampó d'homogeneïtzació format per 8 M d'urea, 10 mL de bicarbonat de mamoni (ABCM) i 110 mL. tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a pH 7,5.
L'homogeneïtzació es va aconseguir mitjançant una interrupció física mitjançant l'aplicació d'una mà de pellets impulsada per motor de mà durant 30 s (BioVortexer amb SpiralPestle; Biospec 1083 i 1017), abans d'afegir 0,5 ml de tampó d'homogeneïtzació a temperatura ambient.
A continuació, la mostra es va incubar a 37 graus durant 60 min a 1200 rpm mitjançant un ThermoMixer per permetre l'extracció i desnaturalització de proteïnes cel·lulars. La granulació del material insoluble en urea es va aconseguir amb centrifugació a 18,000g durant 20 min a 22 graus, i el sobrenedant resultant es va afegir a 3 ml de tampó de rentat (WB; urea 8 M, ABC 10 mM, pH 7). .5) dins d'un filtre de tall de pes molecular (MWCO) de 4 ml de 100 kDa per eliminar les espècies de MW grans.
Després d'1 h de centrifugació a 22 graus i 5000 g, el volum de retentat era de 200 μ i el volum de filtrat era de 3, 8 ml. Es van transferir 3, 8 ml del filtrat a un filtre MWCO de 3 kDa per eliminar contaminants de molècules petites i pèptids de baix PM.
El filtre MWCO de 3 kDa es va centrifugar a 22 graus i 7300 g durant 1 h, donant un volum de retentat de 200 μL. Es van rentar una vegada més 200 μL de retentat del filtre MWCO de 100 kDa diluint-lo a 4 ml amb WB i filtrant-lo de nou a través del mateix filtre.
Aquest flux es va afegir al mateix filtre MWCO de 3 kDa com s'ha esmentat anteriorment i es va concentrar una vegada més.
Els 200 μL finals de retentat del rentat del filtre MWCO de 3 kDa es van transferir a un tub LoBindEppendorf d'1,5 ml. Per acidificar la mostra, es van afegir 10 μL d'àcid fòrmic (FA) al 10%, donant lloc a una concentració de FA del 0, 5% a la mostra final.
La mostra es va centrifugar a 18,000g durant 15 min per eliminar el material precipitat abans de mesurar la concentració de proteïnes mitjançant l'assaig d'àcid bicinconínic (BCA).
Es van preparar estàndards d'albúmina sèrica bovina en 8 M d'urea, 10 mM ABC i 0,5% FA per tenir en compte qualsevol contribució potencial de tampó a l'assaig de BCA. La concentració de proteïnes mitjançant l'assaig de BCA es va determinar que era d'1,1 mg/mL, que correspon al rendiment final de 0,22 mg de proteïna total recuperada a la mostra de ∼200 μL. La mostra va ser diluït a 0,5 mg/ml amb WB que conté 0,5% FA i emmagatzemat a -80 graus fins a l'anàlisi LC-MS.
Hem de tenir en compte que els experiments inicials (dades no publicades) amb un còctel tradicional d'inhibidors de proteasa/fosfatasa dins del nostre tampó d'homogeneïtzació van conduir a resultats enganyosos de BCAassay i LC-MS a causa de la retenció de diversos components del còctel pel filtre 3KMWCO.
A més, molts dels inhibidors de la fosfatasa i la proteasa que s'utilitzen habitualment són químicament incompatibles amb agents reductors com el TCEP. Tenint en compte aquestes incompatibilitats i que s'esperaria que les condicions fortament desnaturalitzants d'urea 8 M amb TCEP 10 mM inactivessin la majoria de proteases, vam creure que la degradació proteolítica encara es reduiria al mínim en aquestes condicions.
Anàlisis LC-MS/MS i configuració de FAIMS
Les mostres es van analitzar mitjançant un sistema Waters NanoACQUITY UPLC amb fases mòbils formades per {{0}},2% FA en H2O (fase mòbil A) i 0,2% FA en ACN (fase mòbil B).
Tant la precolumna d'atrapament (100 μm d'ID, 5 cm de longitud) com la columna analítica (75 μm d'ID, 50 cm de longitud) eren purins empaquetats amb el material d'embalatge C2 (5 i 3 μm per a trampa / analític, respectivament, 300 Å, tecnologia de mètodes de separació) . Les mostres es van carregar en un buc de 5 μ, corresponents a 2, 5 ug de la quantitat de material carregat, i es van injectar a la columna de trapping amb un flux isocràtic del 5% b a 3 μl/min durant 20 min.
La separació es va realitzar amb un gradient del 5-50% b durant 180 min a 300 nL/min. Per a l'anàlisi de proteïnes MS/MS, el sistema NanoACQUITY es va acoblar a un espectròmetre de masses Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid equipat amb la interfície FAIMS Pro.
Els paràmetres de la font incloïen una tensió d'electrospray de 2,2 kV, una temperatura capil·lar de transferència de 275 graus i una amplitud de radiofreqüència d'embut iònic del 60%. FAIMS es va establir amb una resolució estàndard sense un flux addicional de gas portador controlat per l'usuari i una tensió de dispersió de -5 kV (equivalent a un camp de dispersió de -33,3 kV/cm),50 mentre que el CV variava segons l'experiment (anomenat "passo extern". ").
El Fusion Lumos es va configurar al mode d'aplicació "proteïna intacta", que redueix la pressió de la cèl·lula N2 de dissociació C-trap (HCD) de major energia a 2 mTorr, i les dades es van recollir com a perfil complet. Les dades MS1 i MS2 es van adquirir a una resolució de 120k i 60k, microescaneigs de 3 i 2, en un rang de 500–2,000 m/z i 400–2,000 m/z i amb Objectius AGC de 5 × 106 i 5 × 105, respectivament.
MS1 i MS2 també es van adquirir amb un temps d'injecció màxim de 400 ms. La configuració depenent de les dades incloïa una selecció dels 6 ions més intensos, l'exclusió d'ions inferiors a l'estat de càrrega5+, la inclusió d'estats de càrrega indeterminats i l'exclusió dinàmica després d'una observació durant 30 s.
Els ions seleccionats per a MS2 es van aïllar en una finestra de ± 1,5 m/z i es van fragmentar mitjançant una dissociació induïda per col·lisió (CID) amb una energia de col·lisió del 35%. Hem utilitzat CID en lloc de HCD a causa de la menor dependència de l'energia de col·lisió normalitzada per aconseguir espectres de fragmentació de proteïnes interpretables, prioritzant així l'amplitud de les observacions de les nostres proteoformes sobre la cobertura de la seqüència.52
Els conjunts de dades de cada CV FAIMS es van recollir per triplicat. Tots els fitxers en brut s'han dipositat al dipòsit de dades MassIVE i es pot accedir mitjançant l'adhesió MSV000086696 o amb PXD023607 a ProteomeXchange.
For more information:1950477648nn@gmail.com
