Contacte:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui-ying Shi|Ya-jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche té un efecte anti-envelliment

Resum

Fons: La disminució relacionada amb el temps de la capacitat regenerativa i de l'homeòstasi dels òrgans és una característica importantenvelliment. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus s'han utilitzat com a herbes medicinals tradicionals xineses per millorar la immunitat i perllongar la vida. Tanmateix, es desconeix el mecanisme pel qual aquest medicament a base d'herbes frena l'envelliment. En aquest estudi, hem investigat el mecanisme de l'herbaefecte anti-envelliment.

Mètodes: Els ratolins van ser alimentats amb dietes complementades amb R. glutinosa o A. membranaceus durant 10 mesos; el grup control va rebre una dieta estàndard. Els fenotips es van avaluar mitjançant un sistema de qualificació i anàlisi de supervivència. Els percentatges dels fenotips de senescència de les cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) es van determinar mitjançant l'anàlisi de classificació de cèl·lules activades per fluorescència. La funció i el mecanisme dels HSC es van analitzar mitjançant assaig clonogènic i la reacció en cadena de la polimerasa en temps real.

Resultats: Elefecte anti-envellimentde R. glutinosa es deu a la funció millorada dels HSC. Els ratolins alimentats amb R. glutinosa mostraven característiques d'un ralentimentenvellimentprocés, inclosa la disminució de la senescència i l'augment de la taxa de supervivència. L'anàlisi de citometria de flux va mostrar un nombre reduït de cèl·lules Lin-Sca1 més c-kit- (LSK), HSC a llarg termini (LT-HSC) i HSC a curt termini (ST-HSC) al grup de R. glutinosa. In vitro, els assajos clonogènics van mostrar una capacitat d'autorenovació augmentada dels LT-HSC del grup R. glutinosa, així com mantenir la quiescència de LSK mitjançant l'expressió p18 regulada. El grup de R. glutinosa també va mostrar una disminució dels nivells d'espècies reactives d'oxigen i el percentatge de cèl·lules ‐gal plus mitjançant la regulació a la baixa de la proteïna p53 i p16 associada a la senescència cel·lular.

Conclusió: Rehmannia glutinosa exerceixanti edatefectes mantenint la quiescència i disminuint la senescència dels HSC.

PARAULES CLAU: anti-envelliment, cèl·lules mare hematopoètiques, quiescència, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUCCIÓ

L'envelliment es defineix com el declivi funcional depenent del temps que afecta la majoria d'organismes vius.1 La longevitat dels organismes la mantenen principalment les cèl·lules mare.2 Les cèl·lules mare específiques dels teixits tenen la capacitat d'autorenovar-se i diferenciar-se en una varietat de cèl·lules efectores. 3 No obstant això, durant el procés d'envelliment, aquesta capacitat d'autorenovació disminueix, i finalment condueix a l'acumulació de teixits danyats no reparats en organismes vells.4 Pèrdua de la capacitat de mantenir un equilibri entre la quiescència i la diferenciació a la cèl·lula mare/progenitora. compartiment pot provocar la mort o malalties associades a l'edat.2 A més, estudis recents suggereixen que el rejoveniment de les cèl·lules mare pot revertir el fenotip d'envelliment.5,6 En el sistema hematopoètic, les cèl·lules mare hematopoietiques (HSC) són les responsables de la producció de cèl·lules sanguínies. En ratolins envellits, el sistema hematopoètic mostra un deteriorament de les cèl·lules limfoides T i B i augmenta el nombre de cèl·lules mieloides. Els HSC envellits van mostrar una activitat d'autorenovació reduïda i una capacitat de reconstrucció de l'hematopoiesi reduïda. En particular, els canvis relacionats amb l'edat en el compartiment HSC es manifesten en l'hoste envellit com a anèmia, augment de la propensió a les neoplàsies mieloproliferatives, disminució de la funció immune i augment de la incidència del càncer.7-9 Tanmateix, el mecanisme de l'envelliment de l'HSC i es desconeixen els efectes de les herbes medicinals sobre l'envelliment de l'HSC.10

La gent s'ha preocupat per retardar el procés d'envelliment i mantenir-se jove des de l'antiguitat ianti edatés un focus actual de recerca. La medicina tradicional xinesa ha rebut una atenció creixent per al tractament de diverses malalties associades a l'envelliment. Se sap que moltes herbes utilitzades en la medicina tradicional xinesa tenen efectes positius contra l'envelliment mitjançant diferents mecanismes. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus s'han utilitzat àmpliament d'aquesta manera durant milers d'anys.

Rehmannia glutinosa s'utilitza per tractar diversos trastorns diabètics, millorar el metabolisme ossi en l'osteoporosi i inhibir la inflamació i la fibrosi del fetge. A més, aquesta herba té altres efectes, inclososantifatiga, propietats antidepressives i neuroprotectores. En els darrers anys, els estudis farmacològics sobre R. glutinosa i els seus components actius s'han centrat principalment en les seves àmplies accions sobre els sistemes sanguini, endocrí, cardiovascular i nerviós.11-14 Així, es va demostrar que R. glutinosa posseïa una forta immunitat. ‐activitat de millora, que ha proporcionat la base teòrica per a estudis posteriors.

Astragalus membranaceus posseeix propietats tòniques, hepatoprotectores, diürètiques i expectorants15 i s'ha demostrat que presenta immunomoduladors,16antiinflamatori,iantioxidantefectes.17 L'elucidació dels mecanismes moleculars subjacents als efectes de la medicina tradicional xinesa en la pràctica clínica és un pas clau cap a la seva aplicació mundial, i aquest tema és actualment un tema d'intens interès de recerca.

Així, en aquest estudi, hem alimentat dietes de ratolins complementades amb R. glutinosa i A. membranaceus durant 10 mesos per explorar el mecanisme subjacent a la capacitat de R. glutinosa per augmentar la longevitat.

2|MATERIALS I MÈTODES

2.1|Agrupació i tractament d'animals

Les ratolins femelles C57BL/6J es van mantenir en un entorn lliure de patògens i es van alimentar amb una dieta estàndard. L'ús d'animals en aquest estudi va ser aprovat pels Comitès d'Ús i Cura d'Animals de l'Institut de Ciències dels Animals de Laboratori del Peking Union Medical College. Els ratolins (de 10 mesos) es van dividir aleatòriament en tres grups (n=20/grup). El grup control va ser alimentat amb una dieta estàndard (Beijing HFK Biosicence, Beijing, Xina). Les dietes dels altres dos grups es van complementar amb R. glutinosa mòlta i A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Beijing, Xina), respectivament, a una dosi de 200 mg/d durant 10 mesos. Aquesta dosi es va seleccionar mitjançant el mètode de normalització de la superfície corporal per confirmar les dosis de fàrmacs des d'estudis humans fins a estudis de ratolí. El pes corporal es va determinar cada 2 mesos i la supervivència es va registrar diàriament.

2.2|Avaluació del grau de senescència

Es va adoptar un sistema de qualificació per avaluar el grau de senescència d'acord amb els criteris definits per Takeda et al.18 Cada categoria enumerada en el protocol es va seleccionar entre els signes clínics associats al procés d'envelliment. Cada ratolí es va puntuar als 18 mesos d'edat i es va sumar la puntuació de cada categoria per determinar la puntuació global de la qualificació.

2.3|Citometria de flux

Es van recollir cèl·lules del tim, la melsa, la sang perifèrica (PB) i la medul·la òssia (BM). La melsa i el tim es van extirpar immediatament, es van rentar amb solució salina i es van pesar. Les melses i els timus es van homogeneïtzar suaument en un homogeneïtzador de vidre i les cèl·lules es van suspendre en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) estèril. Les cèl·lules de PB es van aplicar a la lisi de glòbuls vermells de la sang (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Les cèl·lules de BM es van aïllar rentant tant les tíbies com els fèmurs amb PBS estèril. Totes les cèl·lules es van aïllar per filtració a través d'una malla de niló estèril i es van tacar durant 30 minuts a 4 graus amb els següents anticossos conjugats amb fluoròfors: anti-CD3 conjugat amb ficoeritrina (PE) (G4.18), anti conjugat amb al·loficocianina (APC). - CD4 (OX35) i anti-CD8a conjugat amb PE-Cy7 (OX8). Per a les cèl·lules BM, els marcadors de llinatge es van tenyir mitjançant CD4 antiratolí conjugat amb biotina (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), També es va obtenir TER119 (TER‐119) i Gr1 (RB6‐8C5), seguit de la tinció amb l'anticòs APC-eFluor 780-estreptavidina conjugada d'eBioscience (San Diego, CA, EUA). Per a la tinció superficial es van utilitzar els anticossos següents: immunoglobulina APC (Ig) M (II/41), isotiocianat de fluoresceïna (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca-1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) i PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Tots els anticossos es van obtenir d'eBiosciences (San Diego, CA, EUA). Les dades van ser adquirides per un FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) i analitzat mitjançant el programari FlowJo (Three Star, Ashland, OR, EUA).

2.4|Anàlisi del cicle cel·lular

Per a l'anàlisi del cicle cel·lular, les cèl·lules BM totals es van tacar per a marcadors de superfície de cèl·lules mare (Lin–Sca‐1 més c‐KitHigh; LSTKs), després es van fixar i permeabilitzar (00-5123-43; Becton Dickinson; ) abans de tenyir amb FITC Ki-

anticossos 67 i 7-aminoactinomicina D (7-AAD). L'adquisició de dades es va realitzar a FACS Aria II (Becton Dickinson). Les dades es van analitzar mitjançant el programari FlowJo.

2,5|Tinció ‐gal associada a la senescència

L'activitat associada a la senescència (SA)--gal també es va analitzar mitjançant citometria de flux mitjançant C12FDG tal com descriu el fabricant (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Breument, les cèl·lules mare es van tacar primer per als marcadors de la superfície cel·lular i després es van incubar amb 100 nmol L-1 bafilomicina A1 durant 1 hora a 37 graus per induir l'alcalinització lisosomal. Després del rentat amb PBS, les cèl·lules es van incubar amb 2 mmol L-1 C12FDG durant 1-2 hores a 37 graus i després es van analitzar amb un FACS Aria I (Becton Dickinson).

2,6|Determinació de la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS).

Les cèl·lules es van incubar amb diacetat de dicloro-dihidro-fluoresceïna (DCFH-DA; Beyotime, Xangai, Xina) a 37 graus durant 20 minuts. DCFH-DA es difon passivament a les cèl·lules, on és desacetilat per esterases per formar 2′,7′-diclorofluoresceïna no fluorescent (DCFH). La quantitat de fluorescència emesa es correlaciona amb la quantitat de ROS a la cèl·lula. Les dades es van adquirir en un FACS Aria I (Becton Dickinson) i es van analitzar mitjançant el programari FlowJo.

2,7|Anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real

L'ARN total es va extreure de les cèl·lules mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. Els gens d'interès es van amplificar a partir d'ARN totals tractats amb DNasa I mitjançant la transcriptasa inversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA)

i primers poli-dT. Els primers utilitzats per a la PCR van ser els següents: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ i 5′‐CGAAGAGACAACGG- CACACT‐3′, Tm=60 grau, 30 cicles), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC-TATC‐ 3′ i 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grau , 35 cicles), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ i 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 grau , 35 cicles), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ i 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grau, 30 cicles), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3′ i 5′‐GTAGTGTGGGGTCCTC ′, Tm=61 grau , 35 cicles), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ i 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grau, 30 cicles), gliceraldehid 3‐fosfat deshidrogenasa (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ i 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, grau Tm=60 , 25 cicles). La PCR en temps real (RT) es va dur a terme mitjançant SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japó) al sistema de detecció ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

2,8|Assajos clonogènics

Els HSC a llarg termini (LT) es van classificar mitjançant la classificació cel·lular activada per fluorescència (FACS) i després es van cultivar en plaques cel·lulars de 96 pous mitjançant un medi de base de metilcel·lulosa (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) . Es van preparar deu pous replicats per a cada mostra. Hem utilitzat placa de cultiu cel·lular de 96 pous, tres cèl·lules per pou. Dues setmanes després del sembrat, el nombre i la mida de les colònies es van comptar sota un microscopi.

2,9|Anàlisi estadística

Les dades es van analitzar mitjançant l'ANOVA unidireccional mitjançant el programari Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA) i GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Les dades es van presentar com a mitjana ± SD. Es va considerar que P < 0,05="" indicava="" significació="">

3|RESULTATS

3.1|R. glutinosa i A. membranaceus van exercir efectes anti-envelliment

Per confirmar elefectes anti-envellimentde R. glutinosa i A. membranaceus, vam investigar els efectes de l'administració com a suplement dietètic (200 mg/d). Posteriorment, vam registrar el pes corporal, el grau de senescència i la taxa de supervivència dels ratolins. El pes corporal dels ratolins que s'alimentaven amb R. glutinosa o A. membranaceus era normal en comparació amb els del grup control, tot i que hi va haver una disminució del pes corporal del grup R. glutinosa i A. membranaceus als 20 mesos (figura 1A). L'anàlisi del grau de senescència va revelar un augment constant i irreversible de la puntuació de qualificació amb l'avançament de l'edat en els grups R. glutinosa i A. membranaceus en comparació amb el grup control, tot i que l'augment va ser més marcat en el A. membranaceus. grup (figura 1B). L'alta puntuació de qualificació es va deure a un inici més precoç de la pèrdua de passivitat i reactivitat, pèrdua de brillantor de la pell i augment de la tosquetat, pèrdua de cabell, lesions perioftàlmiques, augment de la lordocifosi de la columna i un augment més marcat de la seva gravetat.18 Ratolins a l'A. El grup de ratolins membranaceus va mostrar característiques del fenotip de senescència més marcades, inclosa la pèrdua de brillantor de la pell i la pèrdua de cabell. Les corbes de supervivència van mostrar que la vida útil dels ratolins dels grups R. glutinosa i A. membranaceus era lleugerament més llarga que la del grup de control (Figura 1C). Aquestes dades van confirmar elefectes anti-envellimenttant de R. glutinosa com d'A. membranaceus, tot i que es va trobar que R. glutinosa era més eficient per frenar el procés d'envelliment.

FIGURA 1 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus tenienefectes anti-envelliment. Els ratolins van ser alimentats amb dietes complementades amb R. glutinosa mòlta o A. membranaceus (200 mg/d); el grup control va rebre una dieta estàndard. A, Canvis en el pes corporal dels ratolins mesurats cada 2 mesos. B, Canvis en la puntuació de la classificació de la senescència dels ratolins amb l'edat. C, Corbes de supervivència. Les dades representen la mitjana ± SD; n=20 ratolins/grup. Les dades representen la mitjana ± SD; n=5 ratolins/grup.* P <0,05, ***p=""><>

3.2|R. glutinosa va reduir el nombre de cèl·lules mare hematopoètiques

Es creu que l'esgotament de les cèl·lules mare és la conseqüència integradora de múltiples tipus de danys associats a l'envelliment i una de les principals causes de l'envelliment dels teixits i de l'organisme.1 Estudis recents suggereixen que el rejoveniment de les cèl·lules mare pot revertir el fenotip de l'envelliment a nivell de l'organisme.5 va plantejar la hipòtesi que elefectes anti-envellimentde R. glutinosa estan mediats per la millora de la funció de les cèl·lules mare. Per tant, vam realitzar una anàlisi citomètrica de flux del nombre de cèl·lules mare/progenitores hematopoètiques aïllades de ratolins (de 20 mesos) alimentades amb dietes complementades amb R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/d) durant 10 mesos (Figura 2A) . El percentatge de LSK es va reduir als grups R. glutinosa i A. membranaceus (figura 2B). El nombre de LT i HSC a curt termini (ST) es va reduir aproximadament el doble en el grup de R. glutinosa en comparació amb el nombre del grup control (figura 2C-D). Es van detectar un nombre més gran de progenitors limfoides comuns (CLP) al grup de R. glutinosa en comparació amb el nombre del grup control (figura 2I). No hi va haver diferències en el nombre de progenitors multipotents (MPP), progenitors mieloides comuns (CMP), progenitors granulòcits-macròfags (GMP) i progenitors megacariocits-eritroides (MEP) en el grup de R. glutinosa en comparació amb el nombre del grup R. glutinosa. grup de control. En el grup A. membranaceus, no hi va haver cap diferència significativa en el nombre de LT- i ST- HSC en comparació amb els nombres del grup control (figura 2C-D). A més, no hi va haver cap diferència en el nombre de cèl·lules MPP, CMP, MEP i CLP en comparació amb els nombres del grup control (figura 2E, 2F, 2H i 2I); tanmateix, el nombre de GMP es va reduir al grup A. membranaceus. Així, els ratolins alimentats amb dietes complementades amb R. glutinosa van mostrar un nombre reduït de cèl·lules mare hematopoètiques i progenitores.

3.3|R. glutinosa va millorar la funció i va mantenir la quiescència dels HSC

Per avaluar la funció dels HSC, es va examinar in vitro el potencial clonogènic dels LT‐ HSC. Vam classificar les cèl·lules LT-HSCs en un medi de base de metilcel·lulosa mitjançant FACS i vam comptar el nombre i la mida de les colònies després de 14 dies. En comparació amb el nombre i la mida de colònies produïdes per cèl·lules de ratolins del grup control, les cèl·lules de ratolins del grup de R. glutinosa van mostrar un augment en el nombre de colònies, especialment per a la mida petita (P=0,0241). ) i un clon de gran mida (P=0.0418), mentre que no hi va haver cap diferència en el nombre de ratolins del grup A. membranaceus (figura 3). L'augment de la mida i el nombre de colònies al grup de R. glutinosa va suggerir que aquesta herba millora el potencial d'autorenovació dels LT‐ HSC.

La majoria dels HSC en ratolins adults romanen quiescents;19, per tant, el manteniment de la quiescència cel·lular és un mecanisme essencial per a l'autorenovació de les cèl·lules mare.20,21 Les disminucions observades en les HSC suggereixen una disminució de la proliferació cel·lular a R. glutinosa i grups A. membranaceus; per tant, vam examinar l'estat del cicle cel·lular dels HSC mitjançant l'anàlisi del marcador de cèl·lules proliferatives Ki-67 combinat amb la determinació del contingut d'ADN 7-AAD a la població LSK. Vam observar un augment del nombre de cèl·lules LSK a la fase G0 als grups R. glutinosa i A. membranaceus en comparació amb el grup control (figura 4A). Aquests resultats van indicar que R. glutinosa i A. membranaceus van mantenir la quiescència dels HSC.

L'anàlisi de PCR en temps real dels reguladors del cicle cel·lular a les cèl·lules LSK va revelar que p18, p19 i p57 tenien un paper crític en el manteniment de la quiescència HSC.22-24 No es van observar canvis evidents per a p57 i p19 (Figura 4C-). D), i p18 es va incrementar al grup R. glutinosa en comparació amb el grup control, i lleugerament regulat al grup A. membranaceus (figura 4B).

FIGURA 2 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus van afectar el nombre de cèl·lules mare/progenitores hematopoietiques. Ratolins (envellits

20 mesos) es van alimentar amb dietes complementades amb R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/d) durant 10 mesos (n=5/grup); el grup control va rebre una dieta estàndard. Les cèl·lules de medul·la òssia (BM) acabades d'aïllar es van tacar amb els anticossos indicats i es van analitzar mitjançant citometria de flux. A, Perfils de tinció representatius de les poblacions de cèl·lules mare hematopoètiques i progenitores BM. B, El percentatge de cèl·lules Lin–Sca1 més c-kit– (LSK) a les cèl·lules BM. C‐ I, Nombres de cèl·lules de (C) a llarg termini (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus –, Flt3–); D, curt termini (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, progenitor multipotent (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, progenitor mieloide comú (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, progenitor granulòcit-macròfag (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, progenitor megacariocit‐eritroide (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); i jo, progenitor limfoide comú (CLP; Lin–, Sca‐ 1low, c‐Kitlow, CD127 plus). Les dades representen la mitjana ± SD; n=5 ratolins/grup. *P <0,05, **p=""><>

3.4|R. glutinosa va retardar la senescència dels HSC

La suplementació dietètica a llarg termini amb R. glutinosa pot allargar la vida útil dels ratolins. La senescència cel·lular augmenta amb l'edat; per tant, es va investigar la senescència de HSC en ratolins envellits mitjançant anàlisi citomètrica de flux d'HSC tenyits de SA--gal mitjançant un substrat fluorescent--gal (C12FDG).25 El percentatge de cèl·lules positives de SA--gal va disminuir en el Grup R. glutinosa, que indica que la R. glutinosa retarda la senescència de les cèl·lules LSK (figura 5A).

Les espècies reactives d'oxigen tenen un paper important en la senescència HSC, i la pèrdua de quiescència HSC es correlaciona freqüentment amb l'augment de ROS cel·lular.26 L'anàlisi de les ROS intracel·lulars en LSKs va mostrar que els nivells es van reduir en el grup de R. glutinosa en comparació amb els del control. grup (figura 5B). Aquestes dades van indicar que R. glutinosa pot mantenir la quiescència de l'HSC i millorar la funció de l'HSC mitjançant la disminució dels nivells de ROS.

A continuació, vam investigar l'expressió de diversos gens implicats en la senescència cel·lular mitjançant l'anàlisi RT-PCR de cèl·lules LSK. Comparat

FIGURA 3 Funció de les cèl·lules mare hematopoètiques millorada per la suplementació dietètica de Rehmannia glutinosa. Potencial clonogènic in vitro de cèl·lules estelades hepàtiques a llarg termini de ratolins (n ​​= 3)

amb el grup control, l'expressió de les proteïnes p53 i p16 associades a la senescència cel·lular es va reduir a la baixa en el grup de R. glutinosa (Figura 5D-E). Però l'expressió de p53 i p16 no es va reduir significativament entre el grup A. membranaceus i el grup control (figura 5D-E). En conjunt, aquestes dades mostren que diversos gens clau relacionats amb el cicle cel·lular i la senescència cel·lular regulen la funció dels HSC en ratolins alimentats amb dietes complementades amb R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa va millorar la immunitat de les cèl·lules B

Els limfòcits B i T són importants per a les respostes immunològiques. Els limfòcits T tenen un paper crític en la immunitat cel·lular i la seva regulació, mentre que els limfòcits B participen principalment en la immunitat humoral. La proliferació de limfòcits és l'índex més immediat que reflecteix la immunitat orgànica. Per investigar el paper en la millora immunològica, es van examinar els efectes de R. glutinosa i A. membranaceus sobre la proliferació de limfòcits.

Els ratolins del grup R. glutinosa van mostrar un nombre reduït d'HSC i un augment del nombre de CLP. L'anàlisi citomètrica de flux va mostrar un augment del nombre de cèl·lules B madures (B220 plus) al PB, BM i la melsa de ratolins del grup R. glutinosa en comparació amb els nombres detectats al grup control (Figura 6A); tanmateix, no hi va haver diferències significatives en el nombre de cèl·lules T (CD4 plus i CD8 plus), monòcits i granulòcits (CD11b plus) entre els dos grups (figura 6B-D). Així, aquests resultats indiquen que la dieta R. glutinosa millora la immunitat de les cèl·lules B.

FIGURA 4 Els suplements dietètics de Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus van mantenir la quiescència de les cèl·lules mare hematopoètiques. A, El percentatge de cèl·lules en cada fase del cicle cel·lular. Anàlisi citomètrica de flux de la tinció de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) i Ki-67 de cèl·lules Lin-Sca1 més c-kit- (LSK). B, anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa en temps real de l'expressió gènica de cèl·lules LSK ordenades; Es va utilitzar GAPDH per a la normalització. Les dades representen la mitjana ± SD de tres experiments. *P <0.05, **p=""><0,01, ***p=""><>

FIGURA 5 La suplementació dietètica de Rehmannia glutinosa va reduir la senescència de cèl·lules estelades hepàtiques (HSC). Els ratolins (de 20 mesos) van ser alimentats amb dietes complementades amb Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/d) durant 10 mesos (n {{4} }}/grup); el grup control va rebre una dieta estàndard. A, Anàlisi citomètrica de flux de cèl·lules positives SA--gal-Lin-Sca1 més c-kit- (LSK) mitjançant un substrat fluorescent-galactosidasa (C12FDG). B, El percentatge de cèl·lules positives d'espècies reactives d'oxigen (ROS) a les LSK. Anàlisi citomètrica de flux de LSKs ROS-positius. Les dades representen la mitjana ± desviació estàndard (DE). *P <0,05, ***p=""><0,001. c,="" el="" patró="" d'expressió="" dels="" gens="" associats="" a="" la="" senescència="" cel·lular="" a="" les="" lsk;="" es="" va="" utilitzar="" gapdh="" per="" a="" la="" normalització.="" les="" dades="" representen="" la="" mitjana="" ±="" sd="" de="" tres="" experiments.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><>

4|DISCUSSIÓ

En aquest estudi, hem investigat el mecanisme de laefectes anti-envellimentde R. glutinosa o A. membranaceus complementant les dietes dels ratolins amb les herbes a una dosi de 200 mg/dia durant 10 mesos. Es va trobar que R. glutinosa mostrava efectes anti-envelliment, inclosa una disminució de la senescència i una supervivència augmentada dels HSC, així com

millora de la immunitat de les cèl·lules B. Pel que fa al mecanisme de laefectes anti-envelliment, vam trobar que la R. glutinosa va disminuir el nombre de HSC, mentre que la capacitat de proliferació va augmentar. A més, R. glutinosa va mantenir la quiescència HSC i va disminuir el nombre de cèl·lules positives SA-gal i els nivells de ROS mitjançant la regulació de p18, p53 i p16. En combinació, els nostres resultats van confirmar queefectes anti-envellimentde R. glutinosa en ratolins es medicamenten mantenint la quiescència i millorant la funció dels HSC.

Rehmannia glutinosa, que s'ha utilitzat com a medicina herbal tradicional xinesa durant milers d'anys, es pot utilitzar per tractar la hipoglucèmia en diversos trastorns diabètics.27,28 També s'ha informat que l'extracte de R. glutinosa millora el metabolisme ossi.29 A més, R. glutinosa inhibeix les respostes inflamatòries i les síndromes,30,31 i protegeix contra el dany cel·lular eliminant els radicals lliures.14,32 En aquest estudi, vam trobar que la suplementació dietètica de ratolins amb R. glutinosa exerciaefectes anti-envellimenti millora la immunitat de les cèl·lules B augmentant la capacitat proliferativa dels LT-HSC i disminuint el nombre de cèl·lules positives SA-gal i els nivells de ROS.

S'ha trobat que el grau de dany oxidatiu augmenta amb l'edat en una varietat de cèl·lules i teixits. L'estrès oxidatiu és un determinant crític de l'autorenovació de l'HSC. La pèrdua de quiescència de LT‐ HSC es correlaciona amb freqüència amb l'augment de la ROS cel·lular, que s'associa negativament amb l'autorenovació de les HSC.26 Catalpol és un glucòsid iridoide, que s'ha trobat a l'arrel de R. glutinosa. Catalpol va mostrar una inhibició de l'estrès oxidatiu, dany a l'ADN i escurçament dels telòmers a través de la via PGC‐1/TERT en un estudi anterior.33 En el nostre estudi, el nivell de ROS es va reduir a les cèl·lules LSK del grup R. glutinosa en comparació amb el grup control. Així, R. glutinosa allarga la supervivència dels ratolins mitjançant la inhibició de l'estrès oxidatiu en els HSC.

FIGURA 6 Anàlisi citomètrica de flux del percentatge de cèl·lules immunitàries madures en sang perifèrica (PB), medul·la òssia (BM), melsa i tim. Els ratolins (de 20 mesos) van ser alimentats amb dietes complementades amb Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/d) durant 10 mesos (n=5/grup); el grup control va rebre una dieta estàndard. A, Anàlisi citomètrica de flux del percentatge de cèl·lules B (B220 plus ) en PB, BM i melsa. B, Anàlisi citomètrica de flux del percentatge de cèl·lules de monòcits i granulòcits (CD11b plus ) en PB i BM. C i D, Anàlisi citomètrica de flux del percentatge de cèl·lules CD4 plus i CD8 plus en PB, melsa i tim. Les dades representen la mitjana ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus també s'utilitza en la medicina tradicional xinesa per promoure la immunitat, reduir el sucre en la sang i promoure l'apoptosi de les cèl·lules tumorals, i també téantioxidantianti edatpropietats. En aquest estudi, vam trobar que la suplementació dietètica amb A. memranaceus durant 10 mesos no va tenir efectes evidents en comparació amb els observats en els ratolins control, mentre que el pes dels ratolins es va reduir als 20 mesos. Per tant, A. membranaceus pot ser inadequat per al tractament amb LT a ratolins alimentats.

En conclusió, els nostres resultats mostren que R. glutinosa pot allargar la vida útil dels ratolins mantenint la quiescència i millorant la funció dels HSC. A més, R. glutinosa pot disminuir els nivells intercel·lulars de ROS i el nombre de cèl·lules positives SA--gal i millorar la immunitat de les cèl·lules B.

AGRAÏMENTS

Aquest estudi va comptar amb el suport en part de la National Science Foundation for China (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016-12M-1-012) i el PUMC Youth Fund (2017310018).

CONFLICTES D'INTERÈS

Cap.

APORTACIONS DE L'AUTOR

Tots els autors de la llista compleixen els requisits d'autoria. CQ i LFZ van concebre i dissenyar els experiments. LB va realitzar els experiments i va escriure la prova principal del manuscrit. GYS va realitzar i analitzar les dades de FACS. YJY va dissenyar l'experiment sobre la medicina tradicional xinesa. WC va gestionar els ratolins. Tots els autors han llegit i aprovat el manuscrit.