Contacte:jerry.he@wecistanche.com

Vinita D. Apraj1, Nancy S. Pandita2

1Departament de Ciències Biològiques, 2Departament de Química, Sunandan Divatia School of Science, NMIMS de SVKM, Vile-Parle (W), Bombai, Maharashtra, Índia

Cistanche té un efecte anti-envelliment

RESUM

Antecedents: La pell de Citrus reticulata Blanco s'utilitza tradicionalment com a tònic, estomacal, astringent i carminatiu. També és útil en la cura de la pell. Objectiu: estudiar elanti edatpotencial dels extractes alcohòlics de la pell de C. reticulata Blanco mitjançant assaigs antioxidants i antienzims in vitro.

Materials i mètodes: Els extractes vegetals es van obtenir per Soxhlation (CR HAE-Extracte alcohòlic calent de Citrus reticulata) i mètode de maceració (CR CAE-Extracte alcohòlic en fred de Citrus reticulata). Es va realitzar una anàlisi fitoquímica qualitativa i quantitativa. A més, in vitroantioxidantes van realitzar anàlisis d'espectrometria de masses (GC-MS), antienzim i cromatografia de gasos. Resultats: es va trobar que el contingut total de fenòlics i flavonoides de CR HAE era superior al CR CAE. El valor EC50 de CR HAE i CR CAE per a assaigs d'1,1-Difenil-2-picrilhidrazil, anió superòxid i 2,2'-azino-bis (àcid 3-etilbenzotiazolina-6-sulfònic) va ser de 25{ {55}}.33 ± 40,16 µg/ml i 254,73 ± 15,78 µg/ml, 221,27 ± 11,25 µg/ml i 354,20 ± 23,79 µg/ml, i 59,16 µg/ml, i 59,16 µg/ml, 2,17 ± ± 2,1,17, µg/ml, respectivament Es va trobar que els valors de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen per a CR HAE i CR CAE eren de 1243 i 1063 µmols d'equivalent d'àcid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetra metilcroman-2-carboxílic/g de substància, respectivament. Es van avaluar les activitats anti-collagenasa i anti-elastasa tant per a CR HAE com per CR CAE. Els valors EC50 de CR HAE i CR CAE per a anti-collagenasa i anti-elastasa van ser de 329,33 ± 6,38 µg/ml, 466,93 ± 8,04 µg/ml i 3,22 ± 0,24 mg/ml, 5,09 ± 0,30 mg/ml, respectivament CR HAE va mostrar una activitat anti-collagenasa i anti-elastasa més forta que CR CAE. L'anàlisi GC-MS de CR HAE es va dur a terme perquè CR HAE va mostrar més altantioxidanti potencial antienzim que el CR CAE. Conclusió: es pot utilitzar la closca de C. reticulataanti arruguesformulacions per a la cura de la pell.

Paraules clau: 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil, 2, 2'-azino-bis (àcid 3-etilbenzotiazolina-6-sulfònic), anti-arrugues, elastasa, cromatografia de gasos-espectrometria de masses, capacitat d'absorció de radicals d'oxigen

RESUM

• S'ha avaluat el potencial anti-envelliment de la pell de Citrus reticulata Blanco

• In vitroantioxidanti assaigs antienzims

• Es van realitzar dos tipus d'extracció i els extractes es van sotmetre a anàlisi fitoquímica qualitativa i quantitativa. L'extracte obtingut per Soxhlation (CR HAE) va mostrar uns continguts totals de fenòlics i flavonoides més elevats que l'extracte obtingut per maceració (CR CAE)

• CR HAE va demostrar una forta activitat d'eliminació de radicals lliures de DPPH i superòxid, mentre que es va trobar que l'activitat d'eliminació de l'ABTS dels dos extractes era similar. Es va trobar que la capacitat d'absorció de radicals d'oxigen (ORAC) de CR HAE era més gran; indicant el seu fort potencial antioxidant

• Es van avaluar les activitats d'inhibició de la col·lagenasa i l'elastasa in vitro tant per als extractes i CR HAE va mostrar un fort potencial anti-colagenasa i anti-elastasa que indica la seva capacitat anti-envelliment.

• L'anàlisi GC-MS de CR HAE va revelar la presència de diversos compostos

incloent principalment les polimetoxiflavones. CR HAE va mostrar una activitat antioxidant i antienzimàtica prometedora i es pot utilitzar com a potencialanti arruguesagent aanti edatformulacions per a la cura de la pell.

Abreviatura utilitzada: ECM: matriu extracel·lular, UV: ultravioleta, ROS: espècies reactives d'oxigen, MMP: metaloproteinasa de matriu, Chc: col·lagenasa de Clostridium histolyticum, DPPH: 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil, GC-MS: cromatografia de gasos-massa Espectroscòpia, RT: temperatura ambient, µg GAE/ mg: microgram equivalent d'àcid gàl·lic / mil·ligram, W/V: pes per volum, µg QE/

mg: microgram equivalent de quercetina / mil·ligram, CR HAE: Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata Blanco, CR CAE: Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata Blanco, EC50: Half Maximal Effective Concentration, PMS NADH: Fenazina metosulfat nicotinamida adenina dinucleòtide NBTtrazol: Niblue, , DMSO: sulfòxid de dimetil, APS: persulfat d'amoni, AAPH: diclorhidrat de 2,2-azobis(2-amidino-propà), TROLOX: (±) 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-carboxílic àcid, ORAC: Capacitat d'absorció de radicals d'oxigen, FALGPA: N-[3-(2-Furyl) acriloil)]-Leu-Gly-Pro-Ala, SANA: succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida, Rf: retard Factor, MSD: Detector selectiu de massa

INTRODUCCIÓ

El paper més important de la pell per a un ésser humà és crear una barrera entre l'interior i l'exterior del cos. Internament, la pell abriga i protegeix tot el fenomen fisicoquímic necessari per a la vida, externament és una barrera contra les forces mecàniques. La pell és l'òrgan més gran del cos.[1] És un òrgan molt sensible i es pot danyar fàcilment per infeccions i malalties.

Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la llicència Creative Commons Reconeixement-NoComercial-CompartirIgual 3.0, que permet als altres remesclar, modificar i construir l'obra de manera no comercial, sempre que el s'acredita l'autor i les noves creacions tenen llicència sota els mateixos termes.

Els problemes de la pell poden sorgir a causa de diversos factors com la contaminació ambiental, la sobreexposició als raigs ultraviolats, l'edat de l'individu, els microorganismes nocius, els hàbits alimentaris, l'estrès i els productes químics. El tractament i la cura de la pell és essencial no només per tenir una pell sana, sinó també per al benestar general de la persona.[2]

Un dels principals problemes de la pell en el món actual és l'envelliment prematur de la pell. El procés d'envelliment de la pell s'ha dividit en dues categories: envelliment intrínsec i extrínsec. L'envelliment intrínsec de la pell o l'envelliment natural és causat pels canvis en l'elasticitat de la pell al llarg del temps. L'envelliment extrínsec de la pell és principalment el resultat de l'exposició a la radiació solar (fotoenvelliment). Els radicals lliures formats a causa de l'estrès oxidatiu, juguen un paper important en el curs de l'envelliment tant intrínsec com extrínsec.[3] La pell està formada per tres capes principals; epidermis, dermis i subcutis. Els components principals de la dermis són les fibres de col·lagen i elastina. La reducció del col·lagen i l'elastina condueix aarrugaformació.[4] El principal motiu pel qual la pell comença a enfonsar-se i formar-searruguesés la descomposició de l'elastina i el col·lagen. Els enzims col·lagenasa i elastasa són responsables de la descomposició de diversos components de la matriu extracel·lular (ECM), és a dir, el col·lagen i l'elastina. L'elastina és una proteïna que ajuda a la pell a mantenir-se flexible i ferma. Quan la teva pell està estirada, és l'elastina la que la torna a la seva posició normal. El col·lagen és una proteïna fibrosa. El col·lagen és especial entre les proteïnes per la seva gran resistència a la tracció que proporciona fermesa a la pell.Arruguesresulten d'una combinació d'envelliment intrínsec i extrínsec, així com de l'augment del nivell d'enzims de col·lagenasa i elastasa.[5]

Els cosmètics s'utilitzen regularment i universalment en diferents formes per millorar la bellesa. Els cosmètics per a la cura de la pell tracten la capa superficial de la pell proporcionant una millor protecció contra el medi ambient que la pell que no es tracta.[6] Hi ha una demanda creixent de cosmètics per a la cura de la pell facial. Segons el monitor de dades, la despesa global en productes per a la cura de la pell el 2012 va ser de 82.000 milions de dòlars, on dos terços de la despesa van incloure la cura de la pell facial. Un informe d'investigació i mercats espera que els ingressos de la indústria global de productes per a la cura de la pell superin els 100.000 milions de dòlars el 2018. S'espera que el segment de la cura facial continuï dominant el mercat. La creixent demanda deanti edatproductes i la preocupació creixent per l'ús de productes naturals i orgànics per a la cura de la pell són els principals factors que impulsen la indústria de la cura de la pell.[7] Els cosmètics per si sols no són suficients per cuidar la pell i les parts del cos; requereix associació d'ingredients actius per comprovar el dany i l'envelliment de la pell. Aquests actius d'herbes que contenen ingredients actius són molt essencials per mantenir la salut de la pell. Els cosmètics amb herbes actives estan sorgint com una solució adequada al problema actual.[8] En el present estudi, la pellanti edatEl potencial dels extractes alcohòlics de la pell de Citrus reticulata Blanco es va avaluar mitjançant assaigs in vitro d'antioxidants, anticolagenases i antielastases. C. reticulata Blanco (Rutaceae) es coneix comunament com Narangi o Santra (Taronja). El fruit és laxant, afrodisíac, astringent, tònic i alleuja els vòmits.[9] La pell de la fruita s'utilitza tradicionalment com a tònic, estomacal, astringent, carminatiu i antiescorbutic. La pell de cítrics s'ha considerat un subproducte de la indústria dels cítrics, però s'ha informat que conté diversos components actius a una concentració molt més alta que la polpa.[10] La pell de fruita també és útil per a la cura de la pell.

MATERIALS I MÈTODES

Productes químics i reactius

Àcid ascòrbic, quercetina, clorur fèrric, carbonat de sodi (Na2CO3), nitrit de sodi (NaNO2), hidròxid de sodi (NaOH), clorur d'alumini (AlCl3), 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), elastasa pancreàtica porcina (EC). .3.4.21.36), succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (SANA), col·lagenasa de Clostridium histolyticum (ChC) (EC.3.4.23.3), N-(3-[2-Furyl]acryIoyl)-Leu- Gly-Pro-Ala (FALGPA), sal de sodi de fluoresceïna, diclorhidrat de 2,2-azobis (2-metil propionamidina) (AAPH) i àcid gàlic es van comprar a Sigma Chemical Co. (St. Louis, EUA) 2, 2 '-azino-bis (àcid 3-etilbenzotiazolina-6-sulfònic) diamoni

sal (ABTS), (±) àcid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetra metilcroman-2-carboxílic (TROLOX) adquirit a Fluka, EUA. El tetrazoli blau nitro (NBT), el metosulfat de fenazina (PMS) i la sal disòdica reduïda (NADH) de nicotinamida adenina dinucleòtid es van obtenir de SRL Pvt. Ltd., Bombai, Índia. L'amoni per sulfat (APS) es va comprar a Rankem, Índia.

Recollida de material vegetal

Fruits de C. reticulata Blanco, Rutaceae es van obtenir el gener de 2013 de Bombai (Índia). La identificació taxonòmica del material vegetal va ser confirmada pel Dr. CS Latto, Universitat de Mumbai. L'autenticació es va fer a l'Institut de Recerca Agharkar, Pune.

Extracció de material vegetal

Les fruites es rentaven a fons sota l'aigua. Les peles es van separar de les fruites i es van assecar a l'ombra. A continuació, el material assecat es va sotmetre a la forma en pols i es va emmagatzemar en un recipient hermètic a temperatura ambient. Es van extreure uns 50 g de pols seca amb 300 ml de metanol. Els extractes vegetals es van obtenir mitjançant Soxhlation (CR HAE-Extracte alcohòlic calent de Citrus reticulata) i mètode de maceració (CR CAE-Extracte alcohòlic en fred de Citrus reticulata). L'extracció de Soxhlet es va dur a terme a 65 graus durant 10-12 h. La maceració en fred es va dur a terme per agitació constant; on la barreja de pols vegetal i metanol es va mantenir en un agitador rotatiu (REMI CIS-24 PLUS) i es va establir a 100 rpm a RT durant 72 h. Els extractes es van filtrar amb paper de filtre Whatman núm. 1, i els filtrats es van evaporar a pressió reduïda i es van assecar amb un evaporador rotatiu (R-205, Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Suïssa) a 50 graus. Els extractes secs es van emmagatzemar a 4 graus, en ampolles estèrils, etiquetades i tapades fins a un nou ús.

Anàlisi fitoquímica preliminar d'extractes

Els extractes esmentats anteriorment es van sotmetre a diverses proves fitoquímiques qualitatives per a la identificació dels constituents químics presents al material vegetal segons els mètodes descrits.[11]

Determinació del contingut fenòlic total

El contingut fenòlic total (TPC) es va determinar amb el reactiu Folin - Ciocalteu mitjançant el mètode donat.[12] A 0,5 ml de cada mostra, es van afegir 2,5 ml de dilució 1:10 del reactiu de Folin - Ciocalteau i 2 ml de Na2CO3 (7,5 per cent p/v) i es van incubar a 765 nm mitjançant un espectrofotòmetre ultraviolat visible. Els resultats es van expressar com a µg d'equivalent d'àcid gàlic per mg d'extracte (µg GAE/mg d'extracte).

Determinació del contingut total de flavonoides

El contingut total de flavonoides (TFC) es va mesurar mitjançant l'assaig colorimètric AlCl3.[13]

Es va afegir una alíquota (1 ml) d'extractes o solucions estàndard de quercetina (20, 40, 60, 80 i 100 µg/ml) a un matràs aforat de 10 ml que contenia 4 ml de aigua destil · lada. Al matràs, es van afegir 0,30 ml de NaNO2 al 5% i després de 5 min, es van afegir 0,3 ml de AlCl3 al 10%. Després de 5 min, es van afegir 2 ml de NaOH 1M i es va augmentar el volum fins a 10 ml amb aigua destil·lada. La solució es va barrejar i es va mesurar l'absorbància contra el blanc a 510 nm. El TFC es va expressar com a µg d'equivalent de quercetina per mg d'extracte (µg QE/mg d'extracte).

Assajos d'antioxidants

1, assaig d'eliminació de radicals lliures de 1-difenil-2-picrhidrazil

L'activitat d'eliminació de radicals lliures es va avaluar mitjançant un mètode donat amb algunes modificacions.[14] L'activitat d'eliminació de radicals lliures es va avaluar mitjançant el mètode donat amb algunes modificacions. Es va barrejar un volum d'1 ml de les diferents concentracions (100–800 µg/ml) de mostres de prova amb 200 µl de solució de metanol DPPH (0,36 mg/ml). Després de sacsejar, la barreja es va incubar a la foscor a temperatura ambient durant 30 min, i després es va mesurar l'absorbància a 517 nm. L'àcid ascòrbic es va utilitzar com a control positiu.

Assaig d'eliminació d'anions superòxid del sistema de fenazina metosulfat-NADH

L'activitat d'eliminació del superòxid es va avaluar mitjançant un mètode donat.[15] Tampó Tris HCl (3 ml, 16 mM, pH 8.0) que conté 0,75 ml de solució NBT (50 µM), 0,75 ml NADH ( Es van barrejar una solució de 78 µM) i 0, 3 ml de solució de mostra d'extracte (50–350 µg/ml) en metanol. La reacció es va iniciar quan es van afegir 0,75 ml de solució de PMS (10 µM) a la mescla. La barreja de reacció es va incubar a 25 graus durant 5 minuts i l'absorbància es va llegir a 560 nm contra les mostres en blanc corresponents. L'àcid ascòrbic es va utilitzar com a estàndard.

Assaig d'eliminació de radicals 2, 2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-àcid sulfònic)

L'assaig es realitza segons el mètode donat.[16] Els cations radicals ABTS es van produir fent reaccionar ABTS i APS i incubant la barreja a temperatura ambient a la foscor durant 16 h. En resum, el volum de reacció total contenia 10 mM de PBS pH 7,4 (control positiu o solucions de prova) de diverses concentracions. Es va afegir una solució radical ABTS a una concentració final de 0, 219 mM. La barreja de reacció es va barrejar i es va llegir immediatament a 734 nm mitjançant un lector de microplaques (VERSA max, Molecular devices, EUA). Es va dur a terme una reacció de control sense la mostra de prova. L'àcid gàl·lic es va utilitzar com a control positiu.

La capacitat dels extractes per eliminar els radicals DPPH, PMS-NADH i el radical lliure ABTS es va calcular mitjançant la fórmula següent:

Activitat d'eliminació de radicals (percentatge)=([Abs de control − Abs de mostra]/Abs de control) × 100, on Abs és l'absorbància a la longitud d'ona esmentada en presència o absència dels extractes de prova.

Assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen

Aquest assaig es va realitzar segons el mètode descrit.[17] Una barreja de preincubació de 140 µl contenia - 20 µl de solució de prova o TROLOX de diverses concentracions. Tampó de fosfat de sodi 75 mM, pH 7,4; Es van barrejar 120 µl de fluoresceïna sòdica (117 nM) i es van incubar a 37 graus durant 10 min. Després de la preincubació, es van afegir 60 µl d'AAPH (40 mM) i es van barrejar durant 15 s. La reacció es va dur a terme durant 90 min a 37 graus. Les mesures de fluorescència es van fer amb filtres d'excitació de 485 nm i d'emissió de 520 nm.

Assajos enzimàtics

Assaig anti-collagenasa

L'assaig d'inhibició de la col·lagenasa es va realitzar mitjançant el mètode descrit anteriorment,[18] que es basa en la hidròlisi de FALGPA per col·lagenasa per produir FA-Leu i Gly-Pro-Ala. L'assaig es va realitzar en tampó Tricina 50 mM (NaCl 400 mM i CaCl2 10 mM, pH 7,5). El ChC es va dissoldre al tampó per utilitzar-lo a una concentració inicial de 0, 8 unitats/ml. El substrat sintètic, FALGPA, es va dissoldre al tampó Tricine a 2 mM. Els extractes de mostra es van incubar amb l'enzim al tampó durant 15 minuts abans d'afegir substrat per iniciar la reacció. La barreja de reacció final (75 µl de volum total) contenia 25 µl de tampó Tricina 50 mM, 25 µl d'extracte de prova (250–4000 µg/ml) i 25 µl de 0,1 unitats d'enzim ChC. Els controls realitzats amb tampó Tricina 50 mM com a extractes de prova es van dissoldre en tampó Tricina (50 mM), mentre que la catequina es va utilitzar com a control positiu. Després d'afegir 50 µl de substrat FALGPA 2 mM, es va mesurar immediatament l'activitat de la col·lagenasa a 340 nm durant 20 min mitjançant un lector de microplaques de 96 pous (Bio-Tek M Quant, FLX 800).

Assaig antielastasa

L'assaig emprat es va basar en mètodes de la literatura.[19] Aquest assaig es va realitzar en tampó Tris-HCL de 0.2 mM (pH 8.0). L'elastasa pancreàtica porcina (PE - EC 3.4.21.36) es va dissoldre per fer una solució d'1 mg/ml en tampó Tris-HCL de {{10}}, 2 mM. El substrat N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (SANA) es va dissoldre en tampó a 0,8 mM. Els extractes de prova (0, 156-10 mg/ml) es van incubar amb l'enzim durant 20 min abans d'afegir substrat per començar la reacció. La barreja de reacció final (250 µl total) contenia 50 µl d'extracte de planta, 160 µl de tampó, 20 µl d'enzim i 20 µl de substrat. La catequina es va utilitzar com a control positiu. Els controls negatius es van realitzar mitjançant el tampó Tris-HCL. L'absorbància es va mesurar immediatament a 410 nm i després contínuament durant 20 min mitjançant un lector de microplaques de 96 pous (Bio-Tek M Quant, FLX 800). El percentatge d'inhibició d'aquests dos assajos es calcula mitjançant: Activitat d'inhibició enzimàtica (percentatge)=(1− [B/A]) × 100

On, A=Activitat enzimàtica sense mostra, B=Activitat en presència de mostra.

Anàlisi de cromatografia de gasos-espectrometria de masses

Es van adoptar les condicions següents per a l'anàlisi de cromatografia de gasos i espectrometria de masses (GC-MS).[20]La identificació dels components es va fer mitjançant un cromatògraf de gasos Agilent 7890 A combinat amb un detector selectiu de masses (MSD) inert 5975 C amb un detector de triple eix. Les mostres es van injectar mitjançant Agilent. Mostrador automàtic 7693 a Agilent 19091S-433: columna HP-5MS (30 m × 250 µm × 0,25 µm). L'heli es va utilitzar com a gas portador (1 ml/min). La temperatura de l'injector i del detector es va mantenir a 250 graus. La temperatura de la columna es va programar a 60 graus durant 3 minuts i després es va augmentar fins a 160 graus durant 2 minuts a 10 graus / min. La temperatura addicional es va augmentar fins a 300 graus (a 15 graus / min). Els espectres de masses es van adquirir en un rang d'entre 40 i 500 amu en mode EI. Els compostos eluïts es van identificar comparant les dades espectrals de masses amb les dades estàndard disponibles a la biblioteca del National Institute of Standards and Technology. Els components principals de l'extracte metanòlic de Soxhlet de la pell de C. reticulata Blanco (CR HAE) es van identificar mitjançant anàlisi GC-MS.

Anàlisi estadística

Els valors EC50 es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard, l'anàlisi estadística es va dur a terme mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova de comparació múltiple de Tukey (P <0.05) on="" totes="" les="" mostres,="" és="" a="" dir,="" extractes="" de="" prova.="" i="" l'estàndard="" positiu="" es="" van="" comparar="" entre="" ells.="" tots="" els="" càlculs="" es="" van="" realitzar="" mitjançant="" graphpad="" prism="" (versió="" 5.0,="" graphpad="" software,="">

RESULTATS I DISCUSSIÓ

Anàlisi fitoquímica preliminar d'extractes

L'anàlisi fitoquímica preliminar d'extractes metanòlics de C. reticulata Blanco indica la presència d'hidrats de carboni, aminoàcids, flavonoides, tanins i derivats fenòlics, esteroides, etc., [Taula 1].

Taula 1: Anàlisi fitoquímica preliminar d'extractes metanòlics de pell de Citrus reticulata Blanco

FeCl3 : clorur fèrric; CR HAE: Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata Blanco; CR CAE: Extracte alcohòlic en fred de Citrus reticulata Blanco

Determinació del contingut fenòlic total

Els fenòlics, en particular els polifenols, presenten una gran varietat d'activitats biològiques beneficioses en mamífers, com ara antivirals, antibacterians, immunoestimulants, antial·lèrgics, antihipertensius, antiisquèmics, antiarrítmics, antitrombòtics, hipocolesterolèmics i antilipoperoxidants. , accions hepatoprotectores, antiinflamatòries i anticancerígenes.[21,22] Diversos estudis han demostrat que els flavonoides actuen com a eliminadors d'anions superòxid, oxigen singlet, radicals hidroxil i radicals peroxil lipídics.[23,24] TPC i TFC. es van determinar per als dos extractes mitjançant corbes estàndard [Figura 1]. CR HAE va mostrar un contingut fenòlic més elevat, és a dir, 187,93 ± 4,69 µg GAE/mg d'extracte que CR CAE, és a dir, 58,66 ± 2,40 µg GAE/mg d'extracte. Es va trobar que els TFC per CR HAE i CR CAE eren gairebé similars, és a dir, 171,72 ± 4,13 µg QE/mg d'extracte i 169,88 ± 9,79 µg QE/mg d'extracte, respectivament.

Determinació del contingut total de flavonoides

L'activitat antioxidant no s'ha de concloure en base a una solaantioxidantmodel de prova. A la pràctica, es porten a terme diversos procediments de prova in vitro per avaluar-losantioxidantactivitats amb les mostres d'interès.[25] En el present estudi, hem avaluatantioxidantpotencial de CR HAE i CR CAE per diversosantioxidantassajos que inclouen assaig d'eliminació de radicals lliures DPPH, assaig d'eliminació d'anions superòxid, assaig d'eliminació de radicals ABTS i assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen (ORAC).

Assajos d'antioxidants

1, assaig d'eliminació de radicals lliures de 1-difenil-2-picrhidrazil

L'assaig d'eliminació de radicals lliures DPPH és un dels assaigs més utilitzats per provar l'activitat preliminar d'eliminació de radicals d'extractes de plantes. ElantioxidantL'activitat dels extractes de plantes que contenen components polifenols es deu a la seva capacitat de donar àtoms d'hidrogen o electrons i eliminar els radicals lliures.[26] Així, el color porpra del DPPH es reduirà a ,-difenil--picrilhidrazina (groc). Els resultats indiquen que CR HAE i CR CAE van mostrar fins a un 85 per cent de l'eliminació de radicals lliures DPPH [Figura 2]. L'àcid ascòrbic es va utilitzar com a control positiu i va mostrar una activitat d'eliminació de fins a un 92 per cent. CR HAE va mostrar una mica més altantioxidantactivitat que CR CAE. Els valors EC50 (µg/ml) es van expressar a la taula 2.

Assaig d'eliminació d'anions superòxid del sistema de fenazina metosulfat-NADH Tot i que l'anió superòxid és un oxidant feble, finalment produeix

Taula 2: valor EC dels extractes metanòlics de Citrus reticulata Blanco Peel per a assaigs de DPPH, superòxid, ABTS, anticolagenasa i antielastasa

radicals hidroxil potents i perillosos, així com l'oxigen singlet, que contribueixen a l'estrès oxidatiu.[27] Els radicals superòxids generats a partir de l'oxigen dissolt per l'acoblament PMS-NADH i es poden mesurar per la seva capacitat de reduir NBT. La disminució de l'absorbància a 560 nm amb l'extracte vegetal indica la seva capacitat per apagar els radicals superòxids a la barreja de reacció. CR HAE va mostrar una forta activitat d'eliminació de superòxids que CR CAE [Figura 3]. L'àcid ascòrbic es va utilitzar com a control positiu i elimina l'anió superòxid fins a un 52 per cent. Els valors EC50 (µg/ml) es van calcular i expressar a la taula 2. Es va trobar que CR HAE era més efectiu (P <0,05) que="" cr="" cae,="" ja="" que="" mostrava="" menys="" valor="" ec50="" (µg/ml)="" i="">antioxidantactivitat.

Assaig d'eliminació de radicals 2, 2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-àcid sulfònic)

L'assaig ABTS es basa en l'eliminació de la llum per part dels radicals ABTS. Anantioxidantamb la capacitat de donar un àtom d'hidrogen apagarà el radical lliure estable, un procés que s'associa amb un canvi en l'absorció, que es pot seguir espectrofotomètricament.[28] L'activitat ABTS es va quantificar en termes de percentatge d'inhibició del catió radical lliure ABTS perantioxidantsen cada mostra. Els valors ABTS de CR HAE, CR CAE i àcid gàlic es van presentar a la taula 2. CR HAE i CR CAE van mostrar una activitat d'eliminació de radicals ABTS de manera dependent de la concentració i observada fins al 59 per cent. L'àcid gàl·lic va mostrar fins al 79 per cent de la capacitat d'eliminació d'ABTS [Figura 4]. Els valors EC50 (µg/ml) obtinguts per CR HAE i CR CAE no van indicar cap diferència significativa (P <0, 05)="" i="" van="" suggerir="" que="" tots="" dos="" extractes="" tenen="" un="" potencial="" d'eliminació="" d'abts="" gairebé="">

Assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen

L'assaig ORAC es considera un assaig més rellevant biològicament que altres mètodes de mesuraantioxidantpotència perquè mesura les reaccions de transferència d'àtoms d'hidrogen i simula in vivoantioxidantacció.[29] També mesura com els components solubles en aigua i liposolubles d'una substància natural protegeixen un objectiu normalitzat de l'oxidació per nitrit de peroxil, radicals hidroxil, anió superòxid i

singlet d'oxigen i genera una puntuació basada en la comparació amb unantioxidant[30]En el present estudi, hem mesurat els valors d'ORAC per CR HAE i CR CAE i expressats en termes de TROLOX (mmoles TROLOX Equivalent/g de substància) [Figura 5]. CR HAE va mostrar un valor ORAC més alt (1243 mmol d'equivalent TROLOX/g de substància) que CR CAE (1063 µmols d'equivalent TROLOX/g de substància) [Taula 2].

Assajos enzimàtics

Assaig anti-collagenasa

Les metaloproteinases de matriu (MMP) són una família d'enzims proteolítics que degraden diversos components de l'ECM. La col·lagenasa és un dels membres de les famílies MMP i és responsable de la degradació del col·lagen. La col·lagenasa del bacteri C. histolyticum (ChC) (C 3.4.24.3) és una de les poques proteïnases capaç de degradar la regió de triple hèlix del col·lagen natiu en condicions fisiològiques i condicions in vitro utilitzant pèptids sintètics com a substrats. L'efecte protector dels extractes de plantes contra l'enzim col·lagenasa es pot estudiar mitjançant ChC i substrat sintètic FALGPA.[31] En el present estudi, es va avaluar l'activitat d'inhibició de la col·lagenasa per a CR HAE i CR CAE. La catequina es va utilitzar com a control positiu. Els resultats van demostrar que l'extracte CR HAE era més eficaç per inhibir l'enzim col·lagenasa que CR CAE i va mostrar una inhibició de fins a un 76 per cent [Figura 6]. L'eficàcia es va mesurar en termes de valor EC50 (µg/ml) i es va expressar a la taula 2.

Assaig antielastasa

L'elastasa és l'únic enzim capaç de degradar l'elastina. La inhibició de l'enzim elastasa pot retenir l'elasticitat i la flexibilitat de la pell.[32] En termes deanti edat, trobar inhibidors dels enzims d'elastasa pot ser útil

per evitar la pèrdua d'elasticitat de la pell i, per tant, la flacciditat de la pell. En l'assaig antielastasa, l'elastasa pancreàtica porcina es va analitzar espectrofotomètricament utilitzant [N-Succ-(Ala) 3-p-nitroanilida] com a substrat, i la quantitat de p-nitroanilina es va determinar mesurant l'absorbància a 41 {{ 6}} nm. Es van investigar els efectes inhibidors de CR HAE i CR CAE sobre l'activitat de l'elastasa. La catequina es va utilitzar com a control positiu. CR HAE va mostrar un fort percentatge d'activitat d'inhibició de l'elastasa en comparació amb CR CAE i es va observar fins a un 80 per cent d'inhibició [Figura 7]. Els valors EC50 (mg/ml) es van expressar a la taula 2 i es va observar que CR HAE era més potent que CR CAE (P <0, 05).="" es="" va="" trobar="" que="" el="" valor="" ec50="" obtingut="" per="" a="" la="" catequina="" era="" molt="" menor,="" indicant="" la="" seva="" forta="" activitat="" anti-elastasa="" i="" el="" seu="" paper="" com="" a="">anti edatcomponent. Kim et al., 2004 van demostrar que la catequina i el galat d'epigalocatequina aïllats del te verd (Camellia sinensis) eren potents inhibidors de l'elastasa.

Anàlisi de cromatografia de gasos-espectrometria de masses

CR HAE va mostrar més altantioxidanti habilitats anti-envelliment en comparació amb CR CAE; per tant, es va realitzar una anàlisi GC-MS de CR HAE per entendre els components presents en ell. Es van identificar un total de 20 compostos diferents i es van presentar a la taula 3. El cromatograma va mostrar 20 pics en el temps de retenció oscil·lant entre 2, 95 min i 44, 45 min [Figura 8]. El pic més gran als 44,11 min amb un 44,37 per cent d'àrea es va identificar com àcid butilfosfònic, pentil 4-(2-fenilprop-2-il) fenil èster. Zab et al., 2012[33] van informarantioxidanti activitat antitumoral de l'àcid butilfosfònic, pentil 4-(2-fenilprop-2-il) fenil èster present a l'extracte etanòlic de C.reticulata. Un altre compost principal trobat va ser 4H-1-Benzopiran-4-ona, 2-(3, 4- dihidro) o 4-cromanona (21,43 per cent d'àrea), que és un tipus de

flavanona. Di Majo et al., 2005[34] van aïllar les flavanones dels cítrics i van mostrar que depenen de l'estructura.antioxidantactivitat. Altres compostos 3', 4', 5, 7, 8-Pentametoxiflavona i 4', 5, 7, 8-Tetrametoxiflavona són tipus de polimetoxiflavona (PMF). El PMF presenta un ampli espectre d'activitats biològiques. Recentment, Ho et al., 2012[35] van aïllar i identificar PMF hidroxilats de les pells de cítrics i van investigar les seves activitats biològiques, incloses les propietats antiinflamatòries i quimiopreventives del càncer. Altres compostos identificats inclouen D-Limonene (1,46 per cent d'àrea), 4H-Pyran-4-ona, 2, 3-dihidro-3, 5-dihidroxi-6-metil (1,46 per cent d'àrea), 2-Metoxi-4-vinilfenol ( 1,67 per cent d'àrea) i àcid n-hexadecanoic (2,51 per cent d'àrea) i podria estar relacionat amb elanti edatpotencial de la pela blanca de C. reticulata. Les estructures de tots els compostos identificats es van presentar a la figura 9.

CONCLUSIÓ

Els extractes de C. reticulata Blanco es van avaluar contra l'envelliment de la pell mitjançant in vitroantioxidant, assajos anti-colagenasa i anti-elastasa. L'estudi va demostrar que l'extracte metanòlic (Soxhlation) mostrava prometedorsantioxidanti activitat antienzimàtica i es pot utilitzar com a potentanti arruguesagent aanti edatformulacions per a la cura de la pell.

Reconeixement

Els autors agraeixen a Underwriters Lab (UL), Bangalore, Índia, per l'anàlisi GC-MS i els remeis naturals, Bangalore, Índia, per l'anàlisi ORAC.

Suport econòmic i patrocini

Nil.

Conflictes d'interès

No hi ha conflictes d'interessos.