Respostes de favonoides i fitoxilipina a les fulles de magrana (Punica Granatum L.) Part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

1: Els lípids es van convertir en àcids grassos lliures i fito-oxilipines en fulles de magrana tractades amb MeJA

A més dels flavonoides i antocians, els canvis en les molècules de lípids també es van fer evidents a les fulles de magrana a 72- h després de la inducció de MeJA (Fig. 5a). Dels 102 metabòlits acumulats de manera diferencial, 23 eren lípids, àcids grassos o fito-oxilipines (taula S6). En contrast amb l'isòmer 1 del monoacilglicerol (MAG) (18:4) que va mostrar una acumulació augmentada, set glicerolípids, inclòs MAG(18: 1)isòmer, MAG (18:3)isòmer4,galactosilmonoacilglicerol (DGMG) (18:2) isòmer, DGMG (18:2) isòmer 2, DGMG (18:2) isomer3,monogalactosilels isòmers monoacilglicerol (MGMG) (18:2) i l'isòmer MGMG (18:2)2, es van reduir en 3-5 plecs quan es va aplicar MeJA a les fulles (Fig.5a; Taula S6). Els fosfolípids LysoPC 18: 0 i 18:1 van mostrar un augment més del doble de les fulles tractades amb MeJA (taula S6).

Feu clic aquí per saber-ne més

L'aplicació exògena de MeJA va elevar els nivells de JA i isoleucina (JA-Ile) en 4.3-folds i 2.8-folds, respectivament, a les fulles de magrana (taula S6). Diversos no JAFito-oxilipines, inclosos els hidroperòxids d'àcids grassos, els àcids grassos epoxi, els àcids grassos hidroxi, els àcids grassos ceto iacetilènicàcids grassos, augmentat notablement a les fulles tractades amb MeJA (Fig.5a; Taula S6). També es va observar una acumulació millorada d'àcid punicic, un PUFA (18:3) que és abundant en l'oli de llavors de magrana, a les fulles tractades amb MeJA (taula S6).

Fig.3 Els nivells de flavonoides i antocianes es van alterarmetilaplicació de jasmonat (MeJA). Els metabòlits amb una acumulació augmentada, disminuïda i no canviada significativament (llindar doble) a les fulles de magrana tractades amb MeJA en comparació amb els controls tractats amb simulacre, collides a les 72- h posteriors al tractament, estan acolorides de verd, vermell, i blau, respectivament. Els intermedis de la via que no es van detectar a l'anàlisi d'espectrometria de masses en tàndem de cromatografia líquida-ionització electrospray es mostren en negre. Les fletxes discontínues indiquen diversos passos de reacció.

2: Caracterització bioquímica d'un candidat LOX per a la modificació d'àcids grassos en fulles de magrana tractades amb MeJA

Per explorar gens metabòlics que estan implicats en l'alternança del metabolisme dels àcids grassos cap a fito-oxilipines, es van analitzar transcriptomes de fulles de magrana tractades amb simulacre i MeJA per a DEG que s'anotaven com a lipases o LOX. Es van mostrar dos gens de lipasa Pgr004895 i Pgr001125. als transcriptomes del tractament 24- h post-MeJA i es va confirmar que l'expressió augmentava significativament mitjançant l'anàlisi qPCR en temps real (Fig. 5b). D'altra banda, la lipasa Pgr024441 va mostrar una expressió reduïda en l'anàlisi del transcriptoma, que no va ser recolzada pel resultat de qPCR en temps real (Fig. 5b). Curiosament, es va observar una expressió elevada de Pgr025417, una LOX putativa, en transcriptomes de fulles recollides a 2-h, 6-h,24-h i 72-h després del tractament amb MeJA (Fig. S1). L'anàlisi de qPCR en temps real va indicar a més una expressió contínuament augmentada de Pgr025417, que va de 4- a 20- vegades, a les fulles recollides de 2 a 72- h després del tractament amb MeJA (Fig. 5c).

Cistanche pot millorar la immunitat

Per determinar si el putatiu LOX (Pgr025417) estava implicat en l'augment de la producció de fitoxilipina a les fulles tractades amb MeJA, es va examinar la seva seqüència i activitat. Quan es va analitzar la seqüència d'aminoàcids de Pgr025417, es van trobar residus His, Asn i Ile que corresponen als que coordinaven l'àtom de ferro al lloc actiu de LOX de soja L-1(Minor et al.1996) a Pgr025417(Fig.6a). A més, es preveu que PgrO25417 estigui localitzat al cloroplast (probabilitat de probabilitat de 0,9096) amb el pèptid senyal escindit entre 64 i 65 aa (Fig. 6a). Entre els 11 LOX putatius (de 786 aa a 970 aa) identificats al genoma de la magrana anotat, 5 altres LOX: Pgr025413, Pgr025418, Pgr009839, Pgr016852 i Pgr0137852 es preveuen altres tipus de LOX i Pgr. (Fig.6b). Curiosament, mentre que Pgr008562, Pgr025678, Pgr018982 i PgrO18980 s'agrupen amb LOX dicotilèdons de tipus I. Pgr020032 està més llunyà relacionat amb els altres tipus ILOX (Fig.6b). Per determinar l'activitat enzimàtica de PgrO25417, es va analitzar la proteïna recombinant (906 aa, ~102 kDa; Fig.6c) utilitzant àcid linoleic com a substrat. Els productes oxidats d'àcid linoleic van ser produïts per Pgr025417, tal com es demostra amb una major absorció a 598 nm quan hi havia quantitats més grans de proteïna recombinant a la barreja de reacció (Fig. 6d).

3: Resposta transcripcional a l'aplicació exògena de MeJA en fulles de magrana

To understand whether the changes in HTs,flavonoids, lipids, fatty acids, and phyto-oxylipins are regulated transcription-ally, transcriptomes of MeJA-and mock-treated pomegranate leaves collected at2-h,6-h,24-h,and72-h were compared and identified 34 transcription factors(TFs) that showed differen-tial expression (Log,FCl>1, P ajustat<0.05)(table 1);31="" of="" these="" tfs="" also="" exhibited="" significantly="" changed="" expression="" by="" real-time="" qpcr="" analysis="" (fig.7).="" notably,="" a="" zinc-finger="" tf="" pgr009895="" showed="" increased="" expression="" at="" three="" out="" of="" the="" four="" time="" points(2-h,24-h,and="" 72-h)(fig.7a).the="" expression="" of="" pgr002863(pcf5-like),pgr002859(bzip1)and="" pgr006935(auxin="" response="" factor)was="" increased,="" and="" pgro11269="" (myb)="" decreased="" upon="" meja="" elicitation="" at="" two="" time="" points(fig.="" 7a,="" b).both="" pgro09366(anthocyanin="" regu-latory="" c1="" protein/myb)and="" pgro03015(myb)displayed="" increased="" expression="" at="" 6-h,="" but="" decreased="" expression="" at="" 72-h="" (fig.="" 7b).the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" enhanced="" at="" only="" one="" time="" point,including="" pgr009357(2-h),pgr027831="" (2-h),pgr023581(6-h),pgr009363(6-h),pgr000147="" (6-h),="" pgr021507(6-h),="" pgr021504(6-h),pgr020147(24-h),="" pgr025715(72-h),pgr023629(72-h),pgr015728(72-h),and="" pgr004388(72-h)(table="" 1;fig.7b,c).on="" the="" other="" hand,="" the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" suppressed="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leaves="" at="" one="" time="" point,="" including="" pgr013499="" (2-h),pgr023409="" (2-h),pgr017106(6-h),pgr010911(24-h),pgr017568(72-h),pgr024750(72-h),pgr004878(72-h)pgr002084(72-h),pgr008889(72-h),pgr004532(72-h),="" pgr020131="" (72-h),and="">

Per avaluar la regulació transcripcional dels gens candidats que poden funcionar en la modulació de les vies de flavonoides i àcids grassos/fito-oxilipina en la inducció de MeJA, es van predir llocs d'unió de TF a les regions promotores dels gens candidats mitjançant PlantRegMap (Tian et al.2020) amb Els TF identificats bioinformàticament a partir d'Eucalyptus Grandis, que està estretament relacionat amb la magrana a Myrtales (taula S7). Per a PgrO25417 (LOX putatiu), es van identificar 80 llocs d'unió de 65 TF, inclosos llocs d'unió abundants per a MYB (10 TFs.15 llocs) i WRKY (11 TFs, 18 llocs), però sense llocs d'unió per a TF de dit de zinc bipolar (taula S7). Com que CHS i CHI es situen al punt d'entrada de les vies biosintètiques de flavonoides i antocianines i van mostrar una expressió gènica reduïda en anàlisis de transcriptoma i qPCR en temps real (Figs.S1 i 4), els promotors de CHS (Pgr005566) i CHI (Pgr00596666) putatius. també es van analitzar els llocs putatius d'unió a TF. Per a CHS, hi ha 104 llocs d'unió de 76 TF, sent MYB (20 TF, 23 llocs) i LH (13 TF, 23 llocs) els TF més abundants (taula S7). Per a CHI, hi ha 93 llocs d'unió de 78 TF, sent bHLH (16 TF, 23 llocs) i WRKY (13 TF, 13 llocs) els TF més abundants (taula S7).

4: Discussió

Els canvis metabòlics únics induïts per l'aplicació exògena de MeJA suggereixen funcions dels HT, flavones/flavonols metilats i fito-oxilipines en la resposta de la magrana a MeJA.

MeJA té un paper demostrat a l'hora de provocar respostes d'estrès a les plantes (Cheong i Choi 2003). L'acumulació de dos intermedis de la via HT: glucogallina i penta-galloilglucosa a les fulles es va induir a 30- h després de l'aplicació de MeJA (Fig. 2b), cosa que suggereix que actuen en resposta a les tensions abiòtiques i biòtiques del medi ambient. Aquest resultat també corrobora la funció dels HT en la protecció de la magrana de les tensions abiòtiques en el teixit de les peles de fruita (Schwartz et al.2009; Habashi et al.2019). Corresponent a l'augment de l'acumulació de metabòlits HT, els gens de la via biosintètica shikimat i HT també van mostrar una expressió més gran (Fig.1). La caracterització bioquímica anterior de quatre isoformes SDH de vinyes (Vitis vinifera) va indicar que només VvSDH3 i VySDH4 podien produir àcid gàlic a partir de 3-deshidroshikimat (Bontpart et al.2016). Segons les nostres anàlisis de transcriptoma i qPCR en temps real, PgSDH3_1 i PgSDH3_2, homòlegs de WvSDH3, però no PgSDH4, un homòleg de VSDH4, van mostrar expressió induïda per MeJA (Figs. S1 i 1) . Aquesta observació suggereix que PgSDH3_1 i PgSDH3_2 probablement estan implicats en la síntesi de HT en resposta al tractament amb MeJA i a les tensions ambientals. A més, l'expressió millorada de PgUGT8423 i PgUGT84A24, que codifiquen enzims que catalitzen el pas compromès de la biosíntesi de HT, mitjançant l'aplicació de MeJA recolza encara més el paper dels HT en la resposta a l'estrès.

A les 72- h després de la inducció de MeJA, es va trobar una supressió general de flavonoides i antocianines a les fulles de magrana (Fig.3; Taula S6), cosa que és contrari a l'augment de l'acumulació d'aquests compostos observada en moltes altres plantes (Pandey et al. al.2016; De Geyter et al.2012; Shafiq et al.2011; Flores i Ruiz del Castillo 2014; Portu et al. 2015). No obstant això, tres flavones i flavanols metilats: di-O-metil quercetina, que venen 5-O-hexòsid, i crisoe-riol O-hexosil-O-hexòsid es van acumular a un nivell més gran malgrat la reducció dels precursors biosintètics no metilats. (Fig.3; Taula S6). La quercetina mono i di-O-metilada es secreta a partir de tricomes d'espècies solanàcies i s'ha proposat que actuï en la defensa de les plantes, possiblement d'una manera específica de l'espècie (Wollenweber i Dörr 1995); Roda et al.2003). També es va demostrar que els glucòsids del crisoberil, la luteolina i l'apigenina van dissuadir l'alimentació dels herbívors aquàtics sobre les fulles de Potamogeton lucens (pondweed) assajos in vitro (Erhard et al.2007). L'acumulació induïda de metilflavones/flavonolsen fulles de magrana suggereix que poden tenir un paper en la resposta a l'estrès provocada per MeJA i tenir implicacions per a la defensa contra ferides, patògens i herbívors en aquesta espècie d'arbre.

A més dels HT, els flavonoides i les antocianines, canvis metabòlics notables addicionals van incloure la mobilització d'àcids grassos lliures dels lípids i la biosíntesi de fitoxilipines a 72- h després de l'aplicació de MeJA (Fig. 5a). L'augment triple de l'àcid punicic (18:3, cis-9,trans{-11, cis{-13) després de la inducció de MeJA suggereix un paper potencial d'aquest PUFA amb un sistema de doble enllaç conjugat de tres en senyalització d'estrès o defensa química directa de les plantes de magrana (taula S6). La reducció concurrent de MAG, MGMG i DGMG també suggereix que l'àcid punic es podria conjugar habitualment amb aquests glicerolípids a les fulles de magrana (Fig. 5a; Taula S6). De les fito-oxilipines, l'augment de JA i JA-Ile a les fulles de magrana tractades amb MeJA podria ser degut a la desmetilació del MeJA aplicat de manera exògena per formar JA, que es converteix posteriorment en JA-Ile (Taula S6) (Stuhlfelder et al. .2004). També pot suggerir que MeJA pot regular directament la biosíntesi de JA i els seus derivats a la magrana. Els compostos volàtils derivats de les fitoxilipines estan implicats en la resposta de senyalització a atacs de ferides i patògens (Lim et al.2017). Estudis recents també han revelat els papers antimicrobians directes de les fito-oxilipines no JA, tot i que la base mecanicista d'aquestes funcions encara no està clara (Deboever et al. 2020). La producció induïble de Fito-oxilipines a la magrana corrobora les observacions anteriors en altres plantes. Queda per determinar si aquestes fito-oxilipines són biocides o funcionen per estimular una resposta immune innata a la magrana.

El metabolisme de flavonoides i antocians modificats, però no de fito-oxilipina, després de la inducció de MeJA està regulat almenys parcialment a nivell transcripcional.

En consonància amb la disminució general de l'acumulació de flavonoides i antocianines, els gens que codifiquen CHS i CHI, dos enzims situats al punt d'entrada de la biosíntesi de flavonoides i antocianines, van mostrar una expressió reduïda a les fulles tractades amb MeJA (Fig. 4). Curiosament, un homòleg de magrana (PgrO09366) de la proteïna reguladora de l'antocianina C1 MYB TF de blat de moro es va regular inicialment a les fulles tractades amb MeJA a 6- h, però després es va reduir a les fulles tractades amb MeJA a 72- h (Taula 1). ; Fig. 7b). Un homòleg de magrana (PgrO10911) del blat de moro MYB TF P es va reduir a les fulles tractades amb MeJA a 24- h (taula 1; Fig.7c). Tal com s'ha demostrat en estudis sobre blat de moro, el Cl activa diversos gens en la biosíntesi de flavonoides i antocianines, com ara CHS (C2), dihidroflavonol reductasa (A1), antocianidina 3-O-glucosiltransferasa (BZ1) i leucoantociani-din dioxigenasa ( A2)(Lesnick i Chandler 1998; Sainz et al.1997; Quattrocchio et al.1993). P, en canvi, controla l'expressió d'A1, però no de BZ1 (Grotewold et al.1994). En el blat de moro, C1 (MYB TF) treballa conjuntament amb R (bHLH TF) per regular l'expressió dels gens biosintètics de l'antocianina ( Mol et al.1998; Goff et al.1992). Pgr024750, un bHLH TF, també es va reduir a les fulles tractades amb MeJA a 72- h i podria ser un soci potencial de l'homòleg C1 de la magrana (taula 1; Fig.7c). A més, es van identificar llocs d'unió per a TFs MYB i bHLH a les regions promotores de CHS i CHI de magrana putatius mitjançant anàlisi bioinformàtica (taula S7). En conjunt, aquests resultats suggereixen que la disminució global de flavonoides i antocianes s'aconsegueix almenys parcialment mitjançant el control transcripcional dels gens biosintètics de primer pas.

Es va observar una reducció de diversos glicerolípids a les fulles tractades amb MeJA (Fig.5). Tanmateix, els homòlegs de magrana (números d'accés GenBank: XP_031374952 i XP_031374953) de l'Arabidopsis Wrinkled1 (ArWRI1), un TF de la família APETALA2 (AP2) que es considera un regulador "mestre" per a la biosíntesi de lípids vegetals. (Cernac i Benning 2004), expressat de manera similar en fulles tractades amb simulacre i MeJA (dades no mostrades). La caracterització funcional dels TF que responen a la inducció de MeJA (Taula 1; Fig. 7) podria revelar un paper regulador del metabolisme dels lípids a les fulles de magrana.

La LOX de magrana (Pgr025417) amb una expressió contínuament augmentada després de l'aplicació exògena de MeJA, va catalitzar l'oxidació d'àcids grassos i es va predir que es localitzés al cloroplast (Figs. 5c i 6). Per tant, Pgr025417 probablement està implicat en la biosíntesi de JA que té lloc en aquest compartiment subcel·lular (Fig.6). Dels 11 LOX putatius de la magrana, 5 són citosòlics (tipus I) i 6 són cloroplàstics (tipus II) (Fig.6b). Com que les fito-oxilipines no JA es sintetitzen al citosol (Ponce de Le6n et al.2015), un o més ILOX del tipus poden ser responsables de convertir PUFA en fito-oxilipines no JA després de la inducció de MeJA. Tenint en compte que la LOX (Pgr025417) amb un augment sostingut de l'expressió gènica a les fulles tractades amb MeJA es troba en un compartiment subcel·lular diferent de les fitoxilipines no JA, és probable que els enzims responsables de produir les fitoxilipines no JA induïdes per MeJA no modulada transcripcionalment.

L'aplicació exògena de MeJA va induir respostes transcripcionals a les fulles de magrana

Un estudi recent a Arabidopsis va revelar que una xarxa reguladora complexa enriquida amb MYC (bHLH), factor de resposta d'etilè (ERF) i TF de la família MYB va estar implicada en la resposta transcripcional induïda per MeJA primerenca (Hickman et al.2017). Homòlegs de magrana de TF ERF, inclosos Pgr013499(2-h), PgrO00147(6-h) i PgrO21504 (6-h), i homòlegs de TF MYB, inclòs PgrO09357 (2-h) ), Pgr009366(6-h), Pgr003015(6-h) i Pgr011269 (6-h), es trobaven entre els TF amb expressió variada en fulles tractades amb MeJA recollides en els primers moments. (Taula 1;Fig.7). Com s'ha comentat anteriorment, els homòlegs de magrana dels flavonoides de blat de moro i les proteïnes reguladores de l'antocianina C1 i P (MYB TFs) i un bHLH TF van mostrar una expressió reduïda i podrien controlar potencialment la reducció global de flavonoides i antocianines. A més, la regió promotora de LOX (PgrO25417) conté llocs d'unió de TF WRKY, MYB i bZIP (taula S7), cosa que suggereix que podrien estar regulats pels TF expressats de manera diferencial que pertanyen a aquestes famílies de TF en resposta a l'aplicació MeJA. .

5: L'expressió gènica comparada i l'anàlisi de metabòlits de fulles tractades amb MeJA facilita la interrogació de diverses vies fenòliques a les fruites

Comprendre les respostes metabòliques i transcripcionals de les fulles de magrana a l'aplicació de MeJA és clarament rellevant per millorar la salut i la productivitat de les plantes (és a dir, la producció de fruites). A més, l'expressió gènica comparativa i l'anàlisi de metabòlits de les fulles tractades amb MeJA també ofereixen una oportunitat per dilucidar la regulació de les vies d'HT, flavonoides i antocianines que estan presents tant als teixits de les fulles com dels fruits (Bar-Ya'akov et al.2019). ). Els compostos fenòlics HT, flavonoides i antocians contribueixen en gran mesura a les activitats beneficioses per a la salut humana dels fruits de la magrana, però el control de la seva producció i acumulació no s'ha explorat àmpliament a la magrana (per a flavonoides i antocianines) ni a cap espècie vegetal (per a HT). ). Per exemple, estudis anteriors sobre fruites de magrana aplicades amb MeJA van determinar els nivells d'antocianes i flavonoides en fruites després de la collita, sense investigar l'expressió de gens estructurals o reguladors relacionats amb aquests metabòlits (Koushesh Saba i Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). ). D'altra banda, l'estudi actual va descobrir TF (per exemple, TF MYB) que mostraven una expressió diferencial en fulles tractades amb MeJA i simulades amb patrons d'expressió similars als dels gens biosintètics HT, flavonoides i antocians (Fig.7; Taula 1) . Aquests TF estan potencialment implicats en la regulació de les vies de l'HT, els flavonoides i les antocianines, la qual cosa garanteix una investigació addicional en el futur.

Val la pena assenyalar que el nostre estudi va revelar un augment específic dels flavonoides metilats i una disminució general d'altres flavonoides en fulles de magrana tractades amb MeJA, cosa que suggereix un paper potencial dels flavonoides metilats en la defensa de les fulles de la magrana contra els patògens (Fig. 3; Taula S6). L'informe anterior sobre fruites de magrana tractades amb MeJA va mostrar una acumulació de flavonoides millorada, tot i que només es va determinar el contingut total de flavonoides sense quantificar les molècules de flavonoides individuals (Koushesh Saba i Zarei 2019). Com a tal, es necessita una anàlisi més profunda de les fruites de magrana tractades amb MeJA per permetre una comparació paral·lela dels canvis de flavonoides en els teixits de fulles i fruites. En contrast amb l'augment d'antocianes en fruites de magrana després de les aplicacions de MeJA (Garcia-Pastor et al.2020), el nivell d'antocians es va reduir a les fulles tractades amb MeJA (Fig.3; Taula S6). Aquesta disparitat podria ser deguda als diferents papers que juguen les antocianines en els teixits de fulles i fruites en atacs de patògens. De fet, l'acumulació diferencial d'antocianines a les fulles i els fruits subratlla la necessitat d'examinar les respostes de MeJA en diferents teixits de magrana.

6: Observacions finals

El nostre estudi va revelar canvis metabòlics únics en HT, flavonoides, antocianines i fito-oxilipines a les fulles de magrana provocats per l'aplicació exògena de MeJA. Les anàlisis bioquímiques i del transcriptoma van suggerir que, tot i que la supressió de múltiples flavonoides i antocianines es produeix almenys parcialment a nivell transcripcional, és probable que l'augment de la biosíntesi de fitoxilipines no JA no estigui controlada transcripcionalment. Aquest treball instiga més investigacions sobre l'arquitectura reguladora del metabolisme de l'HT, els flavonoides i les antocianines, l'orquestració de les respostes metabòliques de les fulles de magrana a l'aplicació de MeJA, així com el paper que tenen els metabòlits amb acumulació induïda en la senyalització i/o la defensa química directa.

Declaració de les contribucions de l'autor LC i LT van concebre l'estudi. LC i WS van realitzar experiments. LC, WS i LT van analitzar les dades. LC, WS i LT van escriure el manuscrit. Tots els autors van llegir i aprovar el manuscrit final.

Informació suplementària La versió en línia conté material suplementari disponible a https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9.

Agraïments Donem les gràcies als companys de l'Acadèmia de Ciències Agràries i Forestals de Panzhihua per proporcionar-nos les llavors de magrana utilitzades en aquest estudi. També agraïm al Dr. Binjie Ge del Jardí Botànic de Xangai Chenshan l'assistència en la identificació i enregistrament de l'exemplar del val.

Finançament Aquest treball va comptar amb el suport de la Comissió de Ciència i Tecnologia del municipi de Xangai amb la subvenció 14DZ2260400 i el Fons especial per a la investigació científica de l'Oficina administrativa de paisatgisme i aspecte de la ciutat de Xangai amb les subvencions G172403 i G182403.

Disponibilitat de dades i materials Els conjunts de dades del transcriptoma generats i analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a l'Arxiu de lectura de seqüències (SRA) a NCBI amb el número d'accés PRJNA600139., Els conjunts de dades de perfils de metabòlits generats i analitzats durant l'estudi actual s'inclouen en aquesta publicació. article i els seus fitxers complementaris.

Aquest article està extret de Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9