Millora de la proteòmica de dalt a baix del teixit cerebral amb FAIMS Part 2

Anàlisi de dades

La identificació de proteoformes es va realitzar amb TopPIC versió 1.3.53 La configuració de TopPIC incloïa una finestra precursora de 3 m/z (per tenir en compte l'embolcall isotòpic), una tolerància a l'error massiu de 15 ppm, un desplaçament de massa desconegut màxim/min de 500 Da i un màxim. nombre de modificacions desconegudes permeses d'1.

En els darrers anys, cada cop més estudis han demostrat que hi ha una estreta relació entre la morfologia de les proteïnes i la memòria. Les proteïnes són les molècules més bàsiques de les activitats vitals. Poden controlar les activitats vitals de les cèl·lules i mantenir el funcionament normal del cos humà. Els estudis han trobat que la morfologia de les proteïnes no només té un paper important en les activitats de la vida cel·lular sinó que també té una relació inseparable amb la funció de memòria del cervell. Un cop canvia la morfologia de les proteïnes, afectarà la connexió entre les neurones, afectant així la capacitat de memòria de les persones.

En les primeres etapes de la vida, els canvis en la morfologia de les proteïnes tenen un paper vital en el desenvolupament i la funció del cervell. Si la morfologia de les proteïnes no és com hauria de ser, provocarà una sèrie de problemes neurològics que, finalment, condueixen a pèrdua de memòria, deteriorament cognitiu, etc.

No obstant això, no cal preocupar-se. La tecnologia mèdica moderna ha permès a les persones ajustar la morfologia de les proteïnes mitjançant la dieta per millorar la seva memòria. Una dieta rica i variada és rica en proteïnes, però a l'hora d'escollir proteïnes, intenta triar aliments baixos en greixos, en colesterol i en hidrats de carboni per evitar els efectes adversos d'una ingesta excessiva sobre l'organisme.

En resum, la morfologia de les proteïnes i la memòria són inseparables. Hem de parar atenció a una alimentació saludable i una ingesta equilibrada de proteïnes per mantenir una bona salut mantenint una bona memòria. Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche pot millorar significativament la memòria perquè té efectes antioxidants, antiinflamatoris i anti-envelliment, que poden ajudar a reduir l'oxidació i les reaccions inflamatòries al cervell, protegint així la salut del cervell. sistema nerviós. A més, Cistanche també pot promoure el creixement i la reparació de les cèl·lules nervioses, millorant així la connectivitat i la funció de les xarxes neuronals. Aquests efectes poden ajudar a millorar la memòria, la capacitat d'aprenentatge i la velocitat de pensament, i també poden prevenir l'aparició de disfuncions cognitives i malalties neurodegeneratives.

Feu clic a Saber per millorar la memòria a curt termini

Els espectres MS2 es van cercar en una base de dades concatenada amb entrades d'Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), Swiss-Prot splicevariants (22, 000) i TrEMBL (54.436), així com contaminants comuns. Les proteoformes identificades es van filtrar a una taxa de descobriment fals (FDR) de l'1% mitjançant TopPIC.

L'anàlisi de dades aigües avall es va realitzar a l'entorn R per a la computació estadística i la generació de figures.54 En l'anàlisi aigües avall, les proteoformes del mateix gen amb els mateixos aminoàcids inicials i finals que es va trobar que es trobaven dins de ± 5 Da es van combinar com a proteoforma única per augmentar l'exigència. dels nostres encàrrecs.

Tot i que el llindar de 5Da és arbitrari, aquest enfocament va compensar els pics monoisotòpics assignats incorrectament, l'ambigüitat en els canvis de massa desconeguts i altres desviacions artefactuals. Per determinar la desviació estàndard relativa (RSD) de les proteoformes dins de les rèpliques, hem utilitzat la sortida de "intensitat de característiques" de TopPIC.

Els mapes de cobertura de la seqüència de fragmentació i els espectres associats es van generar mitjançant el programari LCMsSpectator.55

Els paràmetres específics de LCMsSpectator incloïen una tolerància d'ions precursors d'10 ppm, una tolerància de producció d'10 ppm, un llindar S/N mínim d'1,5, un llindar de correlació de Pearson de 0,7, un suavització predeterminada de 9 punts, i un llindar d'intensitat relativa de l'isòtop precursor de 0,1.

RESULTATS I DISCUSSIÓ

L'addició de FAIMS augmenta de manera robusta la cobertura del proteoma

La mostra de teixit de còrtex d'un pacient diagnosticat amb Alzheimer es va processar seguint el flux de treball, tal com es mostra a la figura 1. Primer hem intentat analitzar el rendiment de FAIMS en diversos currículums en comparació amb els sense FAIMS (anomenats "Sense FAIMS").

Val la pena recordar que la interfície FAIMS produeix una pèrdua modesta de transmissió d'ions, presumiblement a causa del camí més llarg dels ions a través de la font.56 Per tant, per representar millor les condicions típiques i garantir comparacions equitatives, les dades "No FAIMS" es van recollir utilitzant la mateixa mostra sense la unitat FAIMS instal·lada.

Aquestes dades "Sense FAIMS" es van recollir per triplicat i es van analitzar segons el flux de treball, tal com es mostra a la figura 1 amb una anàlisi DDA MS2 dels 6 principals. Els conjunts de dades "No FAIMS" van identificar de mitjana 754 ± 35 proteoformes (figura 2A i taula S1) i van identificar col·lectivament 1073 proteoformes úniques (no redundants) (figura 2B) derivades de 293 gens únics (figura 2C), que cobrien 29.359 aminoàcids al proteoma (figura 2D).

La mètrica "cobertura del proteoma" (figura 2D) es defineix com a aminoàcids no redundants coberts per la seqüència de cada proteoforma. Essencialment, aquesta mètrica explica tant la longitud com la diversitat de les proteoformes identificades.

Considerem que aquesta és una mètrica més equilibrada en comparació amb el nombre brut de proteoformes i gens, ja que evita els biaixos cap a proteoformes més petites. Tot i que els recomptes simples de proteoformes o gens són intuïtius, aquestes mètriques semblen estar fortament influenciades per fragments proteolítics curts. Els conjunts de dades FAIMS es van recollir de -50 a -20 CV escanejats en passos de 5 V.

Cadascun dels 7 CV resultants es va recollir per triplicat. Pel que fa a les proteoformes i els gens, FAIMS va superar "Sense FAIMS" per a tots els CV provats dins del rang de -50 a -30 CV (figura 2A-C).

Per exemple, els tres conjunts de dades a -50 CV van identificar 1833 ± 17 proteoformes, un augment mitjà de ∼140% per tirada en comparació amb "Sense FAIMS". Col·lectivament, aquests tres conjunts de dades a -50 CV van identificar 2564 proteoformes úniques de 530 gens únics que cobrien un total de 43.437 aminoàcids, un augment del 95, 69 i 69% respecte als tres conjunts de dades "NoFAIMS", respectivament (figura 2B-D). i taula S1).

A més, tot i que FAIMS a -25V observa menys proteoformes i gens únics en comparació amb "No FAIMS", les proteoformes en si són molt més llargues de mitjana. Així, quan es considera la longitud del proteoform, (Figura 2D), els conjunts de dades de -25 V cobreixen gairebé tants aminoàcids del proteoma (28.398) en relació amb "Sense FAIMS" (29.359), fent-ho amb només la meitat de proteoformes (Figura 2B). ).

També vam investigar si FAIMS podria proporcionar una anàlisi tan robusta i reproducible en comparació amb sense FAIMS. Es va avaluar la reproductibilitat de la quantificació calculant l'RSD (equivalent al coeficient de variació) de la intensitat de les característiques de cada proteoforma, sempre que la proteoforma compleixi el criteri d'observar-se en els tres conjunts de dades replicades per a cada paràmetre de CV.

Com que els conjunts de dades FAIMS i "No FAIMS" es van recollir tots a partir d'una mostra biològica única, la variància entre les rèpliques s'hauria d'atribuir exclusivament a factors instrumentals.

El diagrama de caixa de la figura 3 (així com els histogrames individuals de la figura S1) demostra com es comparen les distribucions de RSD entre els conjunts de dades FAIMS i "No FAIMS".

A partir de la RSD mitjana, l'addició de FAIMS va donar lloc a una qualitat de quantificació similar o lleugerament millorada en relació a "Sense FAIMS". La millora de les RSD entre tensions més baixes (-20 a -30 CV) pot estar relacionada amb l'observació que es transmeten menys proteoformes dins d'aquest rang, proporcionant espectres MS1 de major qualitat i, per tant, millors estimacions de la intensitat de les característiques.

A més, val la pena assenyalar que els RSD determinats a partir d'aquestes rèpliques són similars als experiments anteriors de dalt a baix55 i de baix a dalt57,58 realitzats amb instrumentació similar.

En conjunt, aquestes dades demostren que l'addició de FAIMS a TDP augmenta de manera robusta les identificacions de proteoformes, sense cap sacrifici de qualitat de quantificació.

A continuació, vam investigar la superposició de les identificacions entre els CV, que podrien proporcionar el conjunt d'observacions no redundants més gran.

Utilitzant coeficients de superposició, definits com la intersecció entre dos conjunts dividida pel més petit dels dos conjunts, vam determinar la similitud entre cada conjunt de dades. El coeficient de superposició mitjà global per a les identificacions de gens de proteoforma i de gens dins de cada CV FAIMS va ser de 0,76.

Això és comparable al coeficient de superposició dels conjunts de dades "Sense FAIMS" (0,77), cosa que suggereix que les rèpliques tècniques mostren una reproductibilitat similar. A les figures 4 i S2, respectivament, es mostra un mapa de calor que mostra els coeficients de superposició FAIMS de proteoformes i gens.

En particular, la superposició de les identificacions de gens a l'espai CV és molt més gran en relació amb les proteoformes, tot i que és especialment notable quan es comparen les distàncies CV més llargues.

Per exemple, la superposició entre -50 i -20 CV és de 0,64 a nivell de gens i de 0,06 a nivell de proteoforma. Això s'esperava, ja que cada gen es pot representar potencialment per múltiples proteoformes.

La figura 4 demostra que, mentre que una diferència de 5-10 V en CV produeix coeficients de superposició majoritàriament superiors a 0,5, les distàncies superiors a 15 V produeixen graus de dissimilaritat més grans i, per tant, estan millor espaiades per capturar conjunts de proteoformes prou diferents.

Amb aquests conjunts de dades, a continuació, vam intentar determinar quines combinacions de CV són òptimes per aconseguir identificacions màximes de gens, identificacions de proteoformes i cobertura de seqüències amb restriccions sobre el nombre de CV per a cada combinació.

En primer lloc, vam establir les combinacions òptimes per a qualsevol nombre de CV d'1 a 7 utilitzant les mètriques de proteoformes úniques, gens i cobertura de seqüències de proteoma (figura 5).

Utilitzant combinacions limitades a tres CV com a exemple, la figura 5A, B detalla com -35, -40 i -50 V són ideals si es vol maximitzar el nombre de proteoformes o gens.

Les proteoformes i els gens identificats en aquests tres CV (nou conjunts de dades) cobreixen el 84% del total de proteoformes úniques i el 92% del total de gens en tot el conjunt de 21 conjunts de dades.

Quan es pesa la longitud d'una proteoforma amb una cobertura de seqüència com a mètrica, la combinació ideal és de -30, -40 i -50 CV, que cobreix el 88% dels aminoàcids únics dels 21 conjunts de dades FAIMS amb només una modesta pèrdua d'identificacions de proteoformes i gens ( 4221 proteoformes i 723 gens, figura 5C). Tanmateix, aquestes combinacions inclouen totes les rèpliques i representen les identificacions màximes que es podrien aconseguir per a una determinada combinació de CV. Per tant, per demostrar l'avantatge del pas de CV extern, vam decidir investigar quins nombres es podrien aconseguir raonablement de mitjana amb només tres execucions, on cada execució és un CV diferent.

Utilitzant els conjunts de dades de -50, -40 i -30 V com a exemple, vam determinar les proteoformes úniques mitjanes, els gens únics i les cobertures de la seqüència del proteoma a partir de les 27 combinacions úniques de les tres rèpliques diferents de cada CV.

A partir d'aquesta anàlisi, podríem aconseguir 2986 (± 46) proteoformes úniques i 618 (± 12) gens únics que cobreixen 64.534 (± 1089) aminoàcids de mitjana. En comparació amb els conjunts de dades triplicats "No FAIMS", que van identificar 1073 proteoformes úniques i 293 gens únics que cobreixen 29.359 aminoàcids, el pas de CV extern a -50, -40 i -30 V podria més que duplicar cada mètrica.

No obstant això, la combinació òptima de CV també dependrà de l'organisme i el teixit del qual es deriva la mostra, els passos de preparació de la mostra aplicats, així com qualsevol fraccionament fora de línia addicional implementat abans de l'anàlisi LC-MS.

En general, quan es pren juntament amb l'anàlisi de superposició (figura 4), suggereix que les distàncies de 15 V o més entre CV proporcionen la menor quantitat de solapament entre proteoformes, mentre que la separació de 5-10 V dins dels -50 a -30 CV maximitza els gens, les proteoformes i el proteoma. cobertura de la seqüència.

Per determinar encara més l'impacte de FAIMS en la profunditat de la cobertura del proteoma, vam comparar els gens identificats dels nostres conjunts de dades de dalt a baix amb una anàlisi típica de baix a dalt del cervell humà.

Els conjunts complets de dades de baix a dalt del teixit cerebral humà ens van permetre estimar l'abundància de 8528 proteïnes mitjançant un recompte espectral ponderat.

Mitjançant referències creuades amb els nostres conjunts de dades de dalt a baix, vam poder determinar d'on es deriven els gens i les proteoformes i es classifiquen en termes d'abundància estimada de proteïnes (utilitzant recomptes espectrals normalitzats pel conjunt de dades) al cervell humà (figura 6).

Els gens que es van trobar a la nostra anàlisi de dalt a baix però no al conjunt de referència de baix a dalt es van agrupar com a "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com