Avaluació de l'efecte sobre la immunitat de la mucosa de la subunitat del virus de la diarrea viral bovina E2Fc i E2Ft

Resum:

Classificada com a malaltia infecciosa de classe B per l'Organització Mundial de Sanitat Animal (OIE), la diarrea viral bovina/malaltia de les mucoses és una malaltia aguda i altament contagiosa causada pel virus de la diarrea viral bovina (BVDV). Els endèmics esporàdics de BVDV sovint provoquen grans pèrdues econòmiques a les indústries lleteres i carn de boví. Per fer llum sobre la prevenció i el control del BVDV, vam desenvolupar dues noves vacunes de subunitats expressant proteïnes recombinants de fusió E2 del virus de la diarrea viral bovina (E2Fc i E2Ft) a través de cèl·lules HEK293 en suspensió. També vam avaluar els efectes immunitaris de les vacunes. Els resultats van mostrar que ambdues vacunes de subunitats van induir una intensa resposta immune de la mucosa en vedells. Mecànicament, E2Fc es va unir al receptor Fc (Fc RI) a les cèl·lules presentadores d'antigen (APC) i va promoure la secreció d'IgA, donant lloc a una resposta immune de cèl·lules T més forta (tipus Th1). El títol d'anticossos neutralitzants estimulat per la vacuna de la subunitat E2Fc immunitzada per la mucosa va arribar a 1:64, que era superior al de la vacuna de la subunitat E2Ft i al de la vacuna inactivada intramuscular. Les dues noves vacunes de subunitats per a la immunitat de la mucosa desenvolupades en aquest estudi, E2Fc i E2Ft, es poden utilitzar encara més com a noves estratègies per controlar el BVDV millorant la immunitat cel·lular i humoral.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Paraules clau: BVDV; vacuna de subunitat; vacunació de la mucosa; adjuvants moleculars; receptor Fc; ferritina

1. Introducció

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV), juntament amb el virus de la malaltia de la frontera (BDV) i el virus de la peste porcina (CSFV), pertany al gènere Pestivirus de la família Flaviviridae [1]. Una combinació d'infecció persistent (IP) i infecció citopàtica en vedells sovint provoca una malaltia greu de la mucosa, amb una mortalitat de fins a l'100% [2]. El BVDV es distribueix àmpliament al món, amb una taxa de positius anticossos relativament alta. A la Xina, els tipus predominants són 1B, 1M i 1Q del tipus -1 BVDV [3–5]. L'anàlisi filogenètica va revelar que el virus de la diarrea viral bovina tipus 1 es va importar a la Xina a la dècada de 1960 i que almenys vuit genotips de BVDV-1 estan en circulació a la Xina. Entre ells, 1B i 1m són els principals genotips [6]. Això és coherent amb la nostra investigació epidemiològica de BVDV al Tibet. El virió esfèric de BVDV té aproximadament 40-60 nm de diàmetre i està embolicat per una càpsula. El genoma d'ARN viral de cadena més única de BVDV té una longitud d'aproximadament 12,5 KB. La poliproteïna viral és posteriorment escindida per una combinació de proteases hoste i viral en quatre proteïnes estructurals (C, E0, E1, E2) i vuit no estructurals (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [7, 8]. BVDV-E2 posseeix una forta immunogenicitat i l'evidència ha demostrat que els anticossos neutralitzants (NAb) induïts en animals infectats es dirigeixen principalment a E2 [9]. Mentrestant, les vacunes multivalents de la subunitat E2 dirigides a les principals soques circulants de BVDV poden proporcionar una protecció parcial contra les soques homòlogues. Una vacuna recombinant de l'herpesvirus construïda amb la proteïna BVDV E2 i la proteïna D de l'herpesvirus boví 1 (BoHV-1) va induir respostes immunes específiques als dos virus a l'hoste després de la nebulització intranasal [10]. Per tant, podria ser una bona estratègia per controlar el BVDV emprant la proteïna immunodominant BVDV E2 com a vacuna de subunitat. La cavitat nasal és rica en limfòcits i cèl·lules presentadores d'antígens, proporciona un microambient adequat per a la immunització de la mucosa i protegeix les vacunes de proteïnes de ser desestabilitzades per àcids i àlcalis. A més, la immunoglobulina A (IgA) induïda per la vacuna intranasal i els limfòcits B i T de memòria resident a les vies respiratòries superiors són capaços de bloquejar eficaçment la replicació viral [11]. La immunització a través de la cavitat nasal no només indueix la immunitat de la mucosa sinó que també estimula les respostes immunitàries sistemàtiques, que exerceixen efectes de protecció immune. Estudis anteriors han trobat que els antígens es podrien lliurar completament a l'epiteli de la mucosa dirigint les vacunes de subunitats al receptor Fc neonatal (FcRn) de les cèl·lules M a l'epiteli de la mucosa, estimulant així de manera efectiva les respostes immunes específiques [12-14]. Els efectes d'immunització de l'esprai nasal es milloren significativament mitjançant la utilització d'una vacuna recombinant soluble formada per la fusió d'adjuvant molecular i antigen immune [15]. IgGFc interacciona amb FcRn a la superfície de les cèl·lules immunitàries per participar en el transport d'IgG a través de superfícies mucoses, millorant la immunogenicitat de les proteïnes fusionades amb Fc en mamífers [16]. Es va informar que les proteïnes de fusió IgGFc formaven dímers estables mitjançant enllaços disulfur a la regió de la frontissa Fc per augmentar la vida mitjana i l'estabilitat de les proteïnes recombinants, millorant per tant les respostes immunes cel·lulars, mucoses i humorals [17, 18]. Les noves vacunes mediades per l'IgGFc s'han aplicat amb èxit al virus de la grip A (HA-HuFc) [19] i al virus de la peste porcina (CSFV-E2Fc) [20].

Beneficis de cistanche tubulosa-enfortir el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

La modificació de la superfície adequada permet que les nanopartícules resideixin de manera estable al sistema circulatori de la sang [21]. Caracteritzada per una gran superfície i una estructura esfèrica buida, es va informar que la ferritina (Ft) forma nanopartícules de 24 polipèptids idèntics mitjançant l'autoassemblatge amb una varietat de proteïnes de fusió expressades, la qual cosa va promoure el reconeixement i l'absorció d'antigen per les cèl·lules presentadores d'antigen, de manera que induint una forta resposta immune [22,23]. La ferritina s'aplica àmpliament en el desenvolupament de vacunes. La integració covalent de l'antigen del domini d'unió al receptor (RBD) de la proteïna espiga del SARS-CoV-2 i la ferritina no hem de Helicobacter pylori autoassemblada dóna lloc a una potent producció d'anticossos neutralitzants. Les nanopartícules de proteïna de ferritina també tenen una forta capacitat per millorar l'estabilitat de l'antigen, superar les barreres biològiques i aconseguir un lliurament dirigit. Com que les nanovacunes poden ser capturades de manera eficient per cèl·lules dendrítiques i macròfags [24], les nanopartícules de ferritina són una plataforma nova i prometedora per al lliurament d'antigen. Actualment, les principals vacunes disponibles per al BVDV són les vacunes inactivades i les vacunes de subunitats, ambdues que requereixen una vacunació llarga i intensiva en mà d'obra mitjançant injecció intramuscular. Mentrestant, les vacunes inactivades produïdes a través de cèl·lules MDBK són propenses a induir pancitopènia neonatal bovina (BNP) [25]. Tanmateix, les vacunes de subunitats han mostrat perfils de seguretat superiors [26]. S'ha demostrat que la immunització intranasal dirigeix ​​els antígens al receptor Fc R, provocant respostes immunitàries mucoses i sistèmiques [15,16]. No obstant això, els efectes immunitaris de la immunització intranasal amb vacunes BVDV i l'eficàcia de BVDV-E2 combinada amb adjuvants moleculars (IgGFc i Ft) segueixen poc estudiats. Per tant, el desenvolupament de vacunes de mucoses amb proteïna BVDV-E2 per millorar la seva eficàcia immune és una prioritat en aquest camp. En l'estudi actual, es van generar vacunes de subunitats Fc o Ft fusionades amb proteïnes E2 a les cèl·lules HEK293. Les troballes van demostrar que la vacunació nasal amb la vacuna de la subunitat BVDV E2Fc era més eficaç que la vacunació nasal amb la vacuna de la subunitat E2Ft, donant suport encara més a les indicacions que la proteïna de fusió E2Fc és una opció de vacuna de subunitat més potent.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

2. Resultats

2.1. L'expressió de proteïnes recombinants en cèl·lules HEK293 suspeses

Els diagrames estructurals d'E2, E2Ft i E2Fc es mostren a la figura 1A. Els assajos d'immunofluorescència indirecta es van realitzar per primera vegada mitjançant l'anticòs monoclonal conservat (mAb) BVDVE2 per verificar la immunoexpressió de proteïnes de fusió recombinants. Les cèl·lules transfectades amb plasmidis que contenien gens E2, E2Ft o E2Fc emetien un senyal fluorescent, mentre que les cèl·lules tractades amb simulacres no mostraven cap senyal fluorescent (figura 1B). Això va indicar una forta expressió d'E2, E2Ft i E2Fc a les cèl·lules HEK293. Per determinar si aquestes proteïnes s'expressaven de manera secretora, es van recollir els sobrenedants de cèl·lules HEK293 transfectades amb plasmidis que contenien gens E2, E2Ft o E2Fc després de 6 dies. Els nivells d'immunoexpressió de cada proteïna es van analitzar mitjançant Western blot amb anticòs BVDV-E2. Els resultats van demostrar que les cèl·lules transfectades amb plasmidis que contenien gens d'E2, E2Ft i E2Fc expressaven proteïnes corresponents amb masses moleculars de 45 kDa, 60 kDa i 80 kDa, respectivament (figura 1C). Els resultats de la tinció de blau SDS-PAGE i Coomassie van mostrar que les bandes de cada mostra eren coherents amb els resultats de la taca (figura 1D). Per garantir l'especificitat i la precisió per detectar la immunoexpressió de proteïnes, primer es van realitzar assajos de preabsorció del mAb BVDV-E2 i seguits d'assajos de replicació viral i Western blot per testimoniar l'especificitat del mAb BVDV E2. Els resultats van revelar que l'anticossos només pot reaccionar a la proteïna BVDV-E2 (figura S1). En conjunt, l'evidència va demostrar que les proteïnes recombinants E2, E2Fc i E2Ft s'expressaven abundantment a les cèl·lules HEK293.

Figura 1. Immunoexpressió i identificació de proteïnes E2, E2Ft i E2Fc en cèl·lules HEK293. (A) Els diagrames de construcció de BVDV-E2, BVDV-E2Ft i BVDV-E2Fc. (B) Detecció de la immunoexpressió de proteïnes recombinants per IFA; 48 h després de transfectar-se amb E2, E2Fc o E2Ft, es van fixar cèl·lules HEK293 per a IFA. L'anticòs monoclonal BVDV E2 i la IgG anti-ratolí de cabra FITC es van aplicar com a anticossos primari i secundari, respectivament. El nucli es va tenyir amb DAPI (blau). La barra d'escala representa 20 µm. (C) Detecció de proteïnes recombinants purificades mitjançant Western blot. (D) Identificació de proteïnes recombinants purificades mitjançant SDS-PAGE.

2.2. Activació de l'APC-Fc RI per BVDV-E2Fc

El reconeixement d'antigen de BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) pels macròfags té un paper important en l'activació de la resposta immune. Per tal de detectar l'efecte d'activació de la proteïna de fusió sobre el sistema immunitari, es va verificar in vitro la funció de reconeixement i l'activitat fagocítica de la proteïna de fusió per part dels macròfags alveolars bovins (BAM). Els resultats van mostrar que el CD64 (Fc RI), detectat per marcadors d'anticossos IgG anti-conill marcats amb Cy3-(vermell), es va localitzar al citoplasma i a la membrana cel·lular dels macròfags bovins. E2Fc es va detectar mitjançant IgG anti-ratolí de cabra (fluorescència verda). Les imatges es van fusionar per a l'anàlisi de la co-localització de CD64 (Fc RI) i E2Fc en macròfags alveolars bovins (color groc; Figura 2A). En canvi, CD64 no es va co-localitzar amb E2 o E2Ft. Els resultats van mostrar que la translocació de la proteïna de fusió E2Fc a través de la barrera de la mucosa va ser mediada pel Fc RI.

Figura 2. Activació de l'APC-Fc RI per BVDV-E2Fc. (A) L'anàlisi de co-localització de CD64 (Fc RI) amb la proteïna E2Fc a BAM es va detectar mitjançant microscòpia confocal. CD64 (Fc RI) a BAM es va tacar amb IgG anti-conill de cabra marcada amb Cy3-com a anticossos primaris i secundaris, respectivament.

La fagocitosi, l'absorció de partícules pels macròfags, es va mesurar com la taxa de fagocitosi. Les taxes de fagocitosi de microesferes conjugades amb FITC, proteïna E2, E2Ft i E2Fc pels macròfags alveolars bovins van ser del 28, 9%, 55, 6%, 57, 1% i 65, 6%, respectivament. En altres paraules, la taxa de fagocitosi d'E2Fc era superior a la d'E2Ft, la qual cosa va demostrar a més que la captura d'antígens per part dels monòcits es completava mitjançant la unió d'un receptor específic a la seva superfície amb els lligands corresponents. Tanmateix, els macròfags alveolars bovins no tenien receptors per a les proteïnes E2 i E2Ft, i només eliminaven cossos estranys mitjançant la fagocitosi, que és el mètode de defensa més bàsic del cos (figura 2B).

2.3. Potents respostes immunitàries mucoses i humorals induïdes per E2Fc in vivo

El procediment d'immunització del vedell es mostra a la figura 3A. Els nivells d'IgA i SIgA produïts per vedells immunitzats amb la proteïna de fusió es van detectar mitjançant ELISA indirecte. Es van recollir mostres de sèrum, femta i mucosa nasal i es van detectar mitjançant un kit ELISA comercial. El grup immunitzat amb E2Fc va mostrar els nivells més alts d'IgA i SIgA en sèrum i mucosa, tant en animals immunitzats per via intramuscular com per mucosa (p <{4}}.01) (figura 3B, C). No es van observar diferències significatives en els nivells d'IgA entre el grup immunitzat amb E2- E{2- i el grup immunitzat amb E2Ft, però sí que es diferencien en els nivells de SIgA (p <0, 05). En conclusió, la proteïna de fusió E2Fc va ser capaç d'induir respostes immunitàries mucoses i humorals més potents que altres proteïnes.

2.4. E2Fc pot induir respostes immunitàries de cèl·lules T més fortes (tipus Th1) contra BVDV en comparació amb E2Ft in vivo

L'IFN de citocina de tipus Th{{{0}}expressat per les cèl·lules T i les cèl·lules NK media la immunitat cel·lular, que és essencial per a l'eliminació del virus. Per detectar la distribució de cèl·lules T CD4+ i CD8+ que expressen IFN en vedells, es van aïllar limfòcits de la PBMC dels vedells 35 dies després de la immunització. Els limfòcits es van estimular amb BVDV inactivat i, posteriorment, es va aplicar citometria de flux per identificar les cèl·lules T CD{4+ i CD8+ que secreten IFN- -. Els grups immunitzats per mucosa amb E2Fc i E2Ft van mostrar proporcions significativament més altes de cèl·lules T CD{4+ i CD8+ secretores d'IFN- -en comparació amb el grup E2. El grup immunitzat per la mucosa amb E2Fc tenia un nivell més alt de cèl·lules T CD8+ que secreten IFN- -CD3+ que el grup immunitzat amb BVDV inactivat (p < 0, 05) (figura 4). Tanmateix, no es va observar cap diferència significativa en les cèl·lules T CD4+ derivades de CD3+ que secreten IFN- -entre els grups amb E2Fc immunitzat per mucosa i amb BVDV inactivat. En resum, tant la injecció intramuscular com la immunització de la mucosa amb E2Fc indueixen respostes immunes de cèl·lules T més fortes (tipus Th1) contra el BVDV en comparació amb E2Ft.

Figura 3. Diagrama de flux dels experiments d'immunització de vedells i respostes immunitàries mucoses i humorals induïdes per E2Fc in vivo. (A) Diagrama de flux de l'experiment de construcció de vacunes de la subunitat BVDV i immunització de vedells. (B, C) La mesura dels nivells d'IgA secretora (B) i (C) en els hisops nasals, les femtes i les mostres de sèrum recollides el dia 14 després de la immunització secundària mitjançant ELISA. n=5, * p < 0.05 i ** p < 0,01

Figura 4. Respostes immunes de cèl·lules T contra el BVDV in vivo. Percentatge de cèl·lules T (A) CD4+ IFN- + i (B) cèl·lules T CD{8+ IFN{- + després de l'estimulació en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica bovina. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 i ** ** p <0,0001.

2.5. La immunització amb vacunes de subunitats recombinants augmenta el contingut de citocines de tipus Th1-

Per verificar l'efecte de la vacuna de subunitats recombinants sobre les respostes immunes cel·lulars, es van analitzar els nivells de proliferació de limfòcits i citocines a la sang perifèrica de vedells immunitzats. Primer, es van recollir anticoagulants dels vedells 49 dies després de la immunització. Els limfòcits van ser estimulats pel BVDV inactivat amb ultraviolats després de la separació i es van mesurar índexs correlacionats. En comparació amb el grup PBS, els índexs d'estimulació de limfòcits (SI) dels grups immunitzats amb les vacunes de subunitats (E2, E2Fc i E2Ft) es van augmentar en diferents graus, amb l'índex d'estimulació de limfòcits més alt (p < 0). 001) en els grups de vacunes immunitzats amb E2Fc i els inactivats (figura 5A). A més, es van aplicar kits comercials d'ELISA sandvitx d'anticossos dobles contra IFN-, IL-2 i IL{-4 per detectar nivells de citocines de tipus Th{1- i Th2-en el sang perifèrica de vedells immunitzats. En comparació amb els vedells tractats amb PBS, els nivells d'IFN i IL-2 expressats en vedells immunitzats eren significativament més alts que IL-4 als 49 dies després de la immunització. Els nivells d'IFN- eren més alts en el grup IN-E2Fc que en el grup de vacuna inactivada (p <0, 05), però no hi va haver cap diferència en IL{26}} i IL-4 entre IM-E2Fc i els grups de vacunes inactivats (figura 5B-D). Aquests resultats van suggerir que la vacuna de la subunitat IN-E2Fc va promoure significativament la resposta immune cel·lular de tipus Th1-en vedells.

Figura 5. L'augment del contingut de les citocines de tipus Th1-després de la immunització amb vacunes de subunitats recombinants. (A) La proliferació cel·lular de limfòcits de sang perifèrica de vedells després de la immunització 49 dies es va detectar mitjançant el kit d'assaig de proliferació de limfòcits. (B-D) Les citocines Th1 i Th2 en sobrenedants de limfòcits es van detectar mitjançant el kit ELISA de sandvitx de doble anticossos IFN-, IL-2, IL-4 boví. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 i *** p < 0.00

2.6. Els anticossos específics de BVDV es poden induir fortament per vacunes recombinants de subunitats E2Ft i E2Fc in vivo

Els anticossos específics de BVDV es van detectar mitjançant ELISA per explorar la resposta immune humoral induïda per les vacunes de la subunitat E2, E2Ft i E2Fc. Els anticossos específics de BVDV no es van poder detectar en tots els vedells abans de la immunització. Els nivells d'anticossos induïts per les vacunes de les subunitats E2Ft i E2Fc van ser significativament més alts que els del grup E2 21 dies després de l'inici (primera dosi) de la immunització (p < 0).00 1). Els nivells d'anticossos per a la immunitat de la mucosa als 35 dies (14 dies després de la segona dosi) i 49 dies (14 dies després de la tercera dosi) van diferir significativament entre els grups E2Ft i E2 (p <0, 05). A més, E2Fc era significativament superior a E2 (p <0, 001). El nivell d'anticossos del grup d'immunització de la mucosa (grups IN-E2Ft i IN-E2Fc) va ser superior al del grup d'injecció intramuscular (grups IM-E2Ft i IM-E2Fc) i el nivell d'anticossos del grup de vacuna inactivada no va ser significativament. diferent de la del grup IN-E2Fc (Figura 6). En conjunt, les vacunes recombinants de la subunitat E2Ft i E2Fc van ser capaços d'induir fortes respostes immunitàries humorals i la immunitat de la mucosa va ser superior a la de la injecció intramuscular, cosa que indica que les vacunes recombinants de la subunitat E2Fc i E2Ft eren altament antigèniques.

Figura 6. Detecció d'anticossos a les mostres de sèrum de vedells immunitzats mitjançant ELISA el dia 0, 21, 35 i 49 després de la immunització. n=5, * p < 0.05 i *** p < 0,001

2.7. Anticossos neutralitzants contra BVDV induïts per vacunes de subunitats recombinants in vivo

Es van recollir mostres de sang de la vena jugular dels vedells 0, 21, 35 i 49 dies després de la primera immunització. Les mostres de sèrum es van separar asèpticament i es van inactivar en un bany maria a 56 ◦ C durant 30 min. Es van realitzar assajos de neutralització per determinar els nivells d'anticossos en el sèrum separat. Els anticossos neutralitzants contra el BVDV es van detectar en grups immunitzats per mucoses amb vacunes de subunitats recombinants, amb el títol de l'anticossos neutralitzant E2Fc fins a 1:64. Això és comparable amb la vacuna inactivada i millor que les vacunes de subunitats recombinants E2Ft i E2Fc injectades per via intramuscular (figura 7).

Figura 7. Detecció d'anticossos neutralitzants a les mostres de sèrum de vedells immunitzats el dia 0, 21, 35 i 49 després de la immunització. Les mostres de sèrum inactivades es van diluir i es van preincubar amb 200 TCID50 BVDV XZ02 durant 1 h. Les mostres de sèrum es van afegir posteriorment a les cèl·lules en plaques de 96-pous i es van incubar durant 72 h. Es van utilitzar anticossos anti-E2 de conill i IgG anti-conill de cabra conjugada amb FITC com a anticossos primaris i secundaris. n=5, * p < 0,05 i ** p < 0,01

3. Discussió

S'ha informat que la proteïna E2 expressada a les cèl·lules de mamífer és més eficaç per neutralitzar la protecció contra el BVDV que la proteïna E2 obtinguda del sistema d'expressió d'insectes baculovirus (brE2) [27]. El cultiu en suspensió de cèl·lules de mamífer es caracteritza per un procés més senzill i un rendiment més elevat [28]. Les cèl·lules HEK293 suspeses són capaces de créixer en condicions sense sèrum, i el nombre de cèl·lules és moltes vegades més gran que el del cultiu adherent, que es pot utilitzar per a la producció a gran escala d'anticossos [29]. L'eficiència d'expressió de pcDNA3.1 combinada amb el sistema d'expressió transitòria de cèl·lules en suspensió eucariota aplicat en aquest estudi va ser relativament alta, i la proteïna recombinant es va poder recollir sis dies després de la transfecció, amb una concentració de fins a 30 mg·L -1, que va ser suficient per a la posterior aplicació animal.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

El virus de la diarrea vírica bovina envaeix principalment les vies respiratòries superiors i el tracte digestiu, que provoca rinorrea, tos, dificultat per respirar, elevació de la temperatura corporal i leucopènia, i el segueix virèmia un cop el virus entra a la sang. Per tant, la vacunació intranasal inhalada podria proporcionar una protecció més eficaç que les vacunes que s'entreguen directament als llocs d'infecció del virus. Recentment, s'ha demostrat que la immunització intranasal pot presentar antígens als receptors Fc R i provocar respostes immunitàries mucoses i sistemàtiques [16]. A més, la IgG1Fc bovina era capaç d'unir-se a la Fc R bovina, un receptor d'alta afinitat per a IgG [30]. Els nostres resultats van proporcionar proves que el Fc de la IgG1 bovina es podria unir amb Fc RI als macròfags alveolars bovins (BAM) per aconseguir el transport transmucosal. Això podria allargar la longevitat de la proteïna de fusió al cos i promoure la producció d'anticossos específics. Els nostres resultats van revelar que el nivell de SIgA induït per E2Fc immunitzat per la mucosa era significativament superior al de l'E2 immunitzat per la mucosa (p <0.{{30}}1). Tanmateix, només es va observar una petita diferència entre el grup E2Fc injectat per via intramuscular i el grup E2 immunitzat amb mucoses. Això pot ser causat pel fet que la mucosa de l'intestí prim i els ganglis limfàtics mesentèrics alliberarien una petita quantitat de SIgA en resposta a la injecció intramuscular amb E2Fc adjuvant amb 1313VG. Els nivells d'IFN provocats per la immunització de la mucosa amb E2Fc eren significativament més alts que els de la immunització de la mucosa amb E2 (p <0, 01), la immunització intramuscular amb E2Fc i la immunització de la mucosa amb E2Ft. Els nivells d'IL-2 provocats per la immunització de la mucosa amb E2Fc eren significativament més alts que els de la immunització de la mucosa amb E2 i la immunització intramuscular amb E2Ft (p <0, 01). En el següent pas, es van detectar els nivells globals d'anticossos després de la tercera immunització. Els resultats van mostrar que la immunització de la mucosa amb E2Fc va induir nivells significativament més alts d'anticossos globals en comparació amb la immunització de la mucosa amb E2 (p <0, 001), mentre que els nivells d'anticossos induïts per l'E2Fc injectat per via intramuscular i l'E2 immunitzat per la mucosa eren comparables a l'E2F injectat per via intramuscular. grup. Els efectes immunològics globals de la immunització de la mucosa de la vacuna de la subunitat E2Fc van ser superiors als de la immunització intramuscular. La immunització de la mucosa d'E2Fc no només va induir la secreció de SIgA, sinó que també va provocar una resposta immune cel·lular específica de tipus Th1- i una resposta immune humoral.

Es va informar que la glicoproteïna CSFV E2 que es mostra a la superfície dels nanocaus de ferritina va induir una expressió potent de les citocines immunes innates IL-4 i IFN- en conills [31]. També es va demostrar que una vacuna de nanopartícules desenvolupada unint ferritina autoensamblada de manera covalent al domini d'unió al receptor (RBD) del SARS-CoV -2 provocava una resposta immune humoral i cel·lular robusta [24]. La cavitat nasal és rica en teixit limfoide associat a la mucosa, i vam demostrar que els nivells de SIgA induïts per E2Ft immunitzat per la mucosa eren més alts que els d'E2 (p <0.05). Les cèl·lules T CD{4+ i CD{8+ eren significativament més altes en el grup E2Ft immunitzat per la mucosa que en el grup E2 (p <0, 01). Les cèl·lules T CD4+ i CD8+ tenen un paper vital en la defensa contra la infecció viral [32]. Els resultats de la prova de neutralització i de l'anàlisi d'anticossos també van mostrar que la immunització de la mucosa amb E2Ft era més efectiva que la immunització amb E2Ft i E2 intramusculars. Això es deu probablement al fet que el sistema de reconeixement i presentació d'antigen de l'organisme fagocitava eficaçment la ferritina (E2Ft) amb 24 polímers subunitats, donant lloc a una resposta d'anticossos sensible i eficaç in vivo. Els anticossos són secretats per les cèl·lules plasmàtiques, i els nivells d'anticossos neutralitzants són un indicador important per a la detecció d'efectes immunitaris. Quan la potència d'anticossos neutralitzants de la vacuna BVDV és superior a 1:24, indica que la vacuna és immunogènica [33].

En aquest estudi, es van realitzar assajos de neutralització per avaluar els nivells d'anticossos neutralitzants induïts per proteïnes recombinants E2. Per tant, es va recollir la sang venosa jugular dels vedells immunitzats per detectar el nivell d'anticossos IgG al sèrum. Els resultats van mostrar que tots els vedells immunitzats van produir diferents graus d'anticossos neutralitzants als 14 dies posteriors a la segona immunització. Els nivells d'anticossos neutralitzants en vedells del grup E2Fc immunitzat per la mucosa i del grup de vacuna inactivada van augmentar significativament i es van mantenir a 1:64 als 14 dies després de la tercera immunització (es van detectar títols d'anticossos neutralitzants fins a la sisena setmana). No obstant això, val la pena assenyalar que els nivells d'anticossos neutralitzants dels grups E2 i E2Ft immunitzats per la mucosa i els grups E2Fc i E2Ft immunitzats per via intramuscular es van mantenir entre 1:8 i 1:16. Deduïm que els antígens de la vacuna recombinant E2Fc són alliberats lentament pel receptor Fc, provocant, per tant, respostes immunitàries humorals i cel·lulars prolongades. En canvi, les altres quatre vacunes subunitats resideixen en breu al cos a causa de la manca d'un receptor corresponent. Per tant, pot ser necessària una vacuna de reforç o un canvi d'adjuvant per aconseguir els efectes immunològics esperats.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

4. Materials i Mètodes

4.1. Virus i cèl·lules

La soca BVDV XZ02 tipus 1b (número d'accés GenBank: MF278652) es va aïllar del Tibet i es va cultivar mitjançant cèl·lules renals bovines Madin-Darby (MDBK). El virus de la diarrea epidèmica porcina (PEDV) es va conservar al nostre laboratori. Les cèl·lules MDBK es van comprar a ATCC (ATCC-CCL-22) i es van mantenir al DMEM (núm. cat SH302403.01, HyClone, Xangai, Xina) i es van mantenir cèl·lules de macròfags alveolars bovins (BAM) al RPMI{{ {8}} (Cat NO. SH30027, Cytiva, Xangai, Xina); tots els medis contenien un 10% de sèrum de cavall inactivat per calor (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, EUA) i es van incubar a 37 ◦ C en una incubadora humidificada amb un 5% de CO2. Les cèl·lules HEK293 suspeses es van comprar a ATCC (ATCC CRL-1573) i es van cultivar en un medi KOP293 sense sèrum (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, Xina).

4.2. Anticossos i kits de prova

En aquest estudi es van utilitzar els següents anticossos i kits de prova: anticòs anti-BVDV E2 (núm. cat. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Regne Unit); Anticòs anti-ratolí de cabra HRP (núm. cat ab205719, Abcam, Cambridge, Regne Unit); Anticòs anti-ratolí de cabra Cy3-(Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, EUA); Anticòs anti-ratolí de cabra FITC (núm. cat ab150117, Abcam, Cambridge, Regne Unit); Anticòs CD64 (Fc RI) (núm. cat abs135850, Absin, Xangai, Xina); Anticòs IgG anti-ratolí de cabra Alexa Fluor® 488 (núm. cat ab150113, Abcam, Cambridge, Regne Unit); Anticòs Cy3-IgG anti-conill de cabra (núm. cat ab6939, Abcam, Cambridge, Regne Unit); Microesferes conjugades FITC (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, EUA); Anticòs FITC-CD4 (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA); Anticòs PE-CD8 (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA); Anticòs IFN- (Cat NO. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, EUA); Anticòs IgG anti-conill FITC-cabra (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, EUA). Els kits i reactius inclouen el kit de detecció d'anticossos BVDV-E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Xangai, Xina); Kit de detecció d'IgA (núm. cat 177090b, CAMILO, Nanjing, Xina); Kit de detecció SIgA (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Xina); Kit de detecció d'IFN (núm. cat 177020b, CAMILO, Nanjing, Xina); Kit de detecció IL-2 (núm. cat 177028b, CAMILO, Nanjing, Xina); Kit de detecció IL-4 (núm. cat 1770131b, CAMILO, Nanjing, Xina); Reactiu de transfecció TA-293 (núm. cat R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Xina); Medi de separació de limfòcits (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, EUA).

4.3. Construcció de plasmidis

L'E2 truncat (indicat com a E2 a continuació) es va generar eliminant la regió transmembrana d'E2 (número d'accés de la seqüència gènica: MF278652) mitjançant l'eina web TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ accedit el 12 gener de 2023) i afegint una etiqueta d'histidina a l'extrem C-terminal (figura 1A). La seqüència del gen es mostra al material suplementari S1. El plasmidi E2Fc es va construir afegint un fragment Fc que contenia la regió frontissa de la IgG1 bovina (número d'accés: x62916.1) a l'extrem C-terminal de l'E2 amb la posició ordinal de la regió frontissa de pèptids flexibles sintètics E2- -CH2-Domini CH3-6 × His [20]. La seqüència del gen es mostra al material suplementari S2. El plasmidi E2Ft es va construir enllaçant E2 amb la ferritina d'Helicobacter pylori (residus 5-167) mitjançant l'enllaç (Gly) 3Ser [34]. La seqüència del gen es mostra al material suplementari S3. El pèptid senyal IL-2 es va afegir a l'N-terminal d'E2, E2Fc i E2Ft per facilitar l'expressió secretora [35]. Els gens objectiu (E2, E2Ft i E2Fc) es van clonar a pcDNA3.1 amb BamHI i XhoI, respectivament.

4.4. Expressió i purificació de proteïnes

Aproximadament 10{{30}} mL de cèl·lules HEK293 en suspensió en l'etapa exponencial (aproximadament 2~4 × 106 cèl·lules/mL) es van transfectar amb els plasmidis corresponents. Breument, es van afegir 5 ml de KPM (tampó de transfecció) i 100 µg d'ADN plasmidi estèril a un tub de centrífuga estèril i 5 ml de KPM i 500 µL de TA-293 (núm. cat. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Xina). ) es van afegir reactius de transfecció a un altre tub de centrífuga estèril. A continuació, es va afegir un reactiu de transfecció diluït al plasmidi diluït i es va barrejar a fons. Després d'incubació durant 10 min a temperatura ambient, es va afegir un complex de reactiu de transfecció d'ADN a les cèl·lules, acompanyat de sacsejada. Les cèl·lules es van incubar en una incubadora humidificada a 37 ◦ C amb un 5% de CO2 a una velocitat de sacsejada de 140 rpm/min. Les cèl·lules es van recollir sis dies després de la transfecció per centrifugació durant 30 min a 12 000 rpm/min i es van filtrar amb un filtre de 0, 22 mm per eliminar les restes cel·lulars residuals. Les columnes de cromatografia d'afinitat de níquel (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, EUA) es van utilitzar per a la purificació d'afinitat marcada amb histidina (His) de proteïnes E2, E2Ft i E2Fc [36]. Breument, es van afegir mostres de 100 ml a columnes d'afinitat a una velocitat d'1 ml/min. Les columnes es van rentar posteriorment amb cinc volums de columna (CV) de tampó A (0, 1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) a una velocitat d'1 ml/min. Finalment, es van deixar fluir gradients de concentració d'imidazol (de 0 a 500 mM) per la columna a una velocitat d'1 ml/min per recollir el líquid corresponent al pic principal. Les concentracions de proteïnes es van quantificar amb un kit de detecció de proteïnes BCA. Les proteïnes recollides es van utilitzar més per a l'anàlisi de Western blot.

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

4.5. Western Blot

Les proteïnes es van separar mitjançant SDS-PAGE. Després de transferir-les a la membrana del filtre NC, les proteïnes es van bloquejar amb llet desnatada en pols al 2% durant la nit a 4 ◦ C i posteriorment es van incubar amb anticòs anti-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Regne Unit) durant 2 h a temperatura ambient. . Després de rentar-se tres vegades amb TBS-T, les membranes es van incubar amb anticossos HRP-cabra antiratolí (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, Regne Unit) durant 1 h a temperatura ambient. Després de rentar-se tres vegades amb TBS-T, es va utilitzar el sistema de quimioluminescència ECL per detectar la immunoexpressió de proteïnes.

4.6. Immunofluorescència indirecta

Per a la detecció per immunofluorescència de la immunoexpressió de proteïnes recombinants, les cèl·lules HEK293 es van transfectar amb plasmidis que expressaven E2, E2Ft i E2Fc; 48 h després de la transfecció, les cèl·lules es van fixar amb paraformaldehid durant 15 min. Després de rentar-se tres vegades amb PBS, les cèl·lules es van permeabilitzar amb 0,5% Trition-X100 durant 15 min. Després d'un rentat intensiu amb PBS, les cèl·lules es van bloquejar posteriorment amb un 2% de BSA i es van incubar amb un anticòs monoclonal BVDV E2 diluït 1:500 (preparat al nostre laboratori) a 37 ◦ C durant 2 h. Com a anticossos secundaris es van aplicar Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, EUA) o anticossos anti-ratolí de cabra conjugats amb FITC (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, Regne Unit). Els nuclis es van tenyir amb DAPI durant 10 min a temperatura ambient. Les proteïnes es van visualitzar mitjançant microscòpia confocal (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Alemanya) [37].

4.7. APC-Targeting de la proteïna de fusió recombinant E2Fc

Es va realitzar una anàlisi de colocalització d'immunofluorescència per confirmar la unió de la proteïna de fusió BVDV-E2Fc al Fc RI en macròfags alveolars bovins (BAM). Breument, es van afegir 3 µg d'E2, E2Ft o E2Fc purificats als macròfags alveolars bovins. Després d'incubació durant 12 h a 37 ◦C, les cèl·lules es van rentar amb 0,1% BSA en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i es van fixar amb metanol/acetona (1:1) a 20 ◦ C. Les cèl·lules es van permeabilitzar posteriorment amb 0, 5% de Trition-X100 durant 15 min i es van bloquejar amb un 2% de BSA a 37 ◦ C durant 2 h. A continuació, les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van incubar amb l'anticòs monoclonal BVDV E2 (font de ratolí; preparat al nostre laboratori) i l'anticòs policlonal CD64 boví (Fc RI) (Cat NO. abs135850, Absin, Xangai, Xina) durant 2 h. Les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van cobrir amb Alexa Fluor® 488 IgG anti-ratolí de cabra (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, Regne Unit) i anticòs IgG anti-conill de cabra marcat amb Cy3- (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, Regne Unit) durant 1 h a temperatura ambient. Els nuclis es van tenyir amb DAPI. Les imatges es van fotografiar mitjançant la colocalització d'immunofluorescència (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Alemanya).

4.8. Determinació de la velocitat fagocítica dels macròfags alveolars bovins

Per determinar els efectes de les proteïnes recombinants E2, E2Ft i E2Fc sobre la fagocitosi dels macròfags alveolars bovins (BAM), es van preincubar els macròfags alveolars bovins a una concentració d'1 × 106 cèl·lules/ml amb proteïnes recombinants. E2, E2Ft o E2Fc (totes les concentracions es van ajustar a 35 0 ng/mL) durant 4 h. Després de rentar tres vegades amb PBS, es van afegir 10 µl de microesferes conjugades amb FITC (núm. cat 17155, Polysciences, Warrington, PA, EUA) i 990 µl de medi RPMI-1640 a cada pou . Després de 2 h d'incubació, les cèl·lules es van rentar amb PBS per eliminar les microesferes extracel·lulars conjugades amb FITC. Els macròfags adherents es van digerir amb tripsina (Gibco) que contenia un 0, 05% d'EDTA i la digestió es va acabar amb el medi complet 1640 després de la digestió completa. A continuació, es van afegir cèl·lules a la capa superior de 10 ml de PBS amb 0, 45 g de glucosa i 0, 3 g de BSA, seguit de centrifugació en gradient a 400 × g durant 10 min. Les cèl·lules separades es van rentar dues vegades amb PBS i es van tornar a suspendre amb 800 µL de PBS. La intensitat de fluorescència a 488 nm es va determinar mitjançant el citòmetre de flux Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, EUA).

4.9. Preparació de vacunes i procediment d'immunització

L'HEK{{0}}expressat E2, E2Ft i E2Fc es va emulsionar amb l'adjuvant IMS 1313VG (Seppic, França) en proporcions iguals fins a una concentració final de proteïna de 200 µg/mL, i es va emmagatzemar a 4 ◦C després de la inspecció de qualitat. BVDV-E0 i BVDV-E2 anticossos negatius (núm. cat SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Xangai, Xina) 3-vellers d'un mes (n=35) van ser dividit en set grups iguals. Els vedells de quatre grups van ser immunitzats per la mucosa nasal (en) amb PBS, E2, E2Ft i E2Fc, respectivament. Els vedells dels tres grups restants es van injectar per via intramuscular (im) amb vacunes inactivades E2Ft, E2Fc i BVDV com a control positiu (núm. cat 202002003, Huaweit, Jiangsu, Xina). Els vedells es van vacunar els dies 1, 21 i 35 de l'experiment, i cada vedell es va inocular amb 1 ml de vacuna amb una concentració de proteïnes de 200 µg/mL. Es va recollir sang dels vedells els dies 1, 21, 35 i 49 de l'experiment per a altres índexs (figura 3A). Tots els protocols experimentals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de la Recerca de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat Agrícola de Huazhong, Hubei, Xina (núm. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Producció d'IgA a la femta i el sèrum

Es van recollir hisops nasals, femta i mostres de sèrum de vedells el dia 14 després de la immunització secundària. Les femtes fresques de vaca es van diluir en una suspensió fecal al 15% amb PBS, la suspensió es va centrifugar a 18, 000 × g a 4 ◦ C durant 30 min, i el sobrenedant es va recollir per al seu ús posterior. Els hisops nasals es van recollir fent girar el cotó estèril a la cavitat nasal de la vaca durant 6-8 voltes. Els hisops es van posar en un tub de PBS que contenia un 1% de penicil·lina-estreptomicina i es van barrejar àmpliament. Les mostres es van centrifugar a 18,000×g a 4 ◦C durant 10 min, i es va recollir el sobrenedant per al seu ús posterior. Les mostres de sang bovina es van recollir amb un tub anticoagulant que contenia àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA)--, i les mostres de sèrum es van obtenir centrifugant les mostres de sang a 4 ◦ C i 400 g durant 5 min. IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Xina) i SIgA es van detectar amb el kit ELISA (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, Xina) segons les instruccions del fabricant.

4.11. Anàlisi de citometria de flux

Les freqüències de les cèl·lules T CD{- -que produïen IFN{3+ CD{4+ i CD{3+ CD{8+ entre els limfòcits CD{3+ de la sang eren analitzat mitjançant citometria de flux. Les mostres es van recollir 14 dies després de la immunització de reforç [36]. Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) es van tornar a suspendre i es van diluir a 1 × 106 cèl·lules/ml amb un medi RPMI-1640 complet, es van estimular amb BVDV XZ02 inactivat per UV (MOI=0.1) i es van incubar a 37ºC. ◦C amb un 5% de CO2 durant 72 h. La concanavalina A (Con A) (5 µg/mL; Sigma) es va utilitzar com a control positiu. L'inhibidor del transport de proteïnes brefeldina A (BFA, 3 µg/mL, eBioscience) es va afegir a totes les mostres 12 h abans de la recol·lecció de cèl·lules per bloquejar la secreció d'IFN. Es va transferir una quantitat de 200 µL de la cèl·lula a tubs FCM i es va tacar amb l'anticòs CD4 marcat amb FITC (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) durant 30 min a 4 ◦ C a la foscor. Després de rentar-se tres vegades amb PBS, les cèl·lules es van incubar amb anticossos CD8 marcats amb R-PE (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA). Després de rentar-se tres vegades, les cèl·lules es van incubar amb l'anticòs anti-IFN boví del ratolí (Cat NO. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) durant 20 min a la foscor per a la tinció intracel·lular de citocines. Després del rentat, les cèl·lules es van tornar a suspendre en PBS que contenia 1% de FBS. La citometria de flux es va realitzar amb el citòmetre de flux FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) i les dades es van recollir i analitzar tal com es va descriure anteriorment [38].

4.12. Proliferació de limfòcits i detecció de citocines

Les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica anticoagulades (PBMC) de cada vedell es van aïllar mitjançant un medi de separació de limfòcits (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, EUA) el dia 49 després de la immunització. Els limfòcits de sang perifèrica bovina es van diluir amb el medi FBS 1640 al 10% fins a 1 × 106 cèl·lules/mL. A continuació, es van afegir 100 µL de cèl·lules diluïdes a cada pou d'una placa de pou 96- i es van estimular amb BVDV inactivat per UV, concanavalina (control positiu) o medi de cultiu (control negatiu), respectivament. Després de 72 h d'incubació a 37 ◦ C amb un 5% de CO2, es van afegir 30 µL de MTS a cada pou i les cèl·lules es van continuar cultivant a 37 ◦ C durant 1 h segons les instruccions del fabricant. L'absorbància a 492 nm es va mesurar amb un analitzador de microplaques automatitzat. El títol de proliferació de limfòcits de cada mostra es va determinar mitjançant l'índex d'estimulació (SI). SI calculada=(DO de la mostra-DO del control en blanc)/(DO de la mostra negativa-OD del control en blanc) [39]. L'interferó (IFN)-, la interleucina (IL)-2 i la interleucina (IL)-4 es van detectar mitjançant kits ELISA. Breument, les PBMC es van aïllar i es van diluir a 4 × 106 cèl·lules/ml amb medi RPMI 1640 que contenia un 10% de FBS i es van col·locar en plaques de cultiu de teixits 24-pous. Les cèl·lules es van estimular amb BVDV XZ02 inactivat (MOI=1) durant 48 h a 37 ◦ C, i es va recollir el sobrenedant posteriorment. L'IFN- (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, Xina), IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, Xina) i IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Els nivells de Nanjing, Xina) es van detectar mitjançant els kits ELISA corresponents d'acord amb les instruccions del fabricant. El contingut d'IFN-, IL-2 i IL{-4 de la mostra es va calcular mitjançant la corba estàndard.

4.13. Proves serològiques

Per detectar anticossos E2/E0, es van recollir mostres de sang de cada vedell els dies 0, 21, 35 i 49 després de la immunització. Les mostres de sèrum es van recollir centrifugant mostres de sang a 1000 × g durant 20 min. Les mostres de sèrum es van processar segons els requisits del kit de detecció d'anticossos BVDV E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Xangai, Xina). Les microplaques recobertes amb l'antigen BVBV E2 es van equilibrar durant 20 min a temperatura ambient. A continuació, es van afegir 50 µL de mostres de control negatiu, control positiu i sèrum a la microplaca, respectivament. Posteriorment es va afegir una quantitat de 50 µL d'anticossos de detecció marcats amb peroxidasa de rave picant (HRP) a la microplaca i es va incubar a 37 ◦ C durant 60 min. Després de rentar-se cinc vegades amb un tampó de rentat, es va afegir una solució cromogènica per mesurar l'absorbància del lector de microplaques a 450 nm per determinar el nivell d'anticossos E2 a cada grup d'immunització. Es va utilitzar el mètode de sèrum de dilució de virus fixa per detectar el nivell d'anticossos neutralitzants de les mostres de sèrum. Breument, les mostres de sèrum immune completament inactivades es van diluir de 2-1 a 2-12 i es van afegir 50 µL de sèrum a cada títol de dilució a les plaques de pous 96-. Posteriorment, es van afegir 50 µL de solució de virus diluïda que contenia el virus 200 TCID50- BVDV XZ02 a cada pou. Les plaques es van agitar i barrejar suaument. Després d'1 h d'incubació a 37 ◦C, es van afegir cèl·lules MDBK amb una concentració de 5 × 105 cèl·lules/ml a plaques de 96-pous i es van incubar a 37 ◦C en una incubadora humidificada amb un 5% de CO2 durant 72 h. Per detectar l'efecte neutralitzant de les mostres de sèrum, les cèl·lules es van tractar amb l'anticòs específic E2-com a anticòs primari (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Regne Unit) i la IgG anti-conill de cabra conjugada amb FITC com a secundari. anticòs, (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, EUA). Un senyal fluorescent verd típic indicava l'absència de neutralització. Les fotografies es van fer amb un microscopi de fluorescència (TE2000, Nikon, Tòquio, Japó). El títol de neutralització sèrica es va calcular segons el mètode Reed-Muench i es va determinar la màxima dilució del sèrum que podria inhibir completament la fluorescència com a títol de neutralització del sèrum.

4.14. Detecció d'especificitat de l'anticòs monoclonal BVDV E2

Primer es van realitzar assajos de pre-absorció d'anticossos monoclonals BVDV E2, seguits d'assaigs de replicació viral i Western blot per testimoniar l'especificitat de l'mAb BVDV E2. Per a l'assaig de replicació viral, es van preincubar 400 TCID50 de BVDV amb PBS i 100 µg o 200 µg d'E2 mAb a 37 ◦ C durant 1 h, respectivament. Després de la incubació, el BVDV pretractat es va inocular a cèl·lules MDBK i les cèl·lules es van cultivar a 37 ◦ C en una incubadora humidificada. Les cèl·lules es van recollir a 18 o 24 hpi (hora posterior a la infecció) i es va extreure l'ARN amb el reactiu TRIZOL. Es va realitzar RT-qPCR per determinar l'expressió relativa del gen BVDV E2. Per a l'assaig Western blot, el mAb E2 es va preincubar amb Tween20, proteïna PEDV S o proteïna BVDV E2 en TBS-T durant 2 h a 4 ◦ C, respectivament. El mAb E2 pretractat es va sotmetre a un assaig Western blot com a anticossos primari per detectar la reacció a la proteïna BVDV E2 o PEDV S.

4.15. Anàlisi estadística

Per a totes les anàlisis es va utilitzar el programa estadístic GraphPad Prism. La prova t sense aparellament de dues cues es va utilitzar per analitzar les dades i produir els valors p (*, p <0.05; **, p <0.{{ 8}}1; ***, p <0,001, **** p <0,0001). Llevat que s'indiqui el contrari, les dades es mostren com a mitjana ± SD.

5. Conclusions

En el nostre estudi, es van expressar tres proteïnes recombinants, BVDV-E2, BVDV-E2Ft i BVDV-E2Fc, i es van generar les vacunes de subunitats corresponents. Les proves in vivo van demostrar que la vacuna de la subunitat E2Fc era més eficaç que l'E2Ft i l'E2, tant en la immunització mucosa com intramuscular. Vam confirmar que els títols d'anticossos neutralitzants induïts per E2Fc i E2Ft immunitzats per la mucosa eren 1:64 i 1:16, respectivament, cosa que indica a més que E2Fc es va unir amb Fc RI en macròfags alveolars bovins per aconseguir el transport transmucosal. La vacunació de la mucosa de la vacuna multivalent de la subunitat E2Fc de la soca epidèmica principal de BVDV va millorar significativament els efectes immunitaris i és adequada per a un ús pràctic. El nostre estudi proporciona una solució a la vacunació convencional que requereix temps i mà d'obra mitjançant l'ús d'una vacuna de la mucosa. La proteïna BVDV E2 és un objectiu ideal per neutralitzar els anticossos, i s'espera que les proteïnes de fusió E2Fc i E2Ft construïdes en aquest estudi s'apliquin més com a vacunes de subunitats segures i efectives contra la infecció per BVDV.

Referències

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Programa d'eradicació del virus de la diarrea viral bovina a les Orcades 2001 a 2008. Vet. Rec. 2010, 167, 566–570. [Ref creuat]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Un pestivirus que indueix la tolerància de la resposta immune innata. Biologicals 2013, 41, 39–51. [Ref creuat]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Tipatge genètic i observació epidemiològica del virus de la diarrea viral bovina a la Xina occidental. Gens del virus 2011, 42, 204–207. [Ref creuat]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Caracterització genòmica d'un aïllat del virus de la diarrea viral bovina 1 del porc. Arc. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Sol, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; et al. Alta prevalença del virus de la diarrea viral bovina 1 en ramats de porcs xinesos. Veterinària. Microbiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Cançó, C.; Bao, J.; Du, J. Origen i transmissió del virus de la diarrea viral bovina tipus 1 a la Xina revelat per anàlisi filodinàmica. Res. Veterinària. Ciència. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. The Molecular Biology of Pestiviruses. Adv. Res del virus. 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. Recombinació d'ARN en pestivirus: les seqüències d'ARN cel·lular en genomes virals destaquen el paper dels factors hoste per a la persistència viral i la malaltia letal. ARN Biol. 2011, 8, 216–224. [Ref creuat]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Estructura cristal·lina de la glicoproteïna E2 del virus de la diarrea viral bovina. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2013, 110, 6805–6810. [Ref creuat]

10. Williams, LBA; Fregir, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP Una vacuna vectoritzada per herpesvirus boví recombinant-4 administrada mitjançant nebulització intranasal provoca títols d'anticossos neutralitzadors virals al bestiar. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [Ref creuat]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; et al. Respostes immunitàries humanes provocades per una vacuna intranasal inactivada contra la grip H5. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Característiques del teixit limfoide associat al nas (NALT) i capacitat d'absorció nasal en pollastre. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Ye, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Vacunació eficient de la mucosa mediada pel receptor Fc neonatal. Nat. Biotecnologia. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Vacunació de la mucosa per via intranasal. Teixit limfoide associat al nas (NALT) - Diferències d'estructura, funció i espècies. Vaccine 2015, 33, 4406–4413. [Ref creuat]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Una nova vacuna de proteïna de fusió RSV F-Fc redueix la lesió pulmonar induïda per la infecció per virus sincitial respiratori. Antivir. Res. 2019, 165, 11–22. [Ref creuat]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Resultats específics de l'isotip en l'orientació del receptor gamma Fc de PspA utilitzant proteïnes de fusió com a estratègia de vacunació contra la infecció per Streptococcus pneumoniae. Vaccine 2020, 38, 5634–5646. [Ref creuat]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Pleass, proteïnes de fusió RJ Fc: nous desenvolupaments i perspectives de futur. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [Ref creuat]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optimització en Fc per a la millora de l'estabilitat i la resistència a l'agregació. Curr. Farmàcia. Biotecnologia. 2016, 17, 1353–1359. [Ref creuat]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, CA; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, Nova Jersey; Barclay, WS; Jones, IM Immunització sense adjuvants amb proteïnes de fusió hemaglutinina-Fc com a aproximació a les vacunes contra la grip. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [Ref creuat]

20. Li, J.; Li, X.; Ma, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; et al. Vacunació eficient de la mucosa d'una proteïna de fusió E2-Fc del virus de la peste porcina clàssica nova mediada pel receptor Fc neonatal. Vaccine 2020, 38, 4574–4583. [Ref creuat]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritines com a nanoplataformes per a la imatge i el lliurament de fàrmacs. Opinió experta. Entrega de drogues. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. López-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Nanopartícules de proteïnes autoassemblants en el disseny de vacunes. Informàtica. Estructura. Biotecnologia. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jacob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Desenvolupament i aplicació de lligands d'afinitat sintètics per a la purificació d'antígens de la grip basats en ferritina. Bioconjugat Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Cançó, Z.; et al. Les vacunes de nanopartícules basades en el domini d'unió al receptor (RBD) i la repetició d'heptades (HR) del SARS-CoV-2 provoquen respostes immunitàries protectores robustes. Immunitat 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benedictus, L.; Bell, CR Els riscos de l'ús de línies cel·lulars al·logèniques per a la producció de vacunes: l'exemple de la pancitopènia neonatal bovina. Expert Rev. Vacunes 2017, 16, 65–71. [Ref creuat]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; et al. Seguretat i eficàcia d'una vacuna de subunitat de glicoproteïna E2 produïda en cèl·lules de mamífers per prevenir la infecció experimental amb el virus de la diarrea viral bovina en el bestiar. Veterinària. Res. Commun. 2012, 36, 157–164. [Ref creuat]

27. Tomàs, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME; Brownlie, J. Avaluació de l'eficàcia dels candidats a la vacuna de la subunitat E2 expressada per mamífers i baculovirus al virus de la diarrea viral bovina. Vaccine 2009, 27, 2387–2393. [Ref creuat]

28. Arena, TA; Danys, PD; Wong, AW Transfecció d'alt rendiment de cèl·lules HEK293 per a la producció de proteïnes transitòries. Mètodes Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hemaglutinina i neuraminidasa que contenen partícules semblants a virus produïdes en cultiu de suspensió HEK-293: un candidat eficaç a la vacuna contra la grip. Vaccine 2016, 34, 3371–3380. [Ref creuat]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Clonació molecular i identificació d'ADNc de longitud completa que codifica el receptor Fc d'alta afinitat per a IgG bovina (Fc gamma RI). Veterinària. Immunol. Immunopatol. 2000, 75, 151–159. [Ref creuat]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. Una nanoplataforma de ferritina autoensamblada per dissenyar una vacuna clàssica contra la peste porcina: obtenció d'anticossos neutralitzants potents. Vacunes 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MY; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; et al. La vacunació intranasal amb proteïna de fusió antigen recombinant-FLIPr sola indueix respostes d'anticossos sistèmiques de llarga durada i respostes àmplies de cèl·lules T. Davant. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Una nova vacuna dirigida a la subunitat de BVDV MHC-II indueix una resposta immunològica neutralitzant en conillets d'índies i bestiar. Transbord. Emerg. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. La immunització amb una fusió recombinant de virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina modificada GP5 i ferritina provoca una immunitat protectora millorada en porcs. Virologia 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, diputat; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; et al. Disseny d'una línia cel·lular CHO estable per a l'expressió d'un antigen de la vacuna MERS-coronavirus. Vacuna 2018, 36, 1853–1862. [Ref creuat]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; et al. Nanopartícules de ferritina dissenyades per al seguiment de la bioluminiscència del lliurament de nanomedicaments en càncer. Petita 2020, 16, e2001450. [Ref creuat]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. La glicoproteïna E2 del virus de la pesta porcina clàssica expressada per baculovirus indueix les respostes immunitàries protectores en els conills. Vaccine 2014, 32, 6607–6613. [Ref creuat]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; González, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Les respostes de cèl·lules T que produeixen IFN-gamma intestinal específics del virus induïdes per la infecció per rotavirus humà i les vacunes es correlacionen amb la protecció contra la diarrea del rotavirus en porcs gnotobiòtics. Vaccine 2008, 26, 3322–3331. [Ref creuat]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Resposta immune protectora millorada a la vacuna de la subunitat PCV2 mitjançant la coadministració d'IFN-gamma porcí recombinant en ratolins. Vaccine 2013, 31, 833–838. [Ref creuat]